Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Deze techniek maakt de identificatie van de cellen met verschillende invasieve capaciteiten mogelijk onder invloed van uitgescheiden factoren uit co-gekweekte stromale cellen. De techniek beoordeelt de impact van uitgescheiden factoren van co-gekweekte stromale of immuuncellen op celinvasie. Het maakt ook het herstel en de analyse van invasieve celsubpopulaties mogelijk die aanwezig zijn in heterogene celmengsels.

De techniek kan bepalen welke tumoren invasieve celsubpopulaties herbergen die leiden tot metastase. Het vangen en analyseren van invasieve kankercellen kan therapiebeslissingen informeren. Om de celkweek te beginnen, wast u de hechtingscelculturen met ongeveer 70% confluentie met 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing.

Voeg vervolgens 0,05% trypsine en EDTA-oplossing toe om de cellen op te tillen. Neutraliseer de trypsineoplossing met celkweekmedia die serum bevatten en tel de cellen met behulp van een aliquot van de celsuspensie. Plaats alle drie de steriele kamers in de weefselkweekkap.

Plaats de knop aan de korte kant van de onderste kamer en oriënteer de onderste kamer zo dat de knop naar de experimentator is gericht. Voeg 30.000 tot 50.000 cellen in 90 microliter media toe aan elke put vanuit de onderste kamer zonder bubbels te vormen. Gebruik 5% van foetale runderserum aangevulde media in twee onderste kamers als een positieve controle voor celmotiliteit, en gebruik 0% serum aangevulde media als een negatieve controle.

Draai de onderste kamer op 90 graden nadat je deze 10 tot 15 minuten in de kap hebt laten bezinken. Plaats vervolgens de middelste kamer bovenop zodat de knop op de onderste kamer in de inkeping op de middelste kamer schuift. Duw de kamer verticaal naar beneden totdat er een klik te horen is van elk van de lange zijden van de assemblage.

Voeg 160 microliter serumvrije media toe aan alle putjes van de middelste kamer. Zorg ervoor dat een koepelvormige meniscus zichtbaar is nadat de putjes zijn gevuld en plaats de bovenste kamer met elektroden naar beneden gericht op de middelste kamer om de blauwe stippen op de middelste en bovenste kamers uit te lijnen. Duw de kamer verticaal naar beneden totdat er een klikgeluid klinkt van elk van de lange zijden van de assemblage.

Voeg 20 tot 50 microliter serumvrije media toe aan de bovenste kamer. Monteer de assemblage op de dual-purpose celanalysator in de weefselkweekincubator en wacht 30 minuten voordat u de achtergrond meet. Open de celanalysatorsoftware, selecteer vervolgens de houder die moet worden gebruikt, gevolgd door een klik op het berichttabblad en zorg ervoor dat er verbindingen in orde staan om ervoor te zorgen dat de array goed in de houder is geplaatst en de elektroden goed zijn uitgelijnd met de sensoren.

Klik op het tabblad experimentnotities en vul alle mogelijke informatie over het experiment in. Klik vervolgens op het tabblad Lay-out en vul de beschrijving van de array-indeling in. Klik vervolgens op het tabblad Planning en voeg twee stappen toe uit het stappenmenu, een achtergrondstap met één veeg en een teststap met 100 sweeps.

Zodra de array 30 minuten in de incubator voor tweevoudige celanalysator heeft gestaan, klikt u op de afspeelknop om de achtergrondmeting te starten. Nadat de achtergrondmeting is uitgevoerd, verwijdert u de array uit de houder en plaatst u deze terug in de celkweekkap. Voeg vervolgens 30.000 tot 50.000 cellen in 100 microliter serumvrije media toe aan elke put van de bovenste kamer.

Dit zijn de cellen die de elektrode zal detecteren zodra ze met succes door het membraan migreren. Laat de assemblage 30 minuten in de motorkap staan voordat u deze op de dual-purpose celanalysator monteert voor impedantiemeting. Plaats de array terug in de dual-purpose cell analyzer en controleer op het berichttabblad voor het bericht Connections okay"-bericht.

Klik op de afspeelknop om de impedantiemeting te starten en klik vervolgens op het tabblad Plot om de voortgang van het signaal te volgen. Als het eindpunt vóór 25 uur is bereikt, klikt u op de stap afbreken in het vervolgkeuzemenu Uitvoeren. Als u gegevens wilt exporteren, klikt u met de rechtermuisknop op de grafiek, kiest u Kopiëren in de lijstindeling en plakt u de gegevens in een spreadsheet.

Bewaak de migratiesnelheid in realtime op de dual-purpose celanalysator om het stoppunt van belang te bepalen. Eenmaal bereikt, ontkoppelt u de assemblage van de dual-purpose celanalysator en plaatst u deze in de weefselkweekkap. Bereid een passend aantal van 1,5 milliliter microcentrifugebuizen voor om de cellen uit de betreffende putten te verzamelen.

Plaats de assemblage in een schaal van 10 centimeter om vloeistoffen te bevatten wanneer de kamers loskomen. Duw de flexibele knapeinden aan de lange kant van de middelste kamer naar binnen totdat een klikgeluid wordt gehoord, gevolgd door het demonteren van de bovenste kamer en het omkeren in een nieuwe schaal van 10 centimeter. Gebruik een cellifter met een mes van 13 millimeter om de cellen te verzamelen uit alle putten met dezelfde experimentele toestand.

Spoel of dompel het mes in 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing om de cellen te verzamelen in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter. Draai vervolgens de cellen gedurende vijf minuten op 500 keer G en verspreid deze verzamelde cellen of voer eindpuntanalyses uit, zoals eencellige RNA-sequencing. Beoordeling van invasie van de cellen in de aan- of afwezigheid van stromale cellen toonde aan dat MDA-MB-231 celinvasie werd versterkt wanneer bestraalde Swiss-3T3 fibroblasten J2-stam in de onderste kamer zaten voor de uitwisseling van factoren tussen de twee cellijnen.

Interessant is dat de MDA-MB-231-invasie toenam wanneer 3T3 J2-cellen in aantal werden verdubbeld. Aan de andere kant lijkt de invasiesnelheid van een invasieve kloon van MCFDCIS-cellen, DCIS-Delta Four, te worden geremd door de overspraak met 3T3 J2-cellen, wat de waardevolle toepassing van de driekamerarray suggereert om verschillende effecten van het stroma te meten. In dit geval fibroblasten op celinvasie.

Menselijke navelstrengas endotheelcellen waren invasiever als reactie op factoren die werden uitgescheiden door MDA-MB-231-cellen, in tegenstelling tot die uitgescheiden door DCIS-cellen, wat consistent is met het vermogen van invasieve tumoren om endotheelcellen te rekruteren voor bloedvatvorming en latere verspreiding in de bloedsomloop. Patiënt-afgeleide xenograft cellen invasie van de bovenste kamer nam toe als reactie op co-gekweekte menselijke beenmerg immuuncellen. Interessant is dat de aanwezigheid van 2% serum in de onderste kamer met de menselijke beenmergimmuuncellen essentieel was voor de invasie van van de patiënt afgeleide xenografts.

Putten kunnen worden gecoat met een extracellulaire matrix om de keldermembraanbarrière na te bootsen. Therapeutische middelen kunnen worden toegevoegd aan de media in de putten om hun effect op de invasie te volgen.