Name: Het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door DNA-gordijntechniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Ontdek de DNA-gordijntechniek voor real-time visualisatie van eiwit-DNA-interacties met Abo1 in Schizosaccharomyces pombe. Deze methode onthult moleculaire mechanismen van chromatindynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs waarderen de vriendelijke steun voor Abo1 en Cy5-H3-H4 door professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., en Juwon Jang, Ph.D., in KAIST, Zuid-Korea. Dit werk wordt ondersteund door de National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), het intramurale onderzoeksfonds (1.210115.01) van het Ulsan National Institute of Science and Technology en het Institute for Basic Science (IBS-R022-D1).

1. Voorbereiding van de flowcel
<ol><li>Bereid een gereinigd gesmolten silicaglaasje voor met nano-greppelpatronen volgens eerder gepubliceerd rapport25.<ol><li>Boor twee gaten met een diameter van 1 mm in een gereinigd gesmolten silicaglaasje (Figuur 1A) met behulp van een diamantboor (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Breng 250 nm dik aluminium (Al) aan op het objectglaasje met behulp van DC-sputter32 (zie Materiaaltabel) met 10 mTorr argongas.</li>
		<li>Spin-coat een 310 nm dikke laag van 4% 950K poly(methylmethacrylaat) (PMMA) (zie Materiaaltabel) bij 4.000 tpm gedurende 1 minuut en bak op een hete plaat bij 180 °C gedurende 3 min.</li>
		<li>Teken de nano-loopgraafpatronen op de PMMA-laag tussen de twee gaten met behulp van elektronenbundel (ebeam) lithografie33 met 0,724 nA stroom bij 80 kV. OPMERKING: De architectuur en de afmetingen van de nano-loopgraafpatronen zijn weergegeven in figuur 1A.</li>
		<li>Verwijder de aan de ebeam blootgestelde PMMA door de objectglaasjes gedurende 2 minuten in de ontwikkeloplossing te laten weken (1:3 verhouding van methylisobutylketon en isopropanol, zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Ets Al-lagen met inductief gekoppelde plasmareactieve ionenets (ICP-RIE) met behulp van chloor (Cl2) en boortrichloride (BCl 3) gassen. NOTITIE: Deze twee gassen kunnen de Al verwijderen uit gebieden die aan de straling zijn blootgesteld.</li>
		<li>Snijd nano-sleuven op de objectglaasjes met behulp van zwaveltetrafluoride (SF4), tetrafluormethaan (CF4) en zuurstof (O2) gassen (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Verwijder de resterende Al-laag door de objectglaasjes gedurende 10 minuten in Al etsmiddel (AZ 300 MIF-ontwikkelaar, zie Materiaaltabel) te laten weken.</li>
		<li>Spoel de objectglaasjes na fabricage af met gedeïoniseerd water en sonificeer ze gedurende 30 minuten in aceton met behulp van een sonicator van het badtype.</li>
		<li>Reinig de objectglaasjes in 2% Hellmanex III-oplossing (zie Materiaaltabel) gedurende minimaal 1 dag met magnetisch roeren.</li>
		<li>Sonificeer de glaasjes achtereenvolgens in aceton gedurende 30 minuten en 1 M NaOH gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Spoel de glaasjes af met gedeïoniseerd water en droog ze af met een stikstofgas (N2).</li>
	</ol></li>
	<li>Leg een schoon papier (5 mm x 35 mm) op het midden van dubbelzijdig plakband. Bevestig de tape over de dia om de twee gaatjes en de nanopatronen met het papier te bedekken.</li>
	<li>Snijd het papier weg met een schoon mes (Figuur 1A).</li>
	<li>Leg een glazen dekglaasje op de dubbelzijdige tape en wrijf met een pipetpunt over het dekglaasje om een microfluïdische kamer te vormen (Figuur 1A).</li>
	<li>Plaats de geassembleerde stroomcel tussen twee objectglaasjes en klem ze vast.</li>
	<li>Bak de flowcel 45 minuten in een vacuümoven van 120 °C.</li>
	<li>Bevestig de vloeistofconnector (Nanoport) voor de op chips gebaseerde analyses (zie Materiaaltabel) met een heet lijmpistool aan elk open gat en verbind de twee lijnen van Luer lock-slangen.</li>
	<li>Sluit een Luerlock-spuit met 3 ml gedeïoniseerd water aan en was de kamer.</li>
	<li>Was de kamer met 3 ml lipidenbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 en 100 mM NaCl) via de druppel-voor-druppel-aansluiting. OPMERKING: Druppel-voor-druppel verbinding verbindt alle spuiten met de stroomcel om te voorkomen dat er luchtbellen in de kamer worden geïnjecteerd.</li>
	<li>Injecteer 1 ml 0,04x gebiotinyleerd lipide in lipidenbuffer in de kamer in twee injecties met 5 minuten incubatie per injectie. OPMERKING: De bereiding van 1x gebiotinyleerde lipidenvoorraad wordt beschreven in een eerder gepubliceerd rapport34.</li>
	<li>Was de kamer met 3 ml lipidenbuffer en incubeer gedurende 20 minuten om de lipidedubbellaag op het objectglaasje te laten rijpen.</li>
	<li>Voeg 1 ml BSA-buffer toe (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2 en 0,2 mg/ml BSA) en incubeer gedurende 5 minuten om het objectglaasje te passiveren. OPMERKING: Deze stap kan de niet-specifieke binding van eiwitten aan het objectglaasje verminderen.</li>
	<li>Injecteer 0,025 mg/ml streptavidine in 1 ml BSA-buffer met twee injecties en 10 minuten incubatie per injectie.</li>
	<li>Spoel de resterende streptavidine uit met 3 ml BSA-buffer.</li>
	<li>Injecteer ~300 pM (30 μL) gebiotinyleerd lambdafaag-DNA in 1 ml BSA-buffer in de kamer met twee injecties en 10 minuten incubatie per opname. OPMERKING: De bereiding van gebiotinyleerd lambda-DNA wordt beschreven in een eerder gepubliceerd rapport34.</li>
</ol>2. Stroomcel aansluiten op het microfluïdische systeem en op de microscoop laden
<ol><li>Bereid Abo1-beeldvormingsbuffer voor (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1,6% glucose en 0,1x gloxy, zie Tabel met materialen). OPMERKING: Gloxy is een zuurstofopvangsysteem dat het fotobleken van fluorescerende kleurstoffen vermindert. De bereiding van 100x gloxy bouillon met glucoseoxidase en catalase wordt beschreven in referentie35.</li>
	<li>Sluit een spuit met 10 ml beeldvormingsbuffer aan op een spuitpomp en verwijder luchtbellen in alle slangleidingen in het microfluïdische systeem.</li>
	<li>Koppel de voorbereide flowcel aan het microfluïdische systeem via een drop-to-drop-verbinding om te voorkomen dat er bellen in de flowcel worden geïnjecteerd (Figuur 1B).</li>
	<li>Monteer de flowcel en flowcelhouders en monteer het geheel op een op maat gemaakte TIRF-microscoop (Figuur 1C). LET OP: Wanneer de flowcel onder de microscoop wordt geplaatst, stelt u zorgvuldig de hoogte van de objectieflens in. De stroomcel mag de objectieflens niet raken. Dit kan de lens beschadigen.</li>
	<li>Druppelindex bijpassende olie op het midden van de stroomcel en plaats een op maat gemaakt duifprisma (zie Materiaaltabel) op de oliedruppel.</li>
</ol>3. Histon-assemblage door Abo1 met behulp van DNA-gordijn
<ol><li>Meng 5 nM Abo1 en 12,5 nM Cy5-gelabeld H3-H4-histondimeer (Cy5-H3-H4) (zie Materiaaltabel) in 150 μL beeldbuffer. Alle eiwitten werden bereid volgens eerder gepubliceerd rapport17.</li>
	<li>Incubeer het mengsel 15 minuten op ijs. OPMERKING: Om fotobleken van Cy5 te voorkomen, moet de incubatie in het donker gebeuren.</li>
	<li>Injecteer ~20 pM (2 μL) YOYO-1-kleurstof in beeldvormingsbuffer door een monsterlus van 100 μL om lambda-DNA-moleculen te kleuren.</li>
	<li>Voer beeldvormingssoftware uit (zie Tabel met materialen) en zet de 488 nm-laser aan om te controleren of DNA-gordijnen goed gevormd zijn. OPMERKING: Als DNA-gordijnen goed gevormd zijn, worden de DNA-moleculen, die zijn gekleurd met YOYO-1, weergegeven als uitgelijnde lijnen bij een barrière in aanwezigheid van stroming. De uitgerekte lijnen deinzen terug en diffunderen weg van de barrière wanneer de stroom wordt uitgeschakeld.</li>
	<li>Injecteer 2 ml buffer met een hoog zoutgehalte (200 mM NaCl en 40 mM MgCl2) om de kleurstof YOYO-1 uit het DNA te verwijderen.</li>
	<li>Nadat de kleurstof YOYO-1 is verwijderd, injecteert u het vooraf geïncubeerde eiwitmonster.</li>
	<li>Wanneer de eiwitten het DNA-gordijn bereiken, zet u de spuitpomp uit, schakelt u de afsluiter uit en incubeert u 15 minuten voor het laden van histon door Abo1.</li>
	<li>Spoel de ongebonden Abo1- en histon-eiwitten gedurende 5 minuten uit.</li>
	<li>Schakel de afsluiter in en hervat de stroominjectie.</li>
	<li>Schakel de 637 nm-laser in en breng de fluorescerende eiwitten in beeld terwijl de bufferstroom is ingeschakeld.</li>
	<li>Schakel tijdelijk de bufferstroom uit om te controleren of histon-eiwitten op DNA zijn geladen (Figuur 2C).</li>
	<li>Verzamel DNA-gordijnbeelden met een beeldacquisitieprogramma (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Wanneer de bufferstroom tijdelijk stopt, deinst DNA terug uit het vluchtige veld van totale interne reflectie en verdwijnen fluorescerend gelabelde eiwitten die aan DNA zijn gebonden.</li>
</ol>4. Data-analyse
<ol><li>Zet de foto's die door het beeldacquisitieprogramma zijn gemaakt om in TIFF-formaat als beeldsequenties. OPMERKING: Alle gegevens zijn geanalyseerd met behulp van afbeelding J (NIH) zoals beschreven in referentie20.</li>
	<li>Kies een enkel DNA-molecuul uit de beeldsequenties en teken een kymograaf. OPMERKING: De kymograaf kan de verandering in fluorescentie-intensiteit van elk histon-eiwit dat aan een enkel DNA-molecuul is gebonden, laten zien als functie van de tijd.</li>
	<li>Maak het fluorescentie-intensiteitsprofiel van de kymograaf en pas het aan met meerdere Gaussiaanse functies.</li>
	<li>Verzamel de middelste coördinaten van pieken uit het fluorescentie-intensiteitsprofiel. In deze stap kan de minimale intensiteit van histonfluorescentie worden verkregen.</li>
	<li>Deel alle piekintensiteiten die uit de profielen zijn verzameld door de minimale intensiteit. Het aantal H3-H4-dimeren dat aan DNA is gebonden, wordt in deze stap geschat.</li>
	<li>Voer stap 4.2-4.5 uit voor andere DNA-moleculen.</li>
	<li>Maak een histogram voor de bindingsverdeling van H3-H4-dimeren met een opslaglocatiegrootte van 1 kbp. Het aantal geanalyseerde moleculen is minimaal 300.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Als beeldvormingstechniek met één molecuul is DNA-gordijn op grote schaal gebruikt om DNA-metabolische reacties te onderzoeken43. DNA-gordijn is een hybride systeem dat lipidevloeibaarheid, microfluïdica en TIRFM samenvoegt. In tegenstelling tot andere technieken met één molecuul, maakt DNA-gordijn real-time visualisatie van eiwit-DNA-interacties met hoge doorvoer mogelijk. Daarom is de DNA-gordijntechniek geschikt voor het onderzoeken van het mechanisme achter moleculaire interacties, waaronder s...

Eukaryotisch DNA is verpakt in een structuur van hogere orde die bekend staat als chromatine 1,2. Nucleosoom is de fundamentele eenheid van chromatine, die bestaat uit ongeveer 147 bp DNA gewikkeld rond de octamere kernhistonen 3,4. Chromatine speelt een cruciale rol in eukaryote cellen; de compacte structuur beschermt bijvoorbeeld DNA tegen endogene factoren en exogene bedreigingen5. De chromatinestructuur verandert dynamisch afhankelijk van de fase van de celcyclus en omgevingsstimuli, en deze veranderingen regelen de toegang tot eiwitten tijdens DNA-transacties zoals replicatie, transcriptie en reparatie6. Chromatinedynamiek is ook belangrijk voor genomische stabiliteit en epigenetische informatie.
Chromatine wordt dynamisch gereguleerd door verschillende factoren, waaronder histonstaartmodificaties en chromatine-organisatoren zoals chromatine-remodelers, polycomb-groepeiwitten en histon-chaperonnes7. Histon-chaperonnes coördineren de assemblage en demontage van nucleosomen via afzetting of onthechting van kernhistonen 8,9. Defecten in histon-chaperonnes veroorzaken genoominstabiliteit en veroorzaken ontwikkelingsstoornissen en kanker 9,10. Verschillende histonchaperonnes hebben geen chemisch energieverbruik zoals ATP-hydrolyse nodig om nucleosomen te assembleren of te demonteren 9,11,12,13. Onlangs meldden onderzoekers dat broomdomein-bevattende AAA+ (ATPase geassocieerd met diverse cellulaire activiteiten) ATPases een rol spelen in de chromatinedynamiek als histonchaperonnes 14,15,16,17. Humaan ATAD2 (ATPase-familie AAA-domeinbevattend eiwit 2) bevordert de toegankelijkheid van chromatine om de genexpressie te verbeteren18. Als transcriptionele co-regulator reguleert ATAD2 het chromatine van oncogene transcriptionele factoren14, en de overexpressie van ATAD2 is gerelateerd aan een slechte prognose bij veel soorten kanker19. Yta7, de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homoloog van ATAD2, verlaagt de nucleosoomdichtheid in chromatine15. Abo1 daarentegen, de Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homoloog van ATAD2, verhoogt de nucleosoomdichtheid16. Met behulp van een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul, DNA-gordijn, wordt nagegaan of Abo1 bijdraagt aan nucleosoomassemblage of -demontage17,20.
Traditioneel worden de biochemische eigenschappen van biomoleculen onderzocht door middel van bulkexperimenten zoals de elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest (EMSA) of co-immunoprecipitatie (co-IP), waarbij een groot aantal moleculen wordt onderzocht en hun gemiddelde eigenschappen worden gekarakteriseerd21,22. In bulkexperimenten worden moleculaire subtoestanden versluierd door het ensemble-gemiddelde effect en zijn het onderzoeken van biomoleculaire interacties beperkt. Daarentegen omzeilen technieken met één molecuul de beperkingen van bulkexperimenten en maken ze de gedetailleerde karakterisering van biomoleculaire interacties mogelijk. In het bijzonder zijn beeldvormingstechnieken met één molecuul op grote schaal gebruikt om DNA-eiwit en eiwit-eiwitinteracties te bestuderen23. Een van die technieken is DNA-gordijn, een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul op basis van microfluïdica en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM)24,25. In een DNA-gordijn zijn honderden individuele DNA-moleculen verankerd aan de lipidedubbellaag, die de tweedimensionale beweging van DNA-moleculen mogelijk maakt als gevolg van lipidevloeibaarheid. Wanneer hydrodynamische stroming wordt toegepast, bewegen DNA-moleculen langs de stroom op de dubbellaag en komen vast te zitten bij een diffusiebarrière, waar ze worden uitgelijnd en uitgerekt. Terwijl DNA wordt gekleurd met intercalerende middelen, worden fluorescerend gelabelde eiwitten geïnjecteerd en wordt TIRFM gebruikt om eiwit-DNA-interacties in realtime te visualiseren op een niveau van één molecuul23. Het DNA-gordijnplatform vergemakkelijkt de observatie van eiwitbewegingen zoals diffusie, translocatie en botsing 26,27,28. Bovendien kan DNA-gordijn worden gebruikt voor het in kaart brengen van eiwitten op DNA met gedefinieerde posities, oriëntaties en topologieën of worden toegepast op de studie van fasescheiding van eiwitten en nucleïnezuren 29,30,31.
In dit werk wordt de DNA-gordijntechniek gebruikt om bewijs te leveren voor de functie van chaperonnes door middel van directe visualisatie van specifieke eiwitten. Omdat DNA-gordijn een high-throughput-platform is, vergemakkelijkt het bovendien een mate van gegevensverzameling die voldoende is voor statistische betrouwbaarheid. Hier wordt beschreven hoe de DNA-gordijntest in detail kan worden uitgevoerd om de moleculaire rol van S. pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase Abo1 te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>1 mL luer-lock syringe</td><td>BecktonDickinson</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>1' x 3' fused-silca slide glass</td><td>G. Finkenbeiner</td><td></td><td>1 inch x 3 inch rechthoekig en 1 mm dik</td></tr><tr><td>10 mL luer-lock syringe</td><td>BecktonDickinson</td><td>302149</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&Delta;9-Cis) PC (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Dit is een component van biotinyleerd lipid stock</td></tr><tr><td>18:1 Biotinyl cap PE</td><td>Avanti</td><td>870273</td><td>Dit is een component van biotinyleerd lipid stock</td></tr><tr><td>18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>Dit is een component van biotinyleerd lipid stock</td></tr><tr><td>3 mL luer-lock syringe</td><td>BecktonDickinson</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>6-way sample injection valve</td><td>IDEX</td><td>MX series II</td><td></td></tr><tr><td>950K PMMA</td><td>All-resist</td><td>671.04</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>SAMCHUN</td><td>A1759</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5'-trifosfaat dinatriumzout hydraat (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium (Al)</td><td>TASCO, Zuid-Korea</td><td>LT50AI414</td><td>Diameter 4 inch, dikte 1/4 inch</td></tr><tr><td>Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa</td><td>Millipore</td><td>Z648027</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Mbcell</td><td>MB-A4128</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF developer</td><td>Merck</td><td>10454110521</td><td>Gebruikt voor het verwijderen van aluminium</td></tr><tr><td>Mes</td><td>DORCO</td><td>DN52</td><td>12 mm x 6 m</td></tr><tr><td>Boriumtrichloride (BCl3)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Zuiverheid: >99,99%</td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40-1g</td><td>Dit is een component van 100x gloxy stock</td></tr><tr><td>Chloor (Cl2)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Zuiverheid: >99,99%</td></tr><tr><td>Klaar dubbelzijdig plakband</td><td>3M</td><td>313770</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DC sputter</td><td>Sorona</td><td>SRM-120</td><td>Gebruikt voor het deponeren van aluminium op een dia</td></tr><tr><td>Met diamant gecoat boortje</td><td>Eurotool</td><td>DIB-211.00</td><td>Gebruikt voor het maken van gaten in een gefuseerde silica-slide</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Duif prisma</td><td>Korea Electro-Optics Co. Ltd.</td><td>1906-106</td><td>Op maat gemaakte gefuseerde silica duif prisma met anti-reflectie coating</td></tr><tr><td>Boor</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000</td><td>Gebruikt voor het maken van gaten in een gefuseerde silica slide</td></tr><tr><td>Elektronenstraal litografie</td><td>Nanobeam Ltd.</td><td>NB3</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleen-diamine-tetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fingertight fittingen</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td>Dit wordt verbonden met "PFA Tubing Natural" om luer-lock buizen te vormen</td></tr><tr><td>Flangeless mannelijke moer</td><td>IDEX</td><td>P-235</td><td>Dit wordt verbonden met "PFA Tubing Natural" om luer-lock buizen te vormen</td></tr><tr><td>Freeze Dryer, HyperCOOL</td><td>Labogene</td><td>HC3110</td><td>Gebruikt voor het lyofiliseren van vloeibare eiwitten</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133-50KU</td><td>Dit is een component van 100x gloxy stock</td></tr><tr><td>Guanidin hydrochloride</td><td>Acros Organics</td><td>364790025</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton spuit</td><td>Hamilton Company</td><td>80065</td><td>Deze spuit wordt gebruikt voor monsterinjectie</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-36</td><td>Gebruikt voor FPLC (grootte uitsluiting)</td></tr><tr><td>Hot plate roerder</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Sigma</td><td>H1759</td><td>Gebruikt voor Tris-HCl</td></tr><tr><td>Index matching olie</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Inductief gekoppelde plasma-reactieve ion etch</td><td>Top Technology Ltd.</td><td>FabStar</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Glentham Life Sciences</td><td>GC6586-100g</td><td>Gebruikt voor inductie van &beta;-galactosidase activiteit</td></tr><tr><td>Lambda faag DNA</td><td>NEB</td><td>N0311</td><td></td></tr><tr><td>LB bouillon</td><td>BD difco</td><td>244610</td><td>Media voor E.coli celgroei</td></tr><tr><td>Luer adapter 10-32</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td>Dit verbindt luer-lock spuit en buis</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>fisher bioreagents</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>Methyl isobutyl keton (MIBK)</td><td>KAYAKU ADVANCED MATERIALS</td><td></td><td>Gebruikt voor ontwikkelingsoplossing</td></tr><tr><td>Microscoop (Eclipse Ti2)</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>Omgekeerde fluorescentie microscoop</td></tr><tr><td>Microscoop glasdeksel</td><td>MARIENFELD</td><td>101142</td><td>22 x 50 mm (Nr. 1)</td></tr><tr><td>Microscoop dia</td><td>DURAN GROUP</td><td>DU.2355013</td><td>Dia glas gemalen rand 45&deg;, gewoon 26 x 76 mm</td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>IDEX</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>Objectieflens</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat VC 60XC WI</td><td>Type immersie: water, vergroting: 60x, correctie: 18, werkafstand: 0,29 (0,31-0,28)</td></tr><tr><td>One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemisch competente E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C6060-03</td><td>Competent cel voor overexpressie van eiwitten</td></tr><tr><td>Zuurstof (O2)</td><td>NOBLEGAS, Zuid-Korea</td><td></td><td>Zuiverheid: >99,99%</td></tr><tr><td>PFA buis natuurlijk</td><td>IDEX</td><td>1512L</td><td>Dit wordt verbonden met "Fingertight Fittings" om lu

het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door dna-gordijntechniek

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatine is een structuur van hogere orde die eukaryotisch DNA verpakt. Chromatine ondergaat dynamische veranderingen afhankelijk van de fase van de celcyclus en als reactie op prikkels uit de omgeving. Deze veranderingen zijn essentieel voor genomische integriteit, epigenetische regulatie en DNA-metabole reacties zoals replicatie, transcriptie en reparatie. Chromatine-assemblage is cruciaal voor de chromatinedynamiek en wordt gekatalyseerd door histon-chaperonnes. Ondanks uitgebreide studies blijven de mechanismen waarmee histon-chaperonnes chromatine-assemblage mogelijk maken, ongrijpbaar. Bovendien worden de globale kenmerken van nucleosomen georganiseerd door histon-chaperonnes slecht begrepen. Om deze problemen aan te pakken, beschrijft dit werk een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul, DNA-gordijn genaamd, die het onderzoek van de moleculaire details van nucleosoomassemblage door histon-chaperonnes vergemakkelijkt. DNA-gordijn is een hybride techniek die lipidevloeibaarheid, microfluïdica en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM) combineert om een universeel platform te bieden voor real-time beeldvorming van diverse eiwit-DNA-interacties. Met behulp van DNA-gordijn wordt de histon-chaperonnefunctie van Abo1, het Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattende AAA+ ATPase, onderzocht en wordt het moleculaire mechanisme dat ten grondslag ligt aan histonassemblage van Abo1 onthuld. DNA-gordijn biedt een unieke benadering voor het bestuderen van chromatinedynamiek.

Dit werk beschrijft de procedure voor de voorbereiding van flowcellen voor de DNA-gordijntest (Figuur 1A). De DNA-gordijntest vergemakkelijkte de studie van histon H3-H4-dimeerassemblage op DNA door Abo1. Eerst werd de vorming van DNA-gordijnen gecontroleerd door DNA-moleculen te kleuren met YOYO-1, een intercalerende kleurstof. Groene lijnen werden getoond in parallelle arrays, wat aangeeft dat YOYO-1 intercaleerde in DNA-moleculen, die goed uitgelijnd waren en uitgerekt waren bij een diffu...

DNA-gordijn, een high-throughput single-molecule beeldvormingstechniek, biedt een platform voor real-time visualisatie van diverse eiwit-DNA-interacties. Het huidige protocol maakt gebruik van de DNA-gordijntechniek om de biologische rol en het moleculaire mechanisme van Abo1 te onderzoeken, een Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase.

Het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door DNA-gordijntechniek

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Dit protocol laat zien hoe DNA-gordijntechniek wordt gebruikt voor het bestuderen van chromatinedynamica, in het bijzonder het onderzoeken van de moleculaire functie van histon-chaperonnes. High-throughput single-molecule beeldvormingstechniek DNA-gordijn overwint de beperkingen van bulkexperimenten en vergemakkelijkt real-time beeldvorming, waardoor de gedetailleerde karakterisering van biomolecuulinteracties mogelijk wordt. Leg een schoon papier van 5 bij 35 millimeter op het midden van de dubbelzijdige tape.Bevestig de tape over de dia om de twee gaten en nanopatronen met het papier te bedekken. Snijd het papier vervolgens weg met een schoon mes. Plaats een glazen afdekglaasje op de dubbelzijdige tape en wrijf met een pipetpunt over het dekglaasje om een microfluïdische kamer te vormen.Plaats de geassembleerde stroomcel tussen twee microscoopglaasjes en klem ze vast. Bak de flowcel 45 minuten in een vacuümoven van 120 graden Celsius. Bevestig de vloeistofconnector voor de spaananalyse aan elk open gat met behulp van een heet lijmpistool.En verbind de twee lijnen van de slang van het kunstaasslot. Sluit een lokslotspuit met drie milliliter gedeïoniseerd water aan en was de kamer. Was de kamer opnieuw met drie milliliter lipidenbuffer via druppelsgewijze verbinding.Injecteer één milliliter 0,04x gebiotinyleerd lipide in lipidenbuffer, in de kamer, in twee shots, met een incubatie van vijf minuten per shot. Injecteer 0,025 milligram per milliliter streptavidine in één milliliter BSA, met twee injecties en een incubatie van 10 minuten per injectie. Injecteer ongeveer 30 picomolair gebiotinyleerd lambdafaag-DNA in één milliliter BSA-buffer, in de kamer met twee injecties en incubaties van 10 minuten per schot.Sluit een spuit met 10 milliliter beeldvormingsbuffer aan op een spuitpomp en verwijder luchtbellen in alle slangleidingen in het microfluïdische systeem. Koppel de voorbereide flowcel aan het microfluïdische systeem via een drop-to-drop-verbinding om te voorkomen dat luchtbellen in de flowcel worden geïnjecteerd. Monteer de flowcel en flowcelhouders en monteer het geheel op een op maat gemaakte, totale interne reflectiefluorescentiemicroscoop.Injecteer 200 microliter YOYO-1-kleurstof in de beeldvormingsbuffer door 100 microliter monsterlus om lambda-DNA-moleculen te kleuren. Voer beeldvormingssoftware uit en zet de laser van 488 nanometer aan om te controleren of DNA-gordijnen goed gevormd zijn. Nadat de kleurstof YOYO-1 is verwijderd, injecteert u het vooraf geïncubeerde eiwitmonster.Wanneer de eiwitten het DNA-gordijn bereiken, zet u de spuitpomp uit, schakelt u de afsluiter uit en incubeert u gedurende 15 minuten voor histonlading door Abo1. Spoel de ongebonden Abo1- en histon-eiwitten gedurende vijf minuten uit. Schakel tijdelijk de bufferstroom uit om te controleren of histon-eiwitten op DNA zijn geladen.De vorming van DNA-gordijnen werd gecontroleerd door DNA-moleculen te kleuren met een interpolerende kleurstof. Groene lijnen die in parallelle arrays werden getoond, gaven aan dat YOYO1 geïntercaleerd in DNA-moleculen goed uitgelijnd en uitgerekt was bij een diffusiebarrière onder hydrodynamische stroming. Wanneer Cy5-H3-H4-dimeren in het DNA-gordijn werden geïnjecteerd in afwezigheid van Abo1, bindde Cy5-H3-H4 niet aan DNA, wat wijst op een gebrek aan spontane binding van H3-H4-dimeren aan DNA.Toen Cy5-H3-H4 werd geïnjecteerd met Abo1, werden rode fluorescerende puncta gezien op DNA-moleculen, wat suggereert dat Abo1 H3-H4-dimeren op DNA laadt. De fluorescerende signalen verdwenen bij afwezigheid van bufferstroom en verschenen weer toen de stroom werd hervat, wat suggereert dat H3-H4-dimeren binden aan DNA. De binding van H3-H4-dimeren aan DNA werd ook bevestigd door de kymograaf, waarbij de fluorescentiesignalen verdwenen wanneer de stroom werd uitgeschakeld.Er verschenen weinig fluorescerende puncta in het DNA-gordijn, hetzij in afwezigheid van nucleotide, hetzij in aanwezigheid van ADP, wat aangeeft dat H3-H4-dimeren zelden binden aan DNA, noch in de Apo-toestand, noch in aanwezigheid van ADP. De kwantitatieve analyse laat zien dat het aantal H3-H4-dimeren gebonden aan DNA toeneemt in aanwezigheid van ATP. De resultaten suggereren dat ATP-hydrolyse essentieel is voor H3-H4-lading op DNA door Abo1.Het vermijden van belleninjectie in de stroomcel is het meest kritisch voor alle stappen. Dus in dit protocol leggen we de nadruk op drop-by-drop verbindingen. DNA-gordijntest kan worden uitgebreid tot DNA-gordijnen met dubbele ketting en dubbele nanopatronen.Daarnaast kunnen we een ander type DNA-gordijn maken met enkelstrengs DNA-, RNA- of actinefilamenten. DNA-gordijn maakt visualisatie van eiwitbeweging op DNA mogelijk en vergemakkelijkt het bestuderen van het zoekmechanisme van het doelwit. DNA-gordijn kan worden verlengd voor het bestuderen van DNA-metabolisme, inclusief replicatie en transcriptie.

deciphering-molecular-mechanism-histone-assembly-dna-curtain

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

De 3DNA softwarepakket is een populaire en veelzijdige bioinformatica tool met mogelijkheden om te analyseren, construeren, en drie-dimensionale nucleïnezuur structuren te visualiseren. Dit artikel presenteert gedetailleerde protocollen voor een subset van nieuwe en populaire functies die beschikbaar zijn in 3DNA, van toepassing op zowel individuele structuren en ensembles van verwante structuren.

Het analyseren en opbouwen nucleinezuurstructuren met 3DNA

This video describes a method to visualize the assembly of fusion protein condensates on DNA molecules at specific loci using single-molecule imaging. These condensates are formed due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, which allow for the recruitment of RNA polymerase II and enhanced gene transcription.

Single-Molecule Imaging to Visualize Fusion Protein Condensates Assembly on DNA Curtains

Een methode wordt gepresenteerd voor de reconstructie van model nucleosomale arrays van recombinante kernhistonen en tandem herhaalde nucleosoom positionering DNA. We beschrijven ook hoe sedimentatiesnelheid experimenten analytische ultracentrifuge en atomic force microscopie (AFM) worden gebruikt voor het monitoren van de mate van nucleosomale matrix verzadiging na reconstitutie.

Assemblage van Nucleosomale Arrays van Recombinant kernhistonen en Nucleosome Positioning DNA

Gerichte DNA-schade kan worden bereikt door een DNA-beschadigend middel aan een triplex-vormend oligonucleotide (TFO) te koppelen. Met behulp van gemodificeerde TFO's kunnen DNA-schade-specifieke eiwitassociatie en DNA-topologiemodificatie in menselijke cellen worden bestudeerd door het gebruik van gemodificeerde chromatine-immunoprecipitatie-assays en DNA-superspiralisatie-assays zoals hier beschreven.

Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks

Hier presenteren we een protocol karakteriseren nucleosoom deeltjes op het niveau van de single-molecuul met behulp van statische en time-lapse atomaire kracht microscopie (AFM) beeldvormende technieken. De beschreven methode van oppervlakte functionalization zorgt voor de opname van de structuur en de dynamiek van nucleosomes in hoge resolutie op nanoschaal.

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Hier beschrijven we het gebruik van de single-molecule beeldvormingsmethode, DNA Curtains, om het biofysische mechanisme van EWS-FLI1-condensaten te bestuderen die zich op DNA assembleren.

Single-molecule Imaging van EWS-FLI1 condensaten assembleren op DNA

De interactie van een ATP-afhankelijke chromatine remodeller met een DNA-ligand wordt beschreven met behulp van CD-spectroscopie. De geïnduceerde conformatieveranderingen op een genpromotor geanalyseerd door de gegenereerde pieken kunnen worden gebruikt om het mechanisme van transcriptionele regulatie te begrijpen.

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Dit protocol beschrijft de Capture Hi-C-methode die wordt gebruikt om de 3D-organisatie van megagebaseerde gerichte genomische regio's met hoge resolutie te karakteriseren, inclusief grenzen van topologisch associërende domeinen (TAD's) en chromatine-interacties op lange afstand tussen regulerende en andere DNA-sequentie-elementen.

Ontcijferen van 3D-chromatineorganisatie met hoge resolutie via Capture Hi-C

Dit artikel presenteert een gedetailleerde experimentele procedure voor het reconstrueren van nucleosoombevattende DNA-kettingen voor correlatieve kracht en fluorescentiemicroscopie van één molecuul. Het beschrijft verder verschillende stroomafwaartse experimenten die kunnen worden uitgevoerd om het bindingsgedrag van chromatine-interagerende eiwitten te visualiseren en veranderingen in de fysische eigenschappen van nucleosomen te analyseren.

In situ nucleosoomassemblage voor correlatieve kracht van één molecuul en fluorescentiemicroscopie

Ontdek de DNA-gordijntechniek voor real-time visualisatie van eiwit-DNA-interacties met Abo1 in Schizosaccharomyces pombe. Deze methode onthult moleculaire mechanismen van chromatindynamica.

Het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door DNA-gordijntechniek

Meer video's verkennen