Name: Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Leer driedimensionale reconstructie van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met seriële sectie elektronenmicroscopie. Deze flexibele methode biedt uitstekende resolutie en is toegankelijk voor laboratoria zonder gespecialiseerde microscopen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro en Ania Straatman-Iwanowska voor de deskundige technische bijstand. We bedanken ook Stefan lableden en Ian J. White voor de nuttige discussies. J.J.B. wordt ondersteund door MRC-financiering aan het MRC Laboratory of Molecular Cell Biology aan de UCL, toekenningscode MC_U12266B. C.J.S. wordt ondersteund door MRC-financiering aan het MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit aan de UCL, toekenningscode MC_UU_00012/6. P.G. wordt gefinancierd door de European Research Council, subsidiecode ERC-2013-StG-337057.

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Een toegankelijke vEM-techniek voor het visualiseren van organelstructuur en interacties in 3D wordt in dit protocol beschreven. De morfologie van interorganelle contacten in hepatocyten wordt hier gepresenteerd als een casestudy. Deze aanpak is echter ook toegepast om een verscheidenheid aan andere monsters en onderzoeksgebieden te onderzoeken, waaronder Schwann cel-endotheelinteracties in perifere zenuwen45, Weibel Palade Body biogenese in endotheelcellen46, ladingsecreti...

Sinds hun uitvinding in de jaren 1930 hebben elektronenmicroscopen onderzoekers in staat gesteld om de structurele componenten van cellen en weefsels te visualiseren 1,2. De meeste onderzoeken hebben 2D-informatie opgeleverd, omdat het bouwen van 3D-modellen nauwgezette seriële sectieverzameling, handmatige fotografie, negatieve verwerking, handmatige tracering en het maken en assembleren van 3D-modellen van glasplaten, plastic of piepschuim 3,4 vereist. Bijna 70 jaar later zijn er aanzienlijke vorderingen gemaakt in tal van aspecten van het proces, van microscoopprestaties, seriële sectieverzameling, geautomatiseerde digitale beeldvorming, geavanceerde software en hardware voor 3D-reconstructie, visualisatie en analyse tot alternatieve benaderingen voor wat nu collectief volume EM (vEM) wordt genoemd. Deze vEM-technieken worden over het algemeen beschouwd als het leveren van 3D-ultrastructurele informatie met nanometerresoluties op micronschaal en omvatten transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en nieuwere scanning elektronenmicroscopie (SEM) technieken; zie beoordelingen 5,6,7,8.
Gefocusseerde ionenbundel SEM (FIB-SEM) maakt bijvoorbeeld gebruik van een gerichte ionenbundel in een SEM om het oppervlak van het blok weg te frezen tussen sequentiële SEM-beeldvormingsscans van het oppervlak van het blok, waardoor het herhaalde geautomatiseerd frezen / beeldvormen van een monster mogelijk is en een 3D-dataset kan worden opgebouwd voor reconstructie 9,10. Serial block face SEM (SBF-SEM) daarentegen gebruikt een ultramicrotoom in de SEM om materiaal van het blokvlak te verwijderen voorafgaand aan beeldvorming 11,12, terwijl arraytomografie een niet-destructief proces is dat de verzameling van seriële secties vereist, op coverslips, wafers of tape, voordat een geautomatiseerde workflow wordt opgezet voor het in beeld brengen van het gebied van belang in sequentiële secties in de SEM om de 3D-dataset te genereren13 . Net als bij arraytomografie vereist seriële sectie TEM (ssTEM) dat fysieke secties worden verzameld voorafgaand aan beeldvorming; deze secties worden echter verzameld op TEM-rasters en afgebeeld in een TEM 14,15,16. ssTEM kan worden uitgebreid door tilttomografie 17,18,19 uit te voeren. Seriële tilttomografie biedt de beste resolutie in x, y en z, en hoewel het is gebruikt om hele cellen20 te reconstrueren, is het redelijk uitdagend. Dit protocol richt zich op de praktische aspecten van ssTEM als de meest toegankelijke vEM-techniek die beschikbaar is voor veel EM-laboratoria die momenteel misschien geen toegang hebben tot gespecialiseerde sectioning- of vEM-instrumenten, maar baat zouden hebben bij het genereren van 3D vEM-gegevens.
Seriële ultramicrotomie voor 3D-reconstructie werd eerder als een uitdaging beschouwd. Het was moeilijk om rechte linten van gelijkmatige sectiedikte te knippen, linten van de juiste grootte, in de juiste volgorde, op roosters te plaatsen en op te pakken met voldoende ondersteuning, maar zonder rasterstaven die interessante gebieden verduisteren, en vooral, zonder secties te verliezen, omdat een onvolledige reeks volledige 3D-reconstructie21 kan voorkomen. Verbeteringen aan commerciële ultramicrotomen, diamantslijp- en trimmessen22,23, elektron lucent-ondersteuningsfilms op rasters21,24 en lijmen voor het helpen van sectiehechting en lintconservering13,21 zijn echter slechts enkele van de incrementele vooruitgangen in de loop der jaren die de techniek in veel laboratoria meer routine hebben gemaakt. Zodra seriële secties zijn verzameld, is seriële beeldvorming in TEM eenvoudig en kan EM-afbeeldingen worden geleverd met subnanometer px-formaten in x en y, waardoor hoge resolutie ondervraging van de subcellulaire structuren mogelijk is - een potentiële vereiste voor veel onderzoeksvragen. De hier gepresenteerde casestudy toont het gebruik van ssTEM en 3D-reconstructie in de studie van endoplasmatisch reticulum (ER)-organelcontacten in leverhepatocyten, waar ER-organelcontacten voor het eerst werden waargenomen25,26.
Hoewel het aaneengesloten ligt met de nucleaire envelop, maakt het ER ook nauwe contacten met tal van andere celorganellen, waaronder lysosomen, mitochondriën, lipidedruppels en het plasmamembraan27. ER-organelcontacten zijn betrokken bij lipidemetabolisme28, fosfoinositide en calciumsignalering29, autofagieregulatie en stressrespons30,31. De ER-organelcontacten en andere interorganelle-contacten zijn zeer dynamische structuren die reageren op cellulaire metabole behoeften en extracellulaire signalen. Het is aangetoond dat ze morfologisch variëren in hun grootte en vorm en de afstanden tussen organelmembranen 32,33. Er wordt gedacht dat deze ultrastructurele verschillen waarschijnlijk hun verschillende eiwit / lipidesamenstellingen en functie weerspiegelen34,35. Het is echter nog steeds een uitdagende taak om interorganelle-contacten te definiëren en te analyseren36. Daarom is een betrouwbaar maar eenvoudig protocol voor het onderzoeken en karakteriseren van interorganelle contacten vereist voor verder onderzoek.
Omdat ER-organelcontacten kunnen variëren van 10 tot 30 nm in membraan-tot-membraanscheiding, is de gouden standaard voor identificatie historisch gezien TEM geweest. Thin-section TEM heeft specifieke subdomeinlokalisatie onthuld voor residente ER-eiwitten bij verschillende membraancontacten37. Traditioneel heeft dit ER-organelcontacten met nm-resolutie onthuld, maar vaak alleen een 2D-weergave van deze interacties gepresenteerd. VEM-benaderingen onthullen echter de ultrastructurele presentatie en context van deze contactsites in 3D, waardoor volledige reconstructie van contacten en nauwkeurigere classificatie van contacten (punt versus buisvormig versus cisteraalachtig) en kwantificering38,39 mogelijk is. Naast het feit dat het het eerste celtype is waar ER-organelcontacten25,26 werden waargenomen, hebben hepatocyten een uitgebreid systeem van andere interorganelle contacten die een vitale rol spelen in hun architectuur en fysiologie28,40. Een grondige morfologische karakterisering van ER-organel en andere interorganellecontacten in hepatocyten ontbreekt echter nog steeds. Dienovereenkomstig is de manier waarop interorganelle-contacten zich vormen en hermodelleren tijdens regeneratie en reparatie van bijzonder belang voor de hepatocytenbiologie en de leverfunctie.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m spuitfilter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium bakjes</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3912</td><td></td></tr><tr><td>Amira v6</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C/4960/PB08</td><td></td></tr><tr><td>DDSA/Dodecenyl succinaat-anhydride</td><td>TAAB</td><td>T027</td><td>Epon ingrediënt</td></tr><tr><td>Diamantmes</td><td>DiaTOME</td><td>ultra 45&deg;</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) fenol</td><td>TAAB</td><td>D032</td><td>Epon ingrediënt</td></tr><tr><td>Dumont Pincet N5</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5293</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr><tr><td>Fiji TrakEM2-plug-in</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr><tr><td>Formaldehyde 36% oplossing</td><td>TAAB</td><td>F003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar-gecoat slot raster</td><td>Homemade</td><td></td><td>Alternatief: EMS diasum (FF2010-Cu)</td></tr><tr><td>Glasfles met applicatorstaaf</td><td>Medisca</td><td>6258</td><td></td></tr><tr><td>Glazen flacons</td><td>Fisher Scientific</td><td>15364769</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde 25% oplossing</td><td>TAAB</td><td>G011</td><td></td></tr><tr><td>MNA/Methyl nadic anhydride</td><td>TAAB</td><td>M011</td><td>Epon ingrediënt</td></tr><tr><td>Osmiumtetraoxide 2% oplossing</td><td>TAAB</td><td>O005</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Propyleenoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0050/PB08</td><td></td></tr><tr><td>Herbruikbaar kleefstof</td><td>Blue Tack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Lead Citraat</td><td>TAAB</td><td>L037</td><td>Sectiekleuring</td></tr><tr><td>Natriumcacodylaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0250</td><td>om 0,1 M Caco-buffer te maken</td></tr><tr><td>Superlijm</td><td>RS Components</td><td>918-6872</td><td>Cyanoacrylaatlijm, Stap 1.3</td></tr><tr><td>TAAB 812 Hars</td><td>TAAB</td><td>T023</td><td>Epon ingrediënt</td></tr><tr><td>Tanninezuur</td><td>TAAB</td><td>T046</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tweedelige epoxyhars</td><td>RS Components</td><td>132-605</td><td>Alternatief: Stap 2.13</td></tr><tr><td>Ultramicrotoom</td><td>Leica</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>Vibratiesnijmachine</td><td>Leica</td><td></td><td>100 &micro;m dikke plakken, 0,16 mm/s snijden bij 1 mm amplitude.</td></tr><tr><td>Weldwood Original Contact cement</td><td>DAP</td><td>107</td><td>Contactlijm: Stap 3.1.4</td></tr></tbody></table>

driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmissie-elektronenmicroscopie wordt al lang beschouwd als de gouden standaard voor de visualisatie van cellulaire ultrastructuren. Analyse is echter vaak beperkt tot twee dimensies, wat het vermogen belemmert om de driedimensionale (3D) ultrastructuur en functionele relatie tussen organellen volledig te beschrijven. Volume-elektronenmicroscopie (vEM) beschrijft een verzameling technieken die het mogelijk maken cellulaire ultrastructuur in 3D te ondervragen op mesoschaal, microschaal en nanoschaalresoluties. 
Dit protocol biedt een toegankelijke en robuuste methode om vEM-gegevens te verkrijgen met behulp van SERIAL SECTION TRANSMISSION EM (TEM) en behandelt de technische aspecten van monsterverwerking tot digitale 3D-reconstructie in één eenvoudige workflow. Om het nut van deze techniek aan te tonen, wordt de 3D ultrastructurele relatie tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondriën en hun contactplaatsen in leverhepatocyten gepresenteerd. Interorganelle-contacten spelen een vitale rol bij de overdracht van ionen, lipiden, voedingsstoffen en andere kleine moleculen tussen organellen. Ondanks hun eerste ontdekking in hepatocyten, is er echter nog veel te leren over hun fysieke kenmerken, dynamiek en functies. 
Interorganelle-contacten kunnen een reeks morfologieën weergeven, variërend in de nabijheid van de twee organellen tot elkaar (meestal ~ 10-30 nm) en de omvang van de contactlocatie (van punctate-contacten tot grotere 3D-reservoirachtige contacten). Het onderzoek van nauwe contacten vereist beeldvorming met hoge resolutie en seriële sectie TEM is zeer geschikt om de 3D-ultrastructurele interorganelle contacten tijdens hepatocytendifferentiatie te visualiseren, evenals veranderingen in hepatocytenarchitectuur geassocieerd met metabole ziekten.

Voor deze techniek worden interessante regio's geselecteerd op basis van het biologische onderzoeksdoel en geïdentificeerd voorafgaand aan het trimmen en doorsnijden van ingebed weefsel. Evenzo kan de grootte van het blokvlak worden bepaald door de onderzoeksvraag; in dit geval werd het monster bijgesneden om een blokvlak van ongeveer 0,3 mm x 0,15 mm achter te laten (figuur 4A). Dit maakte twee rasters van 9 seriële secties per raster mogelijk, die 18 seriële secties leverden en een volume ...

Een eenvoudig en uitgebreid protocol om driedimensionale details van membraancontactplaatsen tussen organellen in hepatocyten uit de lever of cellen in andere weefsels te verkrijgen.

Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Dit protocol maakt 3D-reconstructie van organellen op een eenvoudige en robuuste manier mogelijk, terwijl het toegankelijk is voor laboratoria die momenteel geen gespecialiseerde volume-elektronenmicroscopen hebben. Deze techniek is uiterst flexibel en biedt een uitstekende X / Y-resolutie, terwijl het indien nodig monsters opnieuw kan afbeelden. Het is ook compatibel met kanteltomografie wanneer een zeer hoge Z-resolutie vereist is.Deze techniek maakt ondervragingen van organelmorfologie in inter-organel context mogelijk. Daarom kan het worden uitgebreid om eventuele pathologische aandoeningen met organeldefecten te onderzoeken. Deze aanpak kan inzicht geven in organelinteracties en cellulaire mensenhandelgebeurtenissen.Deze methode kan ook worden toegepast op andere weefsels, organoïde modellen en celkweeksystemen, naast hepatocyten. Nieuwe gebruikers kunnen seriële secties en oppakken uitdagend vinden zonder verlies. Het wordt aanbevolen om bedreven te zijn in regelmatige ultradunne secties voordat u dit protocol op een kostbaar monster toepast.Begin met het zorgvuldig trimmen van het met hars ingebedde weefsel met behulp van een scheermesje met het monster vergrendeld in de tri

three-dimensional-characterization-interorganelle-contact-sites

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De studie van de lever sinusoïdale endotheelcellen (SEC) moeten worden uitgevoerd met primaire cellen afkomstig van het dier als geen cel-lijnen bestaan. Deze methode is gebaseerd op de lever spijsvertering en differentiële centrifugatie voor SEC zuivering voor latere kweken en experimenteren.

In vivo Lever endocytose gevolgd door zuivering van levercellen door leverperfusie

De fenestreerde lever sinusoidale endotheelcel is een biologisch belangrijk filtersysteem dat sterk wordt beïnvloed door verschillende ziekten, toxines en fysiologische toestanden. Deze veranderingen hebben een aanzienlijke invloed op de leverfunctie. We beschrijven methoden voor de standaardisatie van de meting van de grootte en het aantal fenestraties in deze cellen.

Een gestandaardiseerde methode voor de analyse van lever sinusoïdale endotheelcellen en hun fenestraties van Scanning Electron Microscopy

In dit protocol tonen we de toepassing van seriële-sectie Elektronentomografie ophelderen van mitochondriale structuur in Drosophila indirecte vlucht spier.

3D mitochondriale ultrastructuur van Drosophila indirecte vlucht spier geopenbaard door seriële-sectie Elektronentomografie

Dit protocol is gericht op specifieke cellen in weefsels voor beeldvorming op de nanoschaal resolutie met behulp van een Scannende Elektronen Microscoop (SEM). Groot aantal seriële secties uit biologisch materiaal hars-embedded zijn eerste beeld in een lichte Microscoop te identificeren van het doel, waarna in een hiërarchische wijze in de SEM.

Multimodale hiërarchische beeldvorming van seriële secties voor het vinden van specifieke cellulaire doelen binnen grote Volumes

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Hier gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van muizen hepatocyten van volwassen muis levers met behulp van een gemodificeerde Collagenase perfusie techniek. Ook beschreven is de lange termijn cultuur van hepatocyten in een 3D collageen sandwich setting evenals immunolabeling van de cytoskelet componenten om gal canaliculaire vorming en de respons op de behandeling te bestuderen.

Isolatie en 3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten te bestuderen van de rol van Cytoskeleton in Gal Canalicular vorming in vitro

Hier beschrijven we een eenvoudige en toegankelijke strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in formaline-vaste paraffine-ingebedde tumorweefselsecties. Deze methodologie combineert bestaande beeldvormings- en digitale analysetechnieken met als doel de multiplexingcapaciteit en multiparameteranalyse van beeldvormingstesten uit te breiden.

Visualisatie, kwantificering en mapping van immuuncelpopulaties in de tumormicro-omgeving

De behoefte aan nieuwe benaderingen voor het bestuderen van membraancontactplaatsen (MCS'en) is gegroeid als gevolg van de toenemende interesse in het bestuderen van deze cellulaire structuren en hun componenten. Hier presenteren we een protocol dat eerder beschikbare microscopietechnologieën integreert om intra-organel en inter-organel eiwitcomplexen die zich in MCS'en bevinden te identificeren en te kwantificeren.

Visualisatie en kwantificering van endogene intra-organeleiwitinteracties op ER-mitochondriale contactlocaties door nabijheidsligatietests

Cryo-STEM-tomografie biedt een middel om organellen van intacte cellen te visualiseren zonder inbedding, sectie of andere invasieve preparaten. De verkregen 3D-resolutie ligt momenteel in het bereik van enkele nanometers, met een gezichtsveld van enkele micrometers en een toegankelijke dikte in de orde van grootte van 1 μm.

Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale cristae kan worden gereconstrueerd om 3D-beeldvorming te bereiken met hoge nauwkeurigheid, hoge resolutie en hoge doorvoer.

Een driedimensionale techniek voor de visualisatie van mitochondriale ultrastructurele veranderingen in pancreaskankercellen

Dit protocol biedt een uitgebreide beeldvormingspijplijn om de morfologie van leverstellate cellen in intact leverweefsel te visualiseren en te modelleren. Deze benadering combineert fluorescerende labeling van fibroblasten met behulp van muisgenetica, in situ leverperfusie-gebaseerde weefselvoorbereiding en een aangepaste iDISCO-weefselreinigingsmethode om optische transparantie te bereiken.

Mapping van de morfologie van hepatische stellate cellen in muismodellen van leverfibrose

Leer driedimensionale reconstructie van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met seriële sectie elektronenmicroscopie. Deze flexibele methode biedt uitstekende resolutie en is toegankelijk voor laboratoria zonder gespecialiseerde microscopen.

Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal

Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie

Meer video's verkennen