Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie

Dit protocol maakt 3D-reconstructie van organellen op een eenvoudige en robuuste manier mogelijk, terwijl het toegankelijk is voor laboratoria die momenteel geen gespecialiseerde volume-elektronenmicroscopen hebben. Deze techniek is uiterst flexibel en biedt een uitstekende X / Y-resolutie, terwijl het indien nodig monsters opnieuw kan afbeelden. Het is ook compatibel met kanteltomografie wanneer een zeer hoge Z-resolutie vereist is.

Deze techniek maakt ondervragingen van organelmorfologie in inter-organel context mogelijk. Daarom kan het worden uitgebreid om eventuele pathologische aandoeningen met organeldefecten te onderzoeken. Deze aanpak kan inzicht geven in organelinteracties en cellulaire mensenhandelgebeurtenissen.

Deze methode kan ook worden toegepast op andere weefsels, organoïde modellen en celkweeksystemen, naast hepatocyten. Nieuwe gebruikers kunnen seriële secties en oppakken uitdagend vinden zonder verlies. Het wordt aanbevolen om bedreven te zijn in regelmatige ultradunne secties voordat u dit protocol op een kostbaar monster toepast.

Begin met het zorgvuldig trimmen van het met hars ingebedde weefsel met behulp van een scheermesje met het monster vergrendeld in de trimadapter. Breng de monster ark samen met de klauwplaat en het monster over naar de monsterarm van de microtome en plaats de specimen ark zo dat het reisbereik van de ark van boven naar beneden loopt. Plaats en vergrendel het diamantmes in de meshouder en zorg ervoor dat de snijhoek van het mes op de juiste manier is ingesteld.

Vergrendel de messenhouder stevig in het podium. Schakel de downlighting van het podium uit, zet de uplighting van het podium aan, beweeg het mes voorzichtig naar het monster, pas voortdurend de zijdelingse hoek van het mes, de kanteling van het monster en de rotatie van het monster aan door de relevante knoppen aan te passen totdat het blokvlak is uitgelijnd met de rand van het mes. Plaats de boven- en onderkant van het snijvenster van de monsterarm en laat het monster net onder de mesrand staan.

Vul de messenboot met schoon, dubbel gedestilleerd water en zorg ervoor dat het wateroppervlak vlak is met de rand van het mes en licht hol is. Begin vervolgens met het snijden van secties. Stop het snijden net nadat het monster de rand van het mes is gepasseerd.

Gebruik een leeg slotraster om het aantal secties te schatten dat op elk raster moet worden verzameld. Gebruik een wimper in elke hand en breek het lint voorzichtig in kleinere linten die in de lengte van het sleufraster passen. Maak een mentale notitie van hun relatieve posities binnen de steekproef.

Gebruik een glazen applicatorstaaf en beweeg een druppel chloroform over de secties om ze af te vlakken. Pak het eerste lege slotrooster op met de eerste genummerde tang en dompel het voorzichtig in de Triton X-100 en vervolgens twee keer in het gedestilleerde water. Gebruik een stuk filterpapier om het overtollige water van de rand van de tang te verwijderen.

Laat met een tang ongeveer 2/3 van het met formvar gecoate sleufrooster voorzichtig in het water van de messenboot zakken. Zorg ervoor dat de formvarzijde naar beneden is gericht en dat de lange rechterrand van de sleuf zich aan het wateroppervlak bevindt en evenwijdig aan de rand van het water. Waait het rooster voorzichtig in het water naar de linten, zodat bij de terugslag de secties naar het raster afdrijven.

Blijf dit doen in steeds kleinere wafts, totdat de rechterrand van het lint uitlijnt met de rechterrand van de sleuf. Breng vervolgens met de laatste waft voorzichtig het raster omhoog om de secties in het sleufraster op te pakken. Plaats verschillende pellets natriumhydroxide onder het deksel van een petrischaal om een kooldioxidevrije omgeving te creëren.

Pipetteer vervolgens voorzichtig 40-microliter druppels van Reynold's loodcitraat op de parafilm, één druppel voor elk rooster. Keer elk rooster om op de loodcitraatdruppel en laat het 7 tot 10 minuten beschermd door het deksel van de petrischaal staan. Terwijl de roosters vlekken maken, plaatst u vijf druppels gedestilleerd water van ongeveer 300 microliter voor elk rooster op de parafilm.

Breng aan het einde van de loodcitraatincubatie elk rooster over in een druppel gedestilleerd water om gedurende één minuut te wassen zonder direct op de roosters te ademen. Herhaal dit nog vier keer. Gebruik genummerde crossover-tang om het eerste raster op te pakken.

Raak de rand van het rooster aan om papier te filteren om het grootste deel van het water af te voeren en laat minstens 20 minuten in de tang drogen. Herhaal dit voor elk raster. Let bij lage vergroting op de volgorde, locatie en positie van de seriële secties.

Navigeer naar het middelste gedeelte van de reeks op het raster. Blader door het voorbeeld en identificeer een interessante regio. Observeer vervolgens het monster met de gewenste vergroting.

Overweeg de reeks te verzamelen met een iets lagere vergroting, omdat secties vaak niet perfect zijn uitgelijnd en afbeeldingen mogelijk later moeten worden bijgesneden. Maak vervolgens referentieafbeeldingen bij lagere vergrotingen. Dit zal helpen om de context van de interessante regio te waarderen, de ruwe locatie bij verschillende vergrotingen in relatie tot sectiegrenzen en oriëntatiepunten in het voorbeeld.

Gebruik deze om de regio-van-belang in andere secties aan te geven. Gebruik voor schermverwijzingen herbruikbare zelfklevende stopverf, stickers of een stuk overheadprojectorpapier dat op het scherm is geplakt om tijdelijke markeringen op het scherm te plaatsen. Dit maakt het mogelijk om routinematig dezelfde kenmerken van het interessegebied in het midden van de afbeelding in de dataset opnieuw voor te stellen.

Open de afbeeldingsstapel, geef de voxelmetingen op en selecteer het tabblad Segmentatie om segmentatie te starten. Klik op Nieuw in het deelvenster segmentatie-editor om nieuwe objecten in de materiaallijst te definiëren. Klik met de rechtermuisknop om de kleur van het object te wijzigen en dubbelklik om de naam van het object te wijzigen.

Voor handmatige segmentatie kiest u het segmentatiegereedschap onder de materiaallijst en selecteert u het standaardpenseelgereedschap om de pixels te markeren. Het elektronenmicroscopiebeeld van twee tegenover elkaar staande hepatocyten wordt hier getoond. Hogere vergroting beeldvorming maakt de observatie van de morfologische details van de verschillende organellen met nanometer resolutie mogelijk.

De representatieve afbeelding toont de gesegmenteerde versie van hetzelfde tomogram, sporen van het endoplasmatisch reticulum, mitochondriën en de intermembrane contacten tussen het ER en de mitochondriën van verschillende ruimtes worden hier getoond. De representatieve afbeelding toont een gekantelde ortho-slice bedekt met segmentatiesporen en zijn relatieve positie binnen het hele mitochondrion. 3D-reconstructie van de gesegmenteerde organellen en de endoplasmatische reticulum-mitochondria-contacten onder verschillende hoeken worden hier getoond.

Omdat dit protocol compatibel is met tilttomografie wanneer een zeer hoge Z-resolutie nodig is, helpt het om kleine of ingewikkelde structuren op te lossen. Deze techniek is perfect voor de eerste beoordeling van de ruimtelijke relatie tussen verschillende organellen en daarom bijzonder nuttig in het voortschrijdende veld van membraancontacten bij membraanhomeostase.