Name: Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer een chirurgische methode voor het verwijderen van één oog bij levende zebravislarven om de invloed van retinale input op de ontwikkeling van de optische tectum te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering voor dit werk werd voornamelijk ondersteund door start-upfondsen van Reed College tot KLC, Helen Stafford Research Fellowship-fondsen tot OLH en een Reed College Science Research Fellowship tot YK. Dit project begon in het lab van Steve Wilson als een samenwerking met HR, die werd ondersteund door een Wellcome Trust Studentship (2009-2014). We bedanken Máté Varga, Steve Wilson en andere leden van het Wilson-lab voor de eerste discussies over dit project, en we bedanken in het bijzonder Florencia Cavodeassi en Kate Edwards, die KLC als eersten leerden hoe ze embryo's in agarose konden monteren en hersendissecties van zebravissen konden uitvoeren. We bedanken ook Greta Glover en Jay Ewing voor hun hulp bij het in elkaar zetten van ons wolfraam naaldslijpapparaat.

<ol><li>Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButler%2C+AB+%22Comparative+Vertebrate+Neuroanatomy%3A+Evolution+and+Adaptation%22">Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).</li>
<li>Cang, J., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+mechanisms+of+topographic+map+formation+and+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment.</a> Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).</li>
<li>Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+circuits+of+visual+perception+and+cognition+through+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus.</a> Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).</li>
<li>Burrill, J. D., Easter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+retinofugal+projections+in+the+embryonic+and+larval+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio).</a> The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).</li>
<li>Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/</a> (2021).</li>
<li>Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/</a> (2021).</li>
<li>Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continued+growth+and+circuit+building+in+the+anamniote+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Continued growth and circuit building in the anamniote visual system.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).</li>
<li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).</li>
<li>Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+has+a+specific+influence+on+optic+nerve+and+tectum+development+in+the+blind+cavefish+Astyanax%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax.</a> Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).</li>
<li>White, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+study+of+the+relationship+between+the+size+of+the+eye+and+the+size+of+the+optic+tectum+in+the+brain+of+the+developing+teleost%2C+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus.</a> Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).</li>
<li>Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+growth+of+the+optic+tectum+in+goldfish.+II.+Modulation+of+cell+proliferation+by+retinal+fiber+input%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input.</a> The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).</li>
<li>Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+input-dependent+regulation+of+neural+stem+cell+proliferation+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).</li>
<li>Hall, Z. J., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+experience+facilitates+BDNF-dependent+adaptive+recruitment+of+new+neurons+in+the+postembryonic+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marc%27s+modified+Ringer%27s+%28MMR%29+%2810X%2C+pH+7.4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li>
<li>Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+dissection+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Development%22%5BJournal%5D)">Anatomical dissection of zebrafish brain development.</a> Brain Development. 1082, 197-214 (2014).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
<li>ZFIN Tricaine recipe. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</a> (2018).</li>
<li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028(2010).</li>
<li>ZFIN protocols. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview</a> (2021).</li>
<li>Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+subcellular+structures+in+the+living+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456(2016).</li>
<li>ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://figi.sc/">https://figi.sc/</a> (2021).</li>
<li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).</li>
<li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).</li>
<li>Karlstrom, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutations+affecting+retinotectal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding.</a> Development. 123 (1), 427-438 (1996).</li>
<li>Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+regeneration+in+larval+zebrafish+exhibits+spontaneous+capacity+for+retinotopic+but+not+tectum+specific+axon+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting.</a> PLOS ONE. 14 (6), 0218667(2019).</li>
<li>Robles, E., Filosa, A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+lamination+of+retinal+axons+generates+multiple+parallel+input+pathways+in+the+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).</li>
<li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).</li>
<li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li>
<li>de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+physiological+analysis+in+a+zebrafish+model+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837(2021).</li>
<li>Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+external+medium+composition+on+membrane+water+permeability+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).</li>
<li>Fredj, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation%2C+growth+arrest%2C+and+territory+in+the+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li>
<li>Alberio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-gated+potassium+channel+for+sustained+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition.</a> Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).</li>
<li>Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+genesis+requires+lakritz%2C+a+zebrafish+atonal+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog.</a> Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).</li>
<li>Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+activity-deprived+zebrafish+mutant+macho+reveals+an+essential+requirement+of+neuronal+activity+for+the+development+of+a+fine-grained+visuotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astyanax+surface+and+cave+fish+morphs%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Astyanax surface and cave fish morphs.</a> EvoDevo. 11 (1), 14(2020).</li>
<li>Sieger, D., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studying+microglia%3A+The+first%2C+the+popular%2C+and+the+new%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new.</a> Glia. 61 (1), 3-9 (2013).</li>
<li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).</li>
<li>Herzog, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+clearance+of+cellular+debris+by+microglia+limits+secondary+neuronal+cell+death+after+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo.</a> Development. 146 (9), (2019).</li>
<li>Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+astrocyte+morphogenesis+and+function+in+zebrafish+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

De technieken die in dit artikel worden beschreven, illustreren een van de vele benaderingen voor het bestuderen van de ontwikkeling van visuele systemen van gewervelde dieren bij zebravissen. Andere onderzoekers hebben methoden gepubliceerd om het embryonale netvlies te ontleden en genexpressieanalyses19 uit te voeren of neuronale activiteit in het optische tectum30 te visualiseren. Dit artikel biedt een benadering voor het onderzoeken hoe differentiële retinale input het ...

Het doel van deze methode is om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum, het visuele verwerkingscentrum in het zebravisbrein, beïnvloedt. Door één oog te verwijderen en vervolgens de twee zijden van het optische tectum te vergelijken, kunnen tectale veranderingen binnen hetzelfde monster worden waargenomen en genormaliseerd, waardoor vergelijking tussen meerdere monsters mogelijk is. Moderne moleculaire benaderingen in combinatie met deze techniek zullen inzicht geven in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de groei en ontwikkeling van visuele systemen, evenals axonale degeneratie en regeneratie.
Sensorische systemen - visueel, auditief en somatosensorisch - verzamelen informatie van externe organen en geven die informatie door aan het centrale zenuwstelsel, waardoor "kaarten" van de externe wereld in de middenhersenen worden gegenereerd 1,2. Visie is de dominante sensorische modaliteit voor bijna alle gewervelde dieren, inclusief veel vissen. Het netvlies, het neurale weefsel in het oog, verzamelt informatie met een neuronaal circuit dat voornamelijk bestaat uit fotoreceptoren, bipolaire cellen en retinale ganglioncellen (RGC's), de projectieneuronen van het netvlies. RGC's hebben lange axonen die hun weg vinden over het binnenoppervlak van het netvlies naar de oogzenuwkop, waar ze fasciculeren en samen door de hersenen reizen, uiteindelijk eindigend in het visuele verwerkingscentrum in de dorsale middenhersenen. Deze structuur wordt het optische tectum genoemd bij vissen en andere niet-zoogdiergewervelde dieren en is homoloog aan de superieure colliculus bij zoogdieren3.
Het optische tectum is een bilateraal symmetrische meerlagige structuur in de dorsale middenhersenen. Bij zebravissen en de meeste andere vissen ontvangt elke kwab van het optische tectum alleen visuele input van het contralaterale oog, zodat de linker oogzenuw eindigt in de rechter tectale kwab en de rechter oogzenuw eindigt in de linker tectalkwab4 (figuur 1). Net als zijn tegenhanger bij zoogdieren, de superieure colliculus, integreert het optische tectum visuele informatie met andere sensorische inputs, waaronder auditie en somatosensatie, waarbij verschuivingen in visuele aandacht en oogbewegingen zoals saccades 1,5,6 worden geregeld. In tegenstelling tot de superieure colliculus van zoogdieren genereert het optische tectum echter voortdurend nieuwe neuronen en glia uit een gespecialiseerde stamcelniche in de buurt van de mediale en caudale randen van de tectale kwabben die de tectale proliferatiezone7 worden genoemd. Het behoud van proliferatieve voorlopercellen in het optische tectum en andere regio's van het centrale zenuwstelsel draagt gedeeltelijk bij aan de opmerkelijke regeneratieve capaciteit die is gedocumenteerd bij zebravissen8.
Eerder onderzoek naar de hersenen van blinde of eenogige vissen onthulde dat de grootte van het optische tectum recht evenredig is met de hoeveelheid retinale innervatie die het ontvangt 9,10,11. Bij volwassen grotvissen, waarvan de ogen degenereren in vroege embryogenese, is het optische tectum merkbaar kleiner dan dat van nauw verwante, waargenomen oppervlaktevissen9. Cave fish eye degeneratie kan worden geblokkeerd door de endogene lens te vervangen door een lens van een oppervlaktevis tijdens embryogenese. Wanneer deze eenogige grotvissen volwassen worden gemaakt, bevat de geïnnerveerde tectale kwab ongeveer 10% meer cellen dan de niet-geïnnerveerde tectale kwab9. Evenzo was bij larvale killivissen die werden geïncubeerd met chemische behandelingen om ogen van verschillende groottes binnen hetzelfde individu te genereren, de kant van het tectum met meer innervatie groter en bevatte meer neuronen10. Bewijs van oogzenuwverpletteringsexperimenten bij volwassen goudvissen geeft aan dat innervatie proliferatie bevordert, waarbij de proliferatie van tectale cellen afneemt wanneer innervatie werd verstoord11.
Om deze klassieke studies te bevestigen en uit te breiden, bieden verschillende recente rapporten gegevens die suggereren dat proliferatie in reactie op innervatie, althans gedeeltelijk, wordt gemoduleerd door de BDNF-TrkB-route12,13. Veel open vragen over de groei en ontwikkeling van optische tectum blijven bestaan, waaronder hoe een zich ontwikkelend sensorisch systeem omgaat met letsel en axondegeneratie, welke cellulaire en moleculaire signalen retinale input mogelijk maken om de groei van het optische tectum te reguleren, wanneer deze mechanismen actief worden, en of innervatie-gekoppelde proliferatie en differentiatie het netvlies en zijn doelweefsel in staat stellen om groeisnelheden te coördineren en nauwkeurige retinotopische mapping te garanderen. Bovendien zijn er veel grotere vragen over activiteitsafhankelijke ontwikkeling die kunnen worden aangepakt door het visuele systeem van zebravissen te ondervragen met chirurgische benaderingen zoals hieronder beschreven.
Om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken waarmee neurale activiteit, met name uit visuele input, de overleving en proliferatie van cellen verandert, vergelijkt de beschreven benadering direct geïnnerveerde en gedenervateerde tectale kwabben (figuur 1) binnen individuele zebravislarven. Deze methode maakt het mogelijk om RGC axondegeneratie in het optische tectum te documenteren en te bevestigen dat het aantal mitotische cellen correleert met innervatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> Figuur 1: Schetsen van zebravislarven voor en na eenzijdige oogverwijdering. (A) Tekening van 5 dpflarven gezien onder een ontleedmicroscoop. Elke larve is ingebed in agarose met een laag smeltpunt en zijdelings georiënteerd voordat een wolfraamnaald met een scherpe, gehaakte punt wordt gebruikt om het oog naar boven te scheppen (linkeroog in dit voorbeeld). (B) Tekening van het dorsale beeld van een larve van 9 dpf als gevolg van de in A afgebeelde operatie. Slechts drie sterk geschematiseerde RGC-axonen uit het rechteroog worden getoond die zich defasciculeren en verbinden met neuronen in de linker tectalkwab. Afkortingen: dpf = dagen na de bevruchting; dps = dagen na de operatie; RGC = retinale ganglioncellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Uitrusting en benodigdheden:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fokkerijbakken</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning hoog vacuüm vet</td><td>Sigma of gelijkwaardige leverancier</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer kolven (125 mL)</td><td></td><td></td><td>Voor het maken van Marc's Modified Ringers (MMR) met antibiotica voor incubatie na de operatie.</td></tr><tr><td>Fijne pincetten - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Pasteur pipetten</td><td>DWK Lifescience</td><td>63A53 &amp; 63A53WT</td><td>Voor het pipetteren van embryo's en larven.</td></tr><tr><td>Glasmijt voor microscopie</td><td>VWR of gelijkwaardige leverancier</td><td>48311-703</td><td>Standaard glazen microscoopglazen kunnen bij veel verschillende laboratoriumleveranciers worden besteld.</td></tr><tr><td>Glaswerk inclusief afgemeten flessen en afgemeten cilinders</td><td></td><td></td><td>Voor het maken en opslaan van oplossingen.</td></tr><tr><td>2-delig epoxyhars</td><td>ACE Hardware of andere gelijkwaardige leverancier van Gorilla Glue of gelijkwaardig</td><td>0,85 oz spuit</td><td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuis (1,7 mL)</td><td>VWR of gelijkwaardige leverancier</td><td>22234-046</td><td></td></tr><tr><td>Met nikkel beplaat pin houder (17 cm lengte)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>26018-17</td><td>Om wolfraamdraad vast te houden tijdens het slijpen en uitvoeren van operaties/dissecties.</td></tr><tr><td>Nylon gaas theezeef of gelijkwaardig</td><td>Ali Express of gelijkwaardig</td><td></td><td>Voor het oogsten van zebravis eieren na het paaien; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td></tr><tr><td>Paperclip</td><td></td><td></td><td>Voor Tungsten naald slijpapparaat.</td></tr><tr><td>Petrischalen 100 mm</td><td>Fischer Scientific of gelijkwaardige leverancier</td><td>50-190-0267</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 35 mm</td><td>Fischer Scientific of gelijkwaardige leverancier</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Pipet pomp</td><td>SP Bel-Art of gelijkwaardig</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide (KOH)</td><td>Sigma</td><td>909122</td><td>Voor Tungsten naald slijpapparaat. Maak een 10% w/v oplossing van KOH in de kap door pellets toe te voegen aan gedeïoniseerd water.</td></tr><tr><td>Voeding (variabele spanning)</td><td></td><td></td><td>Voor Tungsten naald slijpapparaat. Elke voeding met variabele spanning zal werken (zelfs een die voor gelelektroforese wordt gebruikt).</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>Wolfraamdraad (0,125 mm diameter)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TGW0515</td><td>Slepen om oog te verwijderen en larven te dissecteren.</td></tr><tr><td>Temperatuurregelbare hitteblok</td><td>The Lab Depot of gelijkwaardige leverancier</td><td>BSH1001 of BSH1002</td><td>Vooraf ingesteld op 40-42 &deg;C.</td></tr><tr><td>Breedmond glazen pot met deksel (bijv. schone jam- of salsapot)</td><td></td><td></td><td>Voor Tungsten naald slijpapparaat.</td></tr><tr><td>Draad met alligator clip kabels</td><td></td><td></td><td>Voor Tungsten naald slijpapparaat.</td></tr><tr><td>Microscopen:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td></td><td></td><td>Elk type zal werken, maar het hebben van instelbare getransmetteerde licht op een gespiegelde basis wordt geprefereerd.</td></tr><tr><td>Laser scanning confocale microscoop</td><td></td><td></td><td>Hoog NA, 20-25x water dompel objectief lens wordt aanbevolen. Microscoop controle en beeldvastlegging software (NIS-Elements van Nikon) wordt hier gebruikt, maar elke confocale microscoop zal werken.</td></tr><tr><td>Reagentia voor operaties en dissecties:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Voor Marc's Modified Ringers (MMR) en embryo medium (E3).</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td>Voor Marc's Modified Ringers (MMR).</td></tr><tr><td>Laag smeltpunt agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>Maak 1% in embryo medium (E3) of Marc's Modified Ringers (MMR).</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td>Voor embryo medium (E3).</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>Voor Marc's Modified Ringers (MMR).</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td>Verdun 8% (w/v) stock met 2x geconcentreerd PBS (verdund uit 10x PBS stock).</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ML</td><td>Verdun 1:100 in Marc's Modified Ringers.</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tabletten</td><td>Diagnostic BioSystems</td><td>DMR E404-01</td><td>Maak 10x stock in gedeïoniseerd water, autoclaveer en bewaar op kamertemperatuur. Verdun tot 1x werkconcentratie.</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>Voor Marc's Modified Ringers (MMR) en embryo medium (E3).</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Voor Marc's Modified Ringers (MMR) en embryo medium (E3).</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Maak 10 M en gebruik om de pH van MMR aan te passen tot 7,4.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair</td><td>100G #TRS1</td><td>Recept: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td></tr><tr><td>Reagentia voor immunohistochemie:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 568 getagd secundair antilichaam om konijn IgG te detecteren</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Gebruik bij een 1:500 verdunning voor immunohistochemie van gehele mount.</td></tr><tr><td>DAPI of ToPro3</td><td>Invitrogen</td><td>1306 of T3605</td><td>Maak 1 mg/mL oplossingen in DMSO

oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebravissen vertonen opmerkelijke levenslange groei en regeneratieve vermogens. Gespecialiseerde stamcelniches die tijdens embryogenese zijn vastgesteld, ondersteunen bijvoorbeeld de continue groei van het hele visuele systeem, zowel in het oog als in de hersenen. Gecoördineerde groei tussen het netvlies en het optische tectum zorgt voor nauwkeurige retinotopische mapping als nieuwe neuronen worden toegevoegd in de ogen en hersenen. Om na te gaan of retinale axonen cruciale informatie leveren voor het reguleren van tectale stam- en voorlopercelgedrag zoals overleving, proliferatie en / of differentiatie, is het noodzakelijk om geïnnerveerde en gedenerveerde tectale kwabben binnen hetzelfde dier en tussen dieren te kunnen vergelijken. 
Chirurgische verwijdering van één oog van levende larvale zebravissen gevolgd door observatie van het optische tectum bereikt dit doel. De bijbehorende video laat zien hoe je larven kunt verdoven, wolfraamnaalden elektrolytisch kunt slijpen en ze kunt gebruiken om één oog te verwijderen. Het laat vervolgens zien hoe hersenen van vaste zebravislarven kunnen worden ontleed. Ten slotte biedt de video een overzicht van het protocol voor immunohistochemie en een demonstratie van het monteren van gekleurde embryo's in agarose met een laag smeltpunt voor microscopie.

Om te bevestigen of de oogverwijdering voltooid was en te beoordelen hoe het optische tectum verandert, werden operaties uitgevoerd in de Tg[atoh7:RFP]-stam, die alle RGC's labelt met een op het membraan gerichte RFP en dus alle axonen die uit het netvlies projecteren en de oogzenuw vormen24. Hoewel het gebruik van deze stam niet absoluut noodzakelijk is, maakt het eenvoudige observatie en visualisatie van de oogzenuw termini in de optische tectum neuropil mogelijk. Andere benaderingen vo...

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Dus mijn lab is geïnteresseerd in het begrijpen hoe het oog en de hersenen samen groeien. Deze techniek stelt ons in staat om te bestuderen hoe retinale input de groei en ontwikkeling van de hersenen beïnvloedt. Chirurgische verwijdering van één oog van de levende larvale zebravis, gevolgd door observatie van het optische tectum stelt ons in staat om geïnnerveerde en gedenerveerde tectale kwabben binnen hetzelfde dier en tussen dieren te vergelijken.Het combineren van deze techniek met moderne moleculaire benaderingen kan nieuw inzicht geven in mechanismen die ten grondslag liggen aan neurale ontwikkeling, regeneratie en degeneratie. Sluit om te beginnen de kathode- en anodedraden aan op de voeding. Bevestig de krokodillenclip aan het uiteinde van de kathodedraad aan een gedeeltelijk rechtgetrokken paperclip en steek de paperclip in de kaliumhydroxideoplossing en bevestig deze aan de zijkant van de pot.Bevestig de krokodillenclip van de anodedraad aan de hals van de naaldhouder. Draai het vermogen op ongeveer 20 volt en dompel de wolfraamdraad in de kaliumhydroxideoplossing, trek de draad onder een hoek uit de oplossing om de draad elektrolytisch te slijpen tot een fijne punt. Controleer de punt van de naald onder de ontleedmicroscoop om er zeker van te zijn dat deze scherp genoeg is.De gebogen naaldpunt ontstaat wanneer de scherpe naald wordt gebogen door deze zachtjes aan te raken aan de petrischaal. Gebruik op de dag van de operatie een glazen weidepipet met brede boring om 10 tot 15 larven over te brengen naar een petrischaaltje van 35 millimeter gevuld met verse E3. Voeg drie tot vijf druppels verdovingsmiddel toe aan de larve. Om te bepalen of de larven voldoende worden verdoofd, zoekt u naar een gebrek aan aanraakrespons.Voeg nog twee tot drie druppels van het verdovingsmiddel toe als de larven na drie minuten nog steeds reageren op aanraking en beoordeel het opnieuw. Om de larve te immobiliseren voor een operatie, neemt u één larve in een smalle glazen weidepipet met slechts een kleine hoeveelheid E3. Neem vervolgens ongeveer 200 microliter gesmolten 1% laag smeltpunt of LMP-agarose op in de pipet met de larve en meng om ervoor te zorgen dat de larve in de LMP-agarose wordt gesuspendeerd. Plaats het deksel van een petrischaaltje van 35 millimeter met het gezicht naar boven onder de ontleedmicroscoop en spuit vervolgens de larve en de agarose op het omgekeerde petrischaaldeksel.Verspreid de agarose zodat de larve zich in het midden van de druppel bevindt. Gebruik een doffe wolfraamnaald en manoeuvreer de larve snel maar voorzichtig zodat deze lateraal is met één oog naar boven gericht. Wacht enkele minuten tot de agarose is uitgeschakeld.Gebruik na de rand van de oogbaan de punt van een fijne elektrolytisch geslepen wolfraamnaald om de huid rond het oog te doorboren. Schuif vervolgens de rand van de naald onder het oog vanaf de temporale ventrale kant van het oog. Gebruik gecontroleerde druk om het oog uit de oogkas te halen.Blijf het oog dorsaal en anterieur indrukken met de zijkant van de naald, snijd uiteindelijk door de oogzenuw en laat het oog los. Als alternatief kunt u een zeer fijne chirurgische tang gebruiken om het oog te verwijderen door de oogzenuw te knijpen en het oog van mediaal naar lateraal te duwen. Na succesvolle oogverwijdering, bedek de agarose met MMR-oplossing, bevrijd elke larve van de agarose door voorzichtig een wolfraamnaald rond hun hoofd en vervolgens rond hun lichaam te borstelen, terwijl het petrischaaldeksel met een tang wordt gestabiliseerd.Plaats de larve na de operaties in MMR-oplossing aangevuld met antibiotica tot de volgende dag, breng de larve vervolgens terug naar E3 en fok ze tot het eindpunt van het experiment. Nadat de larve terminaal is verdoofd, fixeert u ze met 4% paraformaldehyde. Hang de vaste larven in PBS-druppels op een sealguardplaat onder een ontleedmicroscoop.Zet ze zijdelings vast door twee wolfraampennen door het notochord te plaatsen met één pin achteraan op het gepigmenteerde gebied dat het AGM-gebied bedekt en een andere in lijn met het uiteinde van de dooierverlenging. Verwijder het oog met een scherpe wolfraamnaald en fijne tang. Soms is het mogelijk om de naald door de kaak naar de andere kant te steken en het andere oog te verwijderen.Gebruik de wolfraamnaald om van de temporale naar de ventrale kant van het oor te krabben. Breng in dezelfde actie in beweging de naald achteraan naar de kaak en trek zachtjes naar voren totdat het oor en de kaak zijn verwijderd. Verwijder het andere oog en oor door de naald door de kaak te prikken.Gebruik een tang om de ventrale organen en de resterende dooier eruit te trekken. Maak ten slotte een ondiepe incisie in de dorsale schedelhuid in de buurt van de kruising tussen de achterhersenen en het ruggenmerg. Til de huid op met de tang en trek deze vooraan en rond het telencephalon.Verwijder eventueel achtergebleven weefsel met een tang. Maak de larve los en breng over op PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Bevestig een kamerschuif in het deksel van een petrischaaltje van 100 millimeter met vacuümvet.Breng de immunoskleurde en verwerkte larve over naar een putplaat of depressieglaasje om ze met een ontleedmicroscoop te bekijken. Monteer de larve op de kamervormige glijbaan in 1% LMP agarose kolommen. Gebruik een glas langs je pipet, plaats één larve op de kamervormige glijbaan en deponeer zo min mogelijk PBS.Bedek de larve met gesmolten en warme 1% LMP agarose met dezelfde pipet. Pipetteer de LMP agarose in een kolom en positioneer de larve vervolgens zo symmetrisch mogelijk met het dorsale oppervlak zichtbaar. Na oogverwijdering werd progressieve degeneratie van retinale axonen waargenomen in de optische tectum neuropil.Na twee dagen postoperatie vertoonden RFP-gelabelde axonen kenmerken van snelle Walleriaanse degeneratie, zoals blabbing en fragmentatie. RFP-positieve puncta werden zowel binnen als buiten de neuropil aan de rechterkant van het tectum waargenomen, zoals aangegeven door de pijlen. Vier dagen na de operatie waren gefragmenteerde axonen en RFP-gelabeld axonaal puin aanzienlijk verminderd in de rechter tectale kwab, wat wijst op een relatief snelle klaring van de stervende en degenererende axonen.De hersenen werden blootgesteld door het ontleden van de ogen, kaak, oren en glidkruid van de huid en bindweefsels. Idealiter blijven de hersenen intact tijdens deze procedure. Delen van de voorhersenen, met name de reukbol, werden echter waarschijnlijk beschadigd of volledig verwijderd wanneer de schedelkap van de huid of kaak werd verwijderd.Bovendien wordt soms de laterale richel van het tectum gesneden bij het doorboren of knijpen van de huid om het van de hersenen te trekken. Geen twee monsters zijn identiek. Je moet dus in staat zijn om subtiele aanpassingen te maken door de oogverwijdering en hersendissectie als dat nodig is.Patiënten en scherpe hulpmiddelen zijn essentieel voor succes. Deze techniek kan worden gevolgd door cellulaire en moleculaire benaderingen, zoals in vivo live cell imaging of RNA-sequencing om nieuwe inzichten te krijgen in de moleculaire en cellulaire mechanismen van optische tectumgroei en -ontwikkeling.

eye-removal-living-zebrafish-larvae-to-examine-innervation-dependent

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Lens ontwikkeling houdt interacties met andere weefsels. Verschillende zebravis oog mutanten worden gekenmerkt door een abnormaal kleine lens formaat. Hier laten we zien een lens transplantatie experiment om te bepalen of dit fenotype is te wijten aan intrinsieke oorzaken of defecte interacties met weefsels die de lens omringen.

Lens transplantatie in de zebravis en de toepassing ervan in de Analyse van Eye Mutanten

De VisioTracker is een geautomatiseerd systeem voor de kwantitatieve analyse van de visuele prestaties van larvale en kleine volwassen vissen op basis van de registratie van oogbewegingen. Het beschikt over volledige controle over visuele stimulus eigenschappen en real-time analyse, waardoor high-throughput onderzoek op gebieden zoals visuele systeem ontwikkeling en functie, farmacologie, neurale circuit studies en sensomotorische integratie.

VisioTracker, een innovatieve geautomatiseerde benadering van oculomotorische Analyse

Source: Schramm, P. et al. In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the in vivo imaging of cerebellar neurons in transgenic zebrafish larvae, which express fluorescent proteins in Purkinje neurons. The process involves anesthetizing the larvae, immobilizing them in agarose, and carefully removing the pigmented skin to enhance light penetration and fluorescence intensity. Finally,...

In Vivo Imaging of Zebrafish Larval Brain for Visualizing Cerebellar Neurons

We presenteren een methode voor de elektroretinografische (ERG) analyse van zebravislarven met behulp van micromanipulatie en elektroretinografietechnieken. Dit is een eenvoudige en duidelijke methode voor het testen van de visuele functie van zebravislarven in vivo.

Electroretinogram Analyse van de Visual Response in zebravis Larven

Lichtbladfluorescentiemicroscopie is een uitstekend hulpmiddel voor het beeldvormen van embryonale ontwikkeling. Het maakt het mogelijk om lange time-lapse films van levende embryo's op te nemen in bijna fysiologische omstandigheden. We demonstreren de toepassing ervan voor het beeldvormen van de oogontwikkeling van zebravissen over brede ruimtelijk-temporele schalen en presenteren een pijplijn voor het samenvoegen en deconvolutie van multiview datasets.

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Hier presenteren we een protocol dat de meting van lichte evoked electroretinogram reacties van larvale zebrafish vereenvoudigt. Een roman kegelvormige spons-tip-elektrode kan helpen om de studie van visuele ontwikkeling in larvale zebrafish met behulp van de electroretinogram ERG gemakkelijker te bereiken met betrouwbare resultaten en lagere kosten.

Electroretinogram opname in larvale Zebrafish met behulp van A roman kegel-vormig spons-tip elektrode

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Hier wordt een protocol verstrekt voor time-lapse beeldvorming van oculaire morfogenese met behulp van een commercieel beschikbare lightsheet-microscoop en een beeldverwerkingswerkstation om de resulterende gegevens te analyseren. Dit protocol beschrijft de procedures voor embryo-anesthesie, inbedding in agarose bij lage smelttemperatuur, suspensie in de beeldvormingskamer, het instellen van de beeldvormingsparameters en ten slotte het analyseren van de beeldvormingsgegevens met behulp van...

Oculaire morfogenese visualiseren door Lightsheet Microscopie met behulp van rx3:GFP Transgene Zebravis

Leer een chirurgische methode voor het verwijderen van één oog bij levende zebravislarven om de invloed van retinale input op de ontwikkeling van de optische tectum te bestuderen.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken (Video) | JoVE Journal

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Meer video's verkennen