Name: Een TNBS-geïnduceerd knaagdiermodel om de pathogene rol van mechanische stress bij de ziekte van Crohn te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Leer een TNBS-geïnduceerd knaagdiermodel om mechanische stress bij de ziekte van Crohn te onderzoeken. Deze methode maakt vergelijkend onderzoek mogelijk naar ontstoken en niet-ontstoken darmsegmenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van NIH (R01 DK124611 aan XZS) en het Amerikaanse ministerie van Defensie (W81XWH-20-1-0681 aan XZS). Het histologische werk werd gedaan met de hulp van het UTMB Surgical Pathology Lab.

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik van de University of Texas Medical Branch (#0907051C). Mannelijke of vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten, ~ 8-9 weken oud, werden gebruikt voor de studie.
1. Bereiding van dieren
<ol><li>Vast ratten gedurende 24 uur en behandel ze 's nachts met laxeermiddel (darmreiniger, zie Tabel met materialen).</li>
	<li>De volgende dag verdooft u ratten met behulp van een anesthesiesysteem (zie Materiaaltabel) door ze bloot te stellen aan 2% isofluraan samen met 1 L /min zuurstof tijdens toediening van TNBS. Controleer op reflexen of knijp tenen om de verdoving te bevestigen.</li>
	<li>Bereid verse TNBS-oplossing volgens lichaamsgewicht. OPMERKING: TNBS - 65 mg/kg lichaamsgewicht in 250 μL van 40% ethanol werd gebruikt.</li>
	<li>Zet ratten in rugligging op de anesthesietafel. Om colitis te induceren, brengt u via de anus een open polyurethaankatheter van medische kwaliteit in gedurende ~ 7-8 cm van de anale berm en brengt u TNBS (bereid in stap 1.3) voorzichtig in de dikke darm19 in. Dien de schijnbestrijdingsratten toe met slechts 250 μL zoutoplossing.</li>
	<li>Houd na het inbrengen van TNBS of zoutoplossing de ratten in rugligging en iets naar beneden (~ 30 °), met de anus gedurende 2 minuten gesloten om de TNBS-distributie te helpen en morsen te voorkomen.</li>
	<li>Voorzie ratten gedurende 7 dagen van voedsel en water ad libitum en observeer de ratten dagelijks op lichaamsgewicht, voedselopname, uitwerpselen en algemene gezondheidstoestand.</li>
</ol>2. Weefselpreparaten
<ol><li>Euthanasie op de dag van euthanasie de ratten met behulp van CO 2-inhalatie en bevestig euthanasie met cervicale dislocatie.</li>
	<li>Open de buik van de rat met een schaar en een tang van chirurgische kwaliteit.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de gehele dikke darm (boven het anale kanaal) en breng de dikke darm onmiddellijk over op ijskoude 1x HBSS-buffer.</li>
	<li>Maak de dubbele punt in de buffer recht en meet de colonlengte met behulp van een liniaal. Neem nylondraad en cirkel rond de dikke darm om de externe omtrek van de dikke darmsegmenten onder controle en met TNBS behandelde ratten te meten. Neem weefsels van volledige dikte voor histologie.</li>
	<li>Snijd de dikke darm langs de mesenteriale plank open en reinig de dikke darm goed met HBSS-buffer. Beoordeel de colon op macroscopische ontstekingsscore op basis van de criteria zoals eerder beschreven19 met minimale wijzigingen. OPMERKING: 0 = normaal slijmvlies; 1 = gelokaliseerde hyperemie maar geen erosies of zweren; 2 = zweer en stenose (getroffen gebied < 5 mm); 3 = ernstige maagzweer, litteken en stenose (getroffen gebied > 5 mm).</li>
	<li>Verzamel darmweefselmonsters van plaats P (deel 2-3 cm vóór de orale marge van de ontstekingsplaats), plaats I (ontstekingsplaats, meestal 4-6 cm van het einde van de dikke darm, waar TNBS wordt toegediend) en plaats D (deel 1-2 cm distaal naar de aborale marge van ontstekingsplaats), respectievelijk van met TNBS behandelde ratten. OPMERKING: Colonweefsel van ~ 1-2 cm lang werd uit elk segment genomen. Bovendien werden de colonweefsels van 2 cm lang (~ 4-6 cm van het einde van de dikke darm) van de met zoutoplossing behandelde ratten als schijncontrole (S) genomen (figuur 1).</li>
	<li>Neem weefselmonsters van elke plaats voor voorbereiding op volledige dikte en, indien gewenst, respectievelijk de lagen mucosa / submucosa en muscularis externa, evenals21,22.</li>
	<li>Vries weefselmonsters eerst in vloeibare stikstof in voordat ze bij -80 °C worden bewaard voor opslag tot één jaar en voor toekomstige doeleinden (d.w.z. RNA-preparaten).</li>
</ol>3. Histopathologische beoordeling van darmontsteking en fibrose
<ol><li>Fixeer de dikke darmweefsels van volledige dikte in 10% formaline gedurende 48 uur en breng vervolgens over op 70% ethanol gedurende 24-48 uur.</li>
	<li>Gebruik een microtoom om paraffinesecties van 5 μm dikte te snijden voor respectievelijk Hematoxyline en eosine (H & E) en Masson's Trichrome-vlekken 6,19,23 (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Verkrijg en bekijk beelden met een rechtopstaande microscoop die is uitgerust met een camera met hoge resolutie en compatibele software (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Graad ontsteking en fibrose indexen door twee onafhankelijke onderzoekers, waaronder een gastro-intestinale chirurgische patholoog volgens criteria eerder beschreven 6,23 met modificaties. Zie Aanvullend Dossier 1 voor de scores.</li>
	<li>Meet de dikte en het celaantal van de cirkelvormige en longitudinale spierlagen per doorsnede in vier weergaven van elk H & E-gekleurd monster en neem het gemiddelde van de vier metingen voor elk monster.</li>
</ol>4. RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR
<ol><li>Homogeniseren van weggesneden colonweefsel verkregen uit de schijncontrole en drie plaatsen (P, I, D) van TNBS colitis ratten in het extractiereagens van een RNA-extractiekit (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Isoleer RNA van elk monster met behulp van de kit. Eluteer de RNA-pellet in 30 μL RNase-vrij water.</li>
	<li>Kwantificeer de RNA-concentratie en controleer op zuiverheid met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer met microvolume (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Gebruik 1 μg totaal RNA om cDNA21,22 te synthetiseren met behulp van de RNA-synthesekit (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Analyseer en kwantificeer genexpressieniveaus door real-time PCR uit te voeren met 50 ng cDNA als sjabloon, probes van IL-6 en CTGF met behulp van een commerciële PCR-kit voor real-time PCR-systeem (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Gebruik controlegenen 18S-rRNA om de monsters te normaliseren en relatieve genexpressie te kwantificeren met behulp van de verkregen Cq-waarden.</li>
</ol>5. Statistische analyse
<ol><li>Gebruik statistische analysesoftware (zie Tabel met materialen) om schijncontrole en TNBS colitis ratten te vergelijken.</li>
	<li>Beschouw de p-waarde < 0,05 als statistisch significant15,19.</li>
	<li>Om de verschillen tussen twee groepen te testen, gebruikt u de t-testanalyse van Student en voert u een ANOVA-test uit als vergelijkingen meer dan twee groepen zijn15,19.</li>
</ol>

<ol><li>Kappelman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+geographic+distribution+of+Crohn%27s+disease+and+ulcerative+colitis+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).</li>
<li>Hwang, J. M., Varma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+for+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Surgery for inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).</li>
<li>Latella, G., Rieder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fibrosis%3A+Ready+to+be+reversed%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal fibrosis: Ready to be reversed.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).</li>
<li>Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+management%2C+and+treatment+of+fibrosis+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).</li>
<li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Crohn%27s+disease-associated+small+bowel+strictures+and+fibrosis+on+cross-sectional+imaging%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review.</a> Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).</li>
<li>Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+hyperplasia%2Fhypertrophy+is+the+most+prominent+histological+change+in+Crohn%27s+fibrostenosing+bowel+strictures%3A+A+semiquantitative+analysis+by+using+a+novel+histological+grading+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).</li>
<li>Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+course+of+Crohn%27s+disease+after+ileocolic+resection%3A+Endoscopically+visualised+ileal+ulcers+preceding+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms.</a> Gut. 33 (3), 331-335 (1992).</li>
<li>Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+is+a+pro-inflammatory+stimulus+in+the+gut%3A+In+vitro%2C+in+vivo+and+ex+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence.</a> PLoS One. 9, 106242(2014).</li>
<li>Gabella, G., Yamey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+collagen+by+smooth+muscle+in+the+hyertrophic+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine.</a> Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).</li>
<li>Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstruction+and+pseudo-obstruction+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease.</a> Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).</li>
<li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+corresponding+to+strictured+bowel+induces+a+fibrogenic+response+in+human+colonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts.</a> Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).</li>
<li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signalling%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li>
<li>Cox, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertonic+saline+modulation+of+intestinal+tissue+stress+and+fluid+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance.</a> Shock. 29 (5), 598-602 (2008).</li>
<li>Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+gene+expression+in+gut+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction%3A+Role+of+stretch-induced+COX-2%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).</li>
<li>Gutierrez, J. A., Perr, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+modulates+TGF-beta1+and+alpha1%28I%29+collagen+expression+in+fetal+human+intestinal+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).</li>
<li>Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTGF+is+a+central+mediator+of+tissue+remodeling+and+fibrosis+and+its+inhibition+can+reverse+the+process+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+Tissue+Repair%22%5BJournal%5D)">CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis.</a> Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24(2012).</li>
<li>Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+the+Cyr61%2FCCN1+and+CTGF%2FCCN2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins.</a> The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).</li>
<li>Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immune+and+genetic+responses+in+rat+models+of+Crohn%27s+colitis+and+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).</li>
<li>Antoniou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TNBS-induced+colitis+animal+model%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine+and+Surgery+%28London%29%22%5BJournal%5D)">The TNBS-induced colitis animal model: An overview.</a> Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).</li>
<li>Shi, X. Z., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+Cav1.2+channel+with+VIP+and+VIP+receptor+agonists+and+antagonists%3A+A+novel+approach+to+designing+promotility+and+antimotility+agents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).</li>
<li>Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophylactic+and+therapeutic+benefits+of+COX-2+inhibitor+on+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction%3A+Roles+of+PGE2+and+EP+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).</li>
<li>Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Mudter, J., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Il-6+signaling+in+inflammatory+bowel+disease%3A+Pathophysiological+role+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance.</a> Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).</li>
<li>Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mechano-transcription+process+as+therapeutic+intervention+in+gastrointestinal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 809350(2021).</li>
</ol>

De auteurs melden geen belangenverstrengeling en hebben niets te onthullen.

TNBS-geïnduceerde colitis werd geïntroduceerd in 1989 en wordt sindsdien gebruikt als een experimenteel model van de ziekte van Crohn 19,20,23. Belangrijke kenmerken van dit model bij knaagdieren zijn de ontwikkeling van een transmurale ontsteking die sterk lijkt op de histopathologische laesies die zijn ontwikkeld bij de ziekte van Crohn bij de mens19,20. Eerdere studie...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol/saline was used.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.

Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

Inflammatoire darmziekte (IBD), waaronder colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD), wordt gekenmerkt door chronische ontsteking in het maagdarmkanaal (GI). Het treft ~ 1-2 miljoen Amerikanen1. De geschatte jaarlijkse kosten voor IBD-zorg in de VS zijn $ 11,8 miljard. In tegenstelling tot UC wordt de CD gekenmerkt door transmurale ontsteking en strictuurvorming 2,3. Strictuurvorming (stenose) komt voor bij maximaal 70% van de CD-patiënten3 en kan worden veroorzaakt door transmurale ontsteking (inflammatoire stenose) of darmfibrose (fibrotische stenose)4,5. Darmfibrose wordt gekenmerkt door overmatige collageenafzetting en andere extracellulaire matrices (ECM) met gladde spiercellen (SMC) als een van de belangrijkste mesenchymale celtypen die betrokken zijn bij het proces 3,4. Gladde spierhyperplasie geassocieerd met hypertrofie is een andere significante histologische verandering in fibrotische stenose bij CD6. Hoewel strictuurvorming in CD geassocieerd is met chronische ontsteking, is geen ontstekingsremmende behandeling effectief, behalve chirurgische behandeling 2,6. Postoperatieve recidieven zijn echter bijna 100%, mits voldoende tijd 2,7. Als ontstekingsreactie kunnen fibrose en SMC-hyperplasie zich ook ontwikkelen bij niet-inflammatoire aandoeningen (d.w.z. darmobstructie) in de darm 8,9; er wordt aangenomen dat zowel ontstekingsafhankelijke als onafhankelijke mechanismen betrokken zijn bij strictuurvorming 3,4. Aangezien uitgebreid onderzoek naar de ontstekingsafhankelijke mechanismen zich niet heeft vertaald in een effectieve therapie voor strictuurvorming, zijn studies nodig naar de mogelijke rol van ontstekingsonafhankelijke mechanismen bij darmfibrose.
Als een niet-inflammatoire factor wordt mechanische stress (MS) geassocieerd met oedeem, inflammatoire celinfiltratie, weefselvervorming, fibrose en stenose 10,11,12,13 vaak aangetroffen bij IBD, vooral CD, die wordt gekenmerkt door transmurale ontsteking. Mechanische stress is het meest opmerkelijk bij stenotische CD, waar stenose (inflammatoir of fibrotisch) op de ontstekingsplaats mechanische stress in het lokale weefsel presenteert en leidt tot lumenuitzetting in het segment proximaal tot de obstructieplaats 10,14. Eerdere in vitro studies hebben aangetoond dat mechanische stress de genexpressie van specifieke ontstekingsmediatoren (d.w.z. COX-2, IL-6)8,14,15 en groeifactoren (d.w.z. TGF-β) in de gastro-intestinale weefsels, met name darm gladde spiercellen (SMC)16, verandert. Recente studies toonden ook aan dat de expressie van specifieke pro-fibrotische mediatoren zoals bindweefselgroeifactor (CTGF) zeer gevoelig is voor mechanische stress 17,18. Er werd verondersteld dat mechanische stress een onafhankelijke pathogene rol zou kunnen spelen bij CD-geassocieerde ontsteking, fibrose en weefselremodellering. De pathogene betekenis van mechanische stress bij darmontsteking, fibrose en gladde spierhyperplasie bij CD blijft echter grotendeels onontgonnen. Dit kan deels komen doordat ontsteking een zichtbaarder en beter bestudeerd proces is dan mechanische stress. Wat nog belangrijker is, er is geen goed gedefinieerd diermodel van IBD om het effect van mechanische stress te onderscheiden van dat van ontsteking.
Het huidige werk beschrijft een knaagdiermodel van Crohn-achtige colitis geïnduceerd door intrakolonische injectie van haptenreagens 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS)19,20, dat het doel kan dienen om de rol van mechanische stress in CD te bestuderen. Het bleek dat TNBS-instillatie een gelokaliseerde (~ 2 cm lengte) transmurale ontsteking veroorzaakte met lumenvernauwing (stenose) in de distale dikke darm. De stenose leidt tot duidelijke darmuitzetting (mechanische stress)14,15 maar niet zichtbare ontsteking in het colonsegment proximaal tot de instillatieplaats. Integendeel, het colonsegment distale naar de stenoseplaats vertoont geen ontsteking of mechanische stress. Significante site-specifieke veranderingen in genexpressie, ontsteking, fibrose en SMC-hyperplasie werden waargenomen op de drie verschillende locaties. De resultaten suggereren dat mechanische stress, met name mechanische stress-geïnduceerde genexpressie, een cruciale rol kan spelen bij het ontwikkelen van fibrose en hyperplasie bij colitis van Crohn.

<table><tbody><tr><td>ACT-1 Control Software Ver2.63</td><td>Nikon</td><td>DXM1200F</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module</td><td>BIO-RAD</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems</td><td>BIO-RAD</td><td>1845097</td><td></td></tr><tr><td>Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer</td><td>Dako</td><td>AR310</td><td></td></tr><tr><td>Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173</td><td>Dako</td><td>AR173</td><td></td></tr><tr><td>DXM1200 Digital Color HR Camera</td><td>Nikon</td><td>DXM1200</td><td></td></tr><tr><td>Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4352930E</td><td></td></tr><tr><td>E-Z Anesthesia</td><td>E-Z Systems Inc.</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad</td><td>9.0.2 (161)</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td><td>BIO-RAD</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium)</td><td>CORNING</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-667</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Digital Imaging System</td><td>LI-COR</td><td>9120</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>5341</td><td></td></tr><tr><td>Medical grade open end polyurethane catheter</td><td>Covidien</td><td>8890703013</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E800 Upright Microscope</td><td>Nikon</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 &mu;m, 7 x 8.5 cm</td><td>BIO-RAD</td><td>1620215</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative</td><td>Miralax</td><td>C8175</td><td>Dose: 17g in 226 mL van water</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma H&amp;E Stain Kit #1</td><td>Sakura</td><td>6190</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer</td><td>Sakura</td><td>6171</td><td></td></tr><tr><td>TNBS (Picrylsulfonic acid solution)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>92822</td><td></td></tr></tbody></table>

een tnbs-geïnduceerd knaagdiermodel om de pathogene rol van mechanische stress bij de ziekte van crohn te bestuderen

A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

Inflammatoire darmziekten (IBD) zoals de ziekte van Crohn (CD) zijn chronische ontstekingsaandoeningen van het maagdarmkanaal die ongeveer 20 per 1.00.000 in Europa en de VS beïnvloeden. CD wordt gekenmerkt door transmurale ontsteking, darmfibrose en luminale stenose. Hoewel ontstekingsremmende therapieën kunnen helpen bij het beheersen van ontstekingen, hebben ze geen werkzaamheid op fibrose en stenose in CD. De pathogenese van CD is niet goed begrepen. Huidige studies richten zich voornamelijk op het afbakenen van ontregelde immuunresponsmechanismen van de darm. Hoewel CD-geassocieerde transmurale ontsteking, darmfibrose en luminale stenose allemaal mechanische stress op de darmwand vertegenwoordigen, is de rol van mechanische stress in CD niet goed gedefinieerd. Om te bepalen of mechanische stress een onafhankelijke pathogene rol speelt bij CD, is een protocol van TNBS-geïnduceerd CD-achtig colitismodel bij knaagdieren ontwikkeld. Dit TNBS-geïnduceerde transmurale ontstekings- en fibrosemodel lijkt op pathologische kenmerken van CD in de dikke darm. Het wordt geïnduceerd door intrakolonische instillatie van TNBS in de distale dikke darm van volwassen Sprague-Dawley-ratten. In dit model leidt transmurale ontsteking tot stenose op de TNBS-instillatieplaats (site I). Mechanische uitzetting wordt waargenomen in het gedeelte proximaal tot de instillatieplaats (site P), wat mechanische stress vertegenwoordigt, maar geen zichtbare ontsteking. Colongedeelte distale tot ontsteking (site D) presenteert geen ontsteking of mechanische stress. Onderscheidende veranderingen van genexpressie, immuunrespons, fibrose en gladde spiergroei op verschillende plaatsen (P, I en D) werden waargenomen, wat een diepgaande impact van mechanische stress benadrukte. Daarom zal dit model van CD-achtige colitis ons helpen de pathogene mechanismen van CD beter te begrijpen, met name de rol van mechanische stress en mechanische stress-geïnduceerde genexpressie bij immuunontregeling, darmfibrose en weefselremodellering in CD.

Macroscopische weergave van Crohn-achtige colitis geïnduceerd door intra-colon instillatie van TNBS Zoals te zien is in figuur 1, veroorzaakte intrakolonische instillatie van TNBS bij ratten een gelokaliseerde transmurale ontsteking (~ 2 cm lang) met verdikte darmwand en vernauwd lumen (stenose) op de plaats van instillatie in de distale dikke darm (figuur 1A). De site van TNBS instillatie wordt aangeduid als site I. Als gevolg van transmural...

Het huidige protocol beschrijft de ontwikkeling van een Crohn-achtig colitismodel bij knaagdieren. Transmurale ontsteking leidt tot stenose op de TNBS-instillatieplaats en mechanische vergroting wordt waargenomen in het segment proximaal met de stenose. Deze veranderingen maken het mogelijk om mechanische stress bij colitis te bestuderen.

Een TNBS-geïnduceerd knaagdiermodel om de pathogene rol van mechanische stress bij de ziekte van Crohn te bestuderen

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting ...

Dus in ons protocol leidt intra-coloninstillatie van TNBS tot transmurale ontsteking op de instillatieplaats en de mechanische uitzetting in het segment proximaal tot ontsteking. Dit bootst dus de ziekte van Crohn stenotisch na. Omdat het proximale segment mechanisch is opgezwollen maar geen zichtbare ontsteking vertoont, helpt een vergelijkende studie van het proximale segment en de ontstekingsplaats om te bepalen of mechanische stress een rol speelt bij colitis crohn.Eerdere studies richten zich alleen op de ontstekingsplaats. Ons protocol dat op verschillende locaties in het model werkt, benadrukt een cruciale rol van mechanische stress bij de ziekte van Crohn, met name bij de ziekte van Crohn. Plaats om te beginnen de ratten op de anesthesietafel in rugligging.Om colitis te induceren, brengt u een polyurethaankatheter van medische kwaliteit in met open uiteinde door de anus gedurende ongeveer zeven tot acht centimeter van de anale berm en brengt u TNBS voorzichtig in de dikke darm in. Dien de schijnbestrijdingsratten toe met 250 microliter zoutoplossing. Om de verdeling van TNBS of zoutoplossing te helpen en morsen te voorkomen, houdt u de ratten in rugligging met hun kop naar beneden gericht in een hoek van ongeveer 30 graden, met de anus gedurende twee minuten gesloten.Open de buik van de rat met een schaar en een tang van chirurgische kwaliteit. Verwijder voorzichtig de gehele dikke darm boven het anale kanaal en breng de dikke darm onmiddellijk over naar ijskoude 1x HBSS-buffer. Maak de dubbele punt in de buffer recht en meet de darmlengte met behulp van een liniaal.Neem een nylondraad en cirkel deze rond de dikke darm om de externe omtrek van de dikke darmsegmenten onder controle en met TNBS behandelde ratten te meten. Neem weefsels van volledige dikte voor histologie. Snijd de dikke darm langs de mesenteriale plank open en reinig de dikke darm grondig met HBSS-buffer.Beoordeel de colon op macroscopische ontstekingsscore op basis van de vooraf gedefinieerde criteria met minimale wijzigingen. Verzamel darmweefselmonsters van met TNBS behandelde ratten op plaatsen P, I en D.Site P is het gedeelte twee tot drie centimeter vóór de orale marge van de ontstekingsplaats. Plaats I is de ontstekingsplaats waar TNBS wordt ingeprent, meestal vier tot zes centimeter van het einde van de dikke darm.Ten slotte is site D het gedeelte één tot twee centimeter distal van de aborialmarge van de ontstekingsplaats. Intra-coloninstillatie van TNBS bij ratten veroorzaakte een gelokaliseerde transmurale ontsteking van ongeveer twee centimeter lang met een verdikte darmwand en vernauwd lumen op de plaats van instillatie in de distale dikke darm. De plaats van TNBS-instillatie werd aangeduid als plaats I.As gevolg van transmurale ontsteking en stenose waren zowel ontsteking als mechanische stress aanwezig op plaats I.De stenose op plaats I leidde tot duidelijke lumenuitzetting in het segment proximaal tot de plaats van TNBS-instillatie, aangeduid als site P.De colonomtrek was significant verhoogd op plaatsen P en I in vergelijking met schijncontrole colon.Hoewel mechanisch opgezwollen, vertoonde site P geen zichtbare ontsteking. Integendeel, het colonsegment distale van de TNBS-instillatie, aangeduid als site D, vertoonde geen ontsteking of mechanische uitzetting. De macroscopische score van ontsteking op plaats I bij de met TNBS behandelde ratten was dramatisch verhoogd in vergelijking met schijncontroles op plaatsen P en D van colitisratten.De ontstekingsscores op de plaatsen P en D waren niet significant verhoogd in vergelijking met sham. Het is dus belangrijk om niet alleen site I te bestuderen, maar ook sites P en D in het model, omdat dit helpt om de pathogene betekenis van mechanische stress bij de ziekte van Crohn te herkennen. Om verder te bepalen of mechanische stress een pathogene factor is bij darmontsteking, kan men ook proberen mechanische uitzetting vrij te geven door de dieren uitsluitend met een vloeibaar dieet te voeren en te zien of dit helpt bij ontsteking en darmfunctie.

a-tnbs-induced-rodent-model-to-study-pathogenic-role-mechanical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dextransulfaat natrium (DSS) toegediend in het drinkwater is een gevestigde murine inflammatoire letsel model van acute colitis. Dit protocol beschrijft de methode voor DSS behandeling en de preparatie van de weefsels.

Murine Colitis Modeling met dextraansulfaat Natrium (DSS)

Citrobacter rodentium infectie biedt een waardevol model voor enterische bacteriële infecties te bestuderen, evenals het hosten immuunreacties en colitis bij muizen. Dit protocol beschrijft de meting van de barrière integriteit, pathogeen belasting en histologische schade waardoor de grondige karakterisering van pathogeen en gastheer bijdragen aan murine infectieuze colitis.

De<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Muis Model: Studeren pathogeen en gastheer Bijdragen aan infectieuze colitis

DNBS / TNBS colitis biedt een alternatieve en goedkope methode om de pathobiology van ontstekingsdarmziekte bestuderen. Het protocol besproken in dit document schetst de succesvolle toepassing van DNBS om colitis te induceren bij muizen en ratten en maakt het mogelijk om grondig te bestuderen host-mediated intestinale reacties.

DNBS / TNBS Colitis modellen: Inzicht geven Into Inflammatory Bowel Disease en effecten van vet in de voeding

Diermodellen hebben bewezen waardevolle instrumenten definiëren gastheer en pathogeen specifieke mechanismen die bijdragen aan de ontwikkeling van chronische ontsteking. Hier beschrijven we een muismodel van orale infectie met het humaan pathogeen Porphyromonas gingivalis en detail methoden om de progressie van inflammatie lokale en systemische plaatsen.

Een muismodel voor pathogenen geïnduceerde Chronische ontsteking op lokale en systemische sites

Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

In deze studie beschrijven we een gedetailleerde procedure van TNBS-gemedieerde intestinale fibrose, die vergelijkbare pathofysiologie vertoont voor de fibrose van Crohn. We bespreken deze aanpak ook in het licht van rapamycine vergemakkelijkt remmende effecten op intestinale fibrose.

Mechanistisch inzicht in de ontwikkeling van TNBS-gemedieerde intestinale fibrose en evaluatie van de remmende effecten van Rapamycine

Dit protocol beschrijft een muismodel van door salmonella gedreven intestinale fibrose dat lijkt op belangrijke pathologische kenmerken van de ziekte van Crohn, waaronder Transmurale ontsteking en fibrose. Deze methode kan worden gebruikt om gastheerfactoren te evalueren die fibrotische uitkomsten veranderen met Mutant muizen gehandhaafd op een C57Bl/6 genetische achtergrond.

Chronische salmonella infectie veroorzaakte intestinale fibrose

Het protocol presenteert een volledig gevalideerd TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn en methoden voor visualisatie van oestrogeenreceptoren door immunohistochemie met behulp van immunofluorescentie van formaline-vaste darm secties ingebed in paraffine.

Visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn met behulp van immunofluorescentie

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

Dit protocol beschrijft de methode voor het opstellen van een rattenmodel van pouchitis. Het ileumpouch-model is gemaakt door ileumpouch-anale anastomose (IPAA) chirurgie uit te voeren met behulp van microchirurgische technieken. Na de operatie werd de rat gedurende 4 dagen behandeld met 4% dextraansulfaatnatrium (DSS).

Een rattenmodel van pouchitis na proctocolectomie en ileale pouch-anale anastomose met behulp van dextransulfaatnatrium

Dit protocol laat zien hoe het Src-homologie 2-domeinbevattende 5'-inositolfosfatase (SHIP)-deficiënte muismodel van de ziekte van Crohn (CD)-achtige ileale ontsteking en fibrose kan worden gebruikt om nieuwe therapieën voor CD te testen.

Evaluatie van therapeutische interventies in het SHIP-deficiënte muismodel van de ziekte van Crohn, zoals ileitis en fibrose

Leer een TNBS-geïnduceerd knaagdiermodel om mechanische stress bij de ziekte van Crohn te onderzoeken. Deze methode maakt vergelijkend onderzoek mogelijk naar ontstoken en niet-ontstoken darmsegmenten.

Een TNBS-geïnduceerd knaagdiermodel om de pathogene rol van mechanische stress bij de ziekte van Crohn te bestuderen

Meer video's verkennen