Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie
5 april 2022
Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.
Dit protocol helpt microglia te isoleren van de microdisseceerde demyelinisatielaesies van het volwassen muizenbrein om de microgliale kenmerken in vivo te bestuderen. Deze techniek bespaart tijd en stelt lagere eisen aan zowel experimentatoren als apparatuur. Deze methode helpt om microglia uit de hersenen van het dier te isoleren, vooral die microdisseceerde weefsels in verschillende ziektetoestanden.
Begin met het microdisseceren van de laesies gelabeld door neutrale kleurstof rond het corpus callosum onder een stereomicroscoop. Centrifugeer het ontlede weefsel gedurende 30 seconden op 300 maal g om het monster aan de onderkant van de buis te verzamelen. Verwarm enzymmix één en enzymmix twee tot 37 graden Celsius voor in een incubator.
Voeg vervolgens 1.950 microliter voorverwarmd enzymmengsel één op één monster toe en verteer gedurende vijf minuten in een incubator bij 37 graden Celsius. Voeg 30 microliter voorverwarmd enzymmengsel twee toe en meng voorzichtig. Voeg na de vertering vier milliliter koude PBS toe aan de buis en schud voorzichtig.
Centrifugeer de weefselmonsters gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius bij 300 maal g en zuig het bovennatuurlijke middel langzaam en volledig op. Resuspend de celkorrel voorzichtig met 1.550 microliter koude PBS. Voeg 450 microliter van de koude oplossing toe voor het verwijderen van vuil en meng ze goed.
Gebruik een pipet van 1.000 microliter om het mengsel heel langzaam en voorzichtig met twee milliliter koude PBS te bedekken. Centrifugeer het mengsel en zoek vervolgens naar de drie lagen. Gebruik een pipet van 1.000 microliter om de twee bovenste lagen volledig op te zuigen en vul de buis tot vijf milliliter met koude laadbuffer.
Keer de buis drie keer voorzichtig om. Vervolgens, na centrifugeren en aspiratie van het supernatant, resuspend de celkorrel met 90 microliter laadbuffer en voeg 10 microliter CD11b-kralen toe. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.
Voeg na de incubatie een milliliter van de laadbuffer toe en was de cellen door de vloeistof voorzichtig op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 microliter. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius op 300 keer g en zuig het supernatant volledig op om de ongebonden kralen te verwijderen. Resuspend de cellen in 500 microliter van de belastingsbuffer en plaats de MS-kolom met zijn separator voor positieve selectie in het magnetisch veld.
Spoel de kolom met 500 microliter van de laadbuffer om de cellen te beschermen en de efficiëntie van magnetische sortering te garanderen op basis van het protocol van de fabrikant. Breng de celsuspensie aan op de MS-kolom en gooi de doorstroom met de niet-gelabelde cellen weg. Voeg 500 microliter van de laadbuffer toe om de kolom te wassen en verwijder deze uit de scheidingsscheider.
Plaats de kolom op een centrifugebuis van 15 milliliter en voeg een milliliter van de laadbuffer toe aan de kolom. Duw ten slotte de zuiger naar de onderkant van de kolom om de magnetisch gelabelde cellen weg te spoelen. Een schematische weergave van de gating-strategie die wordt gebruikt bij flowcytometrie-analyse van microglia geïsoleerd uit demyelinisatielaesies van volwassen muizen voor en na de magnetisch geactiveerde celsortering wordt hier getoond.
De grafische afbeeldingen vertegenwoordigen de voorwaartse spreidingshoogte en zijverstrooiingshoogte voor het selecteren van cellen, het voorwaartse spreidingsgebied en de voorwaartse strooihoogte voor het selecteren van afzonderlijke cellen, en CD11b-FITC en CD45-APC voor het selecteren van de myeloïde cellen en microglia. Het aandeel microglia is aanzienlijk toegenomen na de magnetisch geactiveerde celsortering. De grafische afbeelding vertegenwoordigt de gating-strategie die wordt gebruikt in flowcytometrie-analyse voor levende en dode afzonderlijke cellen na de magnetisch geactiveerde celsortering.
Hier zijn 7-aminoactinomycine D en zijverstrooiingshoogte gebruikt om de levende cellen te selecteren. Vergeet tijdens het proberen van deze procedure niet om de demyeliniserende laesies nauwkeurig te microdistrigeren onder een stereomicroscoop op basis van de neutrale rode markeringen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het isoleren en zuiveren van primaire microglia uit demyelinisatie-laesies in volwassen muizenhersenen. Door gebruik te maken van kolom-geactiveerde celsortering, vergemakkelijkt de methode het onderzoek naar microgliale kenmerken in vivo terwijl tijd- en resourcevereisten worden geoptimaliseerd.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Neuropathologie
Achtergrond
- Microglia spelen een cruciale rol bij neuro-inflammatie en ziekten van het centrale zenuwstelsel.
- Het begrijpen van hun functie in demyeliniserende aandoeningen is essentieel voor het begrijpen van ziektemechanismen.
- Effectieve isolatietechnieken zijn nodig om microglia te bestuderen die worden gekenmerkt door specifieke pathologische toestanden.
- De gepresenteerde methode richt zich op het verbeteren van de efficiëntie bij het isoleren van deze cellen.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor de isolatie van microglia uit de doelgebieden van de hersenen.
- Om het onderzoek naar microgliagedrag en hun rollen in de context van demyeliniserende ziekten te vergemakkelijken.
- Om het gebruik van resources tijdens het isolatieproces te optimaliseren.
Gebruikte methoden
- Microdissectie van weefsel uit demyelinisatie-laesies onder een stereomicroscoop.
- Gebruik van kolom-geactiveerde celsortering voor isolatie van microglia.
- Stappen omvatten weefseldigeratie, centrifugatie en zachte hersuspensie voor efficiënte celisolatie.
- Belangrijke stappen omvatten enzympreparatie, meerdere centrifugatiesequenties en zorgvuldige behandeling van microgliale monsters.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol verbetert de verhouding van geïsoleerde microglia aanzienlijk.
- Flowcytometrie-analyse toonde succesvolle sortering van myeloïde cellen en de specifieke identificatie van microglia aan.
- Live-dood celkleuring werd uitgevoerd om de celviabiliteit te beoordelen en succesvolle sortering te bevestigen.
- De methode maakt een meer uitgebreid begrip van microgliale reacties mogelijk in demyeliniserende toestanden.
Conclusies
- Deze studie toont een effectieve methode voor het isoleren van microglia, die toekomstig onderzoek naar hun rol bij neurologische ziekten vergemakkelijkt.
- De isolatietechniek draagt bij aan de vooruitgang van de kennis van microgliagedrag in vivo, waardoor het toepasbaar is voor verschillende ziektemodellen.
- Dit protocol kan onderzoeken verbeteren die gericht zijn op therapeutische interventies die zich richten op microgliafunctie bij neurodegeneratieve ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary microglia from demyelinated mouse brain tissue enables precise investigation of innate immune responses in disease-relevant CNS models. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neuroinflammatory and demyelinating disease pipelines. High-purity microglial preparations facilitate translational continuity from discovery through preclinical research in neuroimmunology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglial activation states and phenotypic heterogeneity in disease-relevant CNS tissue.
- Supports functional target validation by preserving molecular characteristics of microglia from pathological lesions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory targets by isolating primary cells from in vivo models.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for downstream functional assays and compound screening.
- Improves assay reproducibility and standardization by delivering high-purity, viable cell populations.
- Enables quantitative flow cytometry readouts for cell identity and viability, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery in demyelinating conditions.
- Maintains continuity from in vivo discovery to preclinical validation by preserving microglial molecular profiles.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling direct study of microglial responses in pathological CNS environments.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neuroinflammatory and demyelinating disease research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and heterogeneity in CNS lesions.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity microglia for functional and phenotypic assays.
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry analysis of cell identity, viability, and population shifts.
- Translational Research: Preserves disease-relevant molecular features for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for isolating primary CNS immune cells across models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines cell isolation with lower equipment and expertise requirements.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by enabling direct study of primary microglia from disease models.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk and supports risk-adjusted prioritization in neuroinflammation pipelines.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microdissection and handling of CNS tissue under a stereomicroscope.
- Needs access to magnetic-activated cell sorting instrumentation and flow cytometry for validation.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different CNS regions or disease models to maintain cell purity and viability.
- Careful lesion identification and sample handling are critical to preserve molecular characteristics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Mice Dissection and Tissue Dissociation
1:35
Debris Removal and Magnetic Separation of Microglial Cells
3:26
Results: Gating Strategy Used in Flow Cytometry Analysis Before and After MACS and Gating Strategy for Living/Dead Single Cells After MACS
4:27
Conclusion
