Pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleidergebaseerd next-generation sequencingplatform

Dit protocol presenteert de procedure van single cell amplification tot definitieve rapportagegegevens in de pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleider gebaseerd next generation sequencing platform. Deze procedure kan kijkers helpen een goed begrip te krijgen van de experimentele workflow van PGT-A-sequencing en deze techniek te repliceren in een diagnostisch laboratorium met een op halfgeleiders gebaseerd NGS-platform. Begin met het pipetteren van 25 microliter van de hele genoomversterkingsproducten en breng ze over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter die vooraf is geladen met 25 microliter nucleasevrij water.

Vortex en meng de DNA-zuiveringsparels. Aliquot 50 microliter van deze oplossing in elke monsterbuis. Vortex en centrifuge kort gedurende vijf seconden.

Zet de buis gedurende vijf minuten op kamertemperatuur voor het DNA-bindingsproces. Plaats de centrifugebuis van 1,5 milliliter in een magnetisch rek. Wacht vervolgens tot alle magnetische kralen worden aangetrokken door de zijwand van de buis.

Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter. Vermijd het pipetteren van de kralen. Volgens het oorspronkelijke monstervolume.

Pipet 30 microliter magnetische kralen, vortex en centrifuge kort gedurende vijf seconden. Zet de buis gedurende vijf minuten op kamertemperatuur voor het DNA-bindingsproces. Plaats de centrifugebuizen van 1,5 millimeter in het magnetische rek.

Wacht vervolgens tot alle magnetische kralen worden aangetrokken door de zijwand van de buis. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg. Vermijd het pipetteren van de kralen.

Pipet 300 microliter 70% ethanol in de centrifugebuis van 1,5 milliliter. Draai de buis vervolgens twee keer voorzichtig in een hoek van 180 graden en beweeg de kralen langs de buiswand voor een grondige wasbeurt. Pipetteer en gooi het supernatant weg.

Vermijd het pipetteren van de kralen. Herhaal de wasprocedure eenmaal. Plaats een nieuwe versterkingsplaat in het systeem zodra het reinigingsprogramma is voltooid.

Plaats de opvangbuizen, elk voorgevuld met 150 microliter breekoplossing twee in de rotor en plaats de brug vervolgens op de opvangbuizen. Voeg de reactieolie toe aan de helft van de buis en de emulgatorbreekoplossing aan een derde van de buis. Plaats een nieuw filter voor sjabloonvoorbereiding op een buizenrek met het monsterportaal naar boven geplaatst.

Vortex de oplossing gedurende vijf seconden en centrifugeer kort gedurende vijf seconden. Breng de oplossing vervolgens over in het monsterportaal van het filter na drie keer 800 microliter te hebben gepipetteerd. Centrifugeer de buis om de bubbels vóór de laatste injectie te verminderen.

Vermijd het injecteren van lucht in het filter. Injecteer 200 microliter reactieolie twee, na de gemengde oplossing. Draai het monsterportaal van het filter naar beneden en vervang de wasaanpassing door het filter.

Steek de monsternaald in het middelste gat van het rotordeksel en druk de naald vervolgens naar beneden. Klik op de knop Uitvoeren op het scherm en kies het programma op basis van de bijbehorende kit. Selecteer vervolgens Assisted om alle stappen te controleren.

Klik op Volgende totdat de run is gestart. De run duurt ongeveer 4,5 uur. Selecteer Volgende wanneer het programma is voltooid.

Het systeem start een centrifugatieproces van 10 minuten. Klik na het centrifugeren op de knop Deksel openen en verplaats de opvangbuizen naar rekken. Als de procedure niet binnen 15 minuten naar de volgende stap gaat, drukt u op de laatste spin om opnieuw te centrifugeren.

Verwijder het supernatant in de opvangbuis en laat 100 microliter oplossing in de buis achter. Meng het resterende monster door pipetteer en breng het monster over naar de nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter met de aanduiding OT. Wanneer u het supernatant pipettert, vermijd dan het aanraken van de onderkant van de buis langs de zijkanten. Pipetteer 100 microliter nucleasevrij water in elke opvangbuis en breng de oplossing over naar de OT-buis gewassen door herhaaldelijk pipetteren.

Voeg 600 microliter nucleasevrij water toe aan de OT-buis om het totale volume van één milliliter te vormen. Vortex gedurende 30 seconden in centrifuge op 15, 500 maal G gedurende acht minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en laat 100 microliter oplossing achter in de OT-buis.

Gebruik de punt om de olielaag volledig weg te gooien. Voeg 900 microliter nucleasevrij water toe, vortex gedurende 30 seconden en centrifugeer op 15, 500 keer G gedurende acht minuten. Verwijder het supernatant totdat er 20 microliter van de oplossing overblijft en voeg de sjabloon resuspending-oplossing toe om het volume van 100 microliter te vormen.

Vervolgens vortex gedurende 30 seconden en kort centrifugeren gedurende twee seconden. Ga verder met de volgende stap binnen 12 uur na monsterverwerking Laad 100 microliter van de verdunde bibliotheek, 130 microliter C1-kralen, 300 microliter drie x sjabloonwasoplossing en 300 microliter van de smeltoplossing op de acht putstrips. Installeer de acht putstrips op de verrijkingsmodule, laad de pipetteerpunt en zet de centrifugebuis van 200 microliter in de verzamelpositie.

Klik op Start om het programma uit te voeren. Pipetteer 55 microliter van de monsteroplossing en injecteer deze in het monstergat van de chip. Plaats de chip op de centrifuge.

Houd de inkeping naar buiten en het monsterportaal naar binnen. Balanceer het vervolgens met een andere gebruikte chip en centrifugeer gedurende 10 minuten. Bereid de laadoplossing voor zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Blaas 100 microliter lucht in de schuimoplossing. Pipetteer de oplossing herhaaldelijk totdat de bubbels zich in een dichte, schuimende toestand bevinden en houd het schuimvolume op ongeveer 250 microliter. Plaats de chip na de centrifuge op de bank.

Injecteer 100 microliter schuim in het monstergat en verwijder de geëxtrudeerde oplossing in het buitenportaal. Centrifugeer de chip vervolgens kort gedurende 30 seconden. Herhaal dit proces één keer.

Injecteer tweemaal 100 microliter met 50% wasbuffer en verwijder de geëxtrudeerde oplossing na elke injectie in het buitenportaal. Injecteer vervolgens driemaal 100 microliter met 50% gloeibuffer en verwijder de geëxtrudeerde oplossing na elke injectie in het buitenportaal. Injecteer 65 microliter op 50% enzymreactiebuffer, vermijd bubbels en verwijder de geëxtrudeerde oplossing in het buitenportaal.

Stabiliseer de geladen chip gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en installeer de chip op het sequencerchipportaal. Kies het geplande programma controleer de informatie en start de run. De representatieve run verkreeg in totaal 17,6 gigabyte gegevens en de totale belastingssnelheid van het ionenboldeeltje was 88% in de totale putten van de chip.

De heatmap bevestigde een gelijkmatige monsterbelasting op het totale chipoppervlak. 77% van de totale reads waren bruikbaar. Alle putten geladen met ISP vertoonden 100% sjablonenverrijking waarin 78% klonaal was.

Van alle klonale sjablonen werd 97% gekwalificeerd als de uiteindelijke bibliotheek. De gemiddelde lengte van de aflezing was 177 basenparen, terwijl de mediaan en modus respectievelijk 176 en 174 basenparen waren. Piektellingen van thymine, cytosine en adenine in de sjablonen waren ongeveer 76 over de gekwalificeerde cutoff-lijn van 50.

In alle adresseerbare putten met live ISP's kwalificeerde 99,5% zich als de geconstrueerde bibliotheek en 20% van de polyklonale en lage kwaliteit bibliotheken werden uitgefilterd, terwijl 76,6% van de ISP's gekwalificeerd was voor verdere analyse. Het resultaat van de afwijking van het aantal kopieën van een enkel monster toonde een 182,16 megabase paren mozaïek trisomie van P 16,3 tot Q 35,2 op chromosoom vier en een 33 punts 13 megabase paren monosomie segment van Q 11,1 tot Q 13,33 op chromosoom 22. Bij het selecteren van fragmenten moeten de tijdsintervallen tussen de stappen worden aangepast aan de grootte van de monsters in dezelfde batch om over- en uitval van blootstelling voor voor- en achterkantmonsters te voorkomen.