Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop
16 maart 2022
Cryo-EM-kaarten met hoge resolutie van macromoleculen kunnen ook worden bereikt met behulp van 200 kV TEM-microscopen. Dit protocol toont de best practices voor het instellen van nauwkeurige optische uitlijningen, data-acquisitieschema's en selectie van beeldvormingsgebieden die allemaal essentieel zijn voor het succesvol verzamelen van datasets met hoge resolutie met behulp van een 200 kV TEM.
Cryo-EM is een standaardtechniek geworden voor structuurbepaling van eiwitten en hun complexen. Dit protocol beschrijft de best practices voor het verkrijgen van cryo-EM-datasets met hoge resolutie uit de mid-range 200 kV TEM microscopen. Cryo-EM kan de eiwitstructuur in bijna inheemse omstandigheden bepalen in oplossing voor meerdere conformatietoestanden en functionele toestanden tegelijkertijd, wat ongrijpbaar is voor andere structurele technieken.
Verkregen structurele informatie kan worden gebruikt voor opheldering van moleculaire mechanismen van eiwitfunctie, evenals voor op structuur gebaseerd medicijnontwerp. Een recente publicatie in de structuur van amyloïde fibrillen onthulde bijvoorbeeld meerdere bindingsplaatsen van een vitaal ligand. In dit protocol gebruiken we echter de standaardmonsters van apoferritine en proteasoom om de kritieke stappen aan te tonen bij het verkrijgen van cryo-EM-gegevens met hoge resolutie.
De bediening van een Cryo-TEM is de laatste jaren eenvoudiger geworden, vooral door de introductie van geavanceerde automatiseringsfuncties. Voor de eerste sessie raden we u echter aan om een training te volgen met meer ervaren gebruikers. Vanaf daar is de progressie in de techniek relatief snel.
De procedure wordt gedemonstreerd door Adrian Koh, een senior applicatiewetenschapper bij Thermo Fisher Scientific. Plaats automatische roosters in de autoloader cassette onder vloeibare stikstof omstandigheden. Plaats de cassette met automatische roosters in een vloeibare stikstofgekoelde transfercapsule.
Plaats de capsule verder in de microscoop en klik op de Dock-knop in de microscoopgebruikersinterface om de cassette van de capsule in de automatische lader van de microscoop te laden. Klik op de knop Inventaris om de aanwezigheid van automatische rasters in de geladen cassette te controleren. Klik vervolgens op de knoppen Laden en verwijderen om de automatische rasters in de kolom in te voegen voor TEM-beeldvorming.
Selecteer het tabblad Atlas en klik op de knop Nieuwe sessie om een nieuwe sessie te openen. Vul details in zoals sessienaam en locatie voor gegevensopslag en klik op de knop Toepassen. Selecteer de betreffende rasters door een selectievakje naast het bijbehorende rasternummer in te schakelen.
Klik op de knop Start om een volledig geautomatiseerde verzameling atlassen van alle geselecteerde rasters te starten. Wanneer de collectie is voltooid, klikt u op rasterlabels om de verworven atlassen te bekijken. Selecteer het tabblad EPU en ga naar Nieuwe sessie om een nieuwe sessie te maken in het linkerdeelvenster.
Selecteer de optie Nieuwe sessie om de huidige optische voorinstellingen te gebruiken. Vul de naam van de sessie in. Selecteer het handmatige type van de sessie om controle te hebben over de selectie van afzonderlijke gaten en rastervierkanten die zijn geselecteerd voor gegevensverzameling later in het protocol.
Selecteer de snellere acquisitiemodus om beeldverschuiving zonder aberratie te gebruiken voor het verzamelen van gegevens. Voer vervolgens de locatie in om de metagegevens op te slaan. Klik op de knop Toepassen om een nieuwe sessie aan te maken.
Selecteer de vierkante selectietaak in het linkerdeelvenster om de verzamelde atlas van het raster weer te geven. Identificeer de rastervierkanten met intacte steunfolie zonder schade, dun glasachtig ijs en foliegaten, verwaarloosbare kristallijne ijsverontreiniging in het rastervierkant en minimale helderheidsgradiënt over het rastervierkant en binnen afzonderlijke foliegaten. Selecteer de rastervakken voor gegevensverzameling, in de volledige atlas of tegelafbeeldingen van hoge kwaliteit.
Klik met de rechtermuisknop op een interessant raster en kies de hele selectietaak. Klik op de knop Auto Eucentric om automatisch naar het eerste geselecteerde rastervak te gaan. Pas de eucentrische hoogte aan en verkrijg een raster vierkant beeld voor het vinden van foliegaten.
Klik op de knop Gaten zoeken om foliegaten in de afbeelding te vinden. Klik op de knop Gaten verwijderen om de rasterbalkknop te sluiten om gaten in de buurt van rasterbalken te deselecteren. Pas limieten in het helderheidshitogram van het ijsfilter aan om alle gaten met te dik ijs en alle lege gaten te verwijderen.
Klik met de rechtermuisknop op een gat in de vierkante rasterafbeelding en selecteer werkgebied verplaatsen naar locatie verplaats werkgebied hier. Selecteer de sjabloondefinitietaak in het linkerdeelvenster. Klik op de knop Verwerven om een hele afbeelding te verkrijgen.
Stel waarden voor vertraging na beeldverschuiving in op 0,5 seconden en vertraging na faseverschuiving op vijf seconden. Klik op de knop Gat zoeken en centreren om een gat in de afbeelding te centreren. Selecteer de knop Acquisitiegebied toevoegen en klik op de afbeelding om de locatie in het gecentreerde gat te selecteren waar een hoge vergrotingsfoto wordt gemaakt.
Selecteer de knop Autofocusgebied toevoegen en klik op de afbeelding om de locatie op de ondersteuningsfolie naast het gecentreerde gat te selecteren waar de autofocus van het beeld wordt uitgevoerd. Klik op het groene acquisitiegebied om een reeks onscherptewaarden in te stellen in de onscherptelijst in het bovenste gedeelte van het softwarevenster. Nadat u de specifieke instellingen voor autofocus hebt ingesteld, kiest u de optie Na centreren om automatisch scherp te stellen aan het begin van elk AFIS-cluster.
Kies de optie Objectieflens voor snellere autofocus en minder podiumdrift. Klik op de knop Alle vierkanten voorbereiden in de gatselectietaak om automatisch gegevensverzameling en alle andere geselecteerde rastervierkanten in te stellen volgens de gebruikte instellingen in dit eerste rastervierkant. Selecteer de sjabloondefinitietaak, verkrijg een nieuwe afbeelding, verplaats het werkgebied naar een schoon gebied op koolstoffolie door met de rechtermuisknop te klikken en selecteer de menuoptie verplaats werkgebied hier.
Selecteer het tabblad Automatische functies. Na het instellen van de gewenste onscherpte en iteratie, schakelt u over naar de autofocusvoorinstelling en klikt u op de startknop om de autofocusfunctie uit te voeren. Selecteer de taak Autostigmate, schakel over naar de Thon Ring-voorinstelling en druk op de Startknop.
Selecteer de taak Automatisch opcomen en druk op de knop Start. Verplaats werkgebied naar een gebied met een gebroken rastervierkant. Bevestig de transparantie van het gebied door een enkele autofocusafbeelding te maken.
Open Sherpa UI en selecteer de toepassing Energiefilter. Klik op de knop Centreren en de optie zero loss om de zero loss energiefilterspleet te centreren. Klik op de knop Tune in de optie isochromaticity.
Klik op de optie Tune Magnification and Tune Distortions in de geometrische en chromatische vervormingen. Ga naar het tabblad EPU, selecteer de taak Geautomatiseerde acquisitie en klik op de knop Uitvoeren starten om te beginnen met volledig geautomatiseerde gegevensverzameling. De figuur toont Cryo-EM-rasters die een gradiënt van ijsdikte over het rasteroppervlak weergeven.
De roosters die zijn uitgesloten van het verdere onderzoek zijn een slecht raster met dik ijs en een gebogen raster met slecht ijs en vervuiling, terwijl acceptabele rasters die zijn met een goede ijsgradiënt en een typisch raster met goed dun ijs en een kleine ijsgradiënt. De figuur toont de uiteindelijke 3D-weergave van de gereconstrueerde cryo-EM-kaart met apoferritine. De hoge stabiliteit en symmetrie maken het een optimaal benchmarkmonster voor cryo-EM-beeldvorming en beeldverwerking met hoge resolutie.
Bayesiaanse polijsting, CTF-verfijning en Ewald-bolcorrectie resulteerden in een kaart met een resolutie van 1,63 angstrom. De figuur toont een gedetailleerd beeld van de gereconstrueerde cryo-EM-kaart van apoferritine op het niveau van de individuele aminozuurzijketen. De dichtheid van aminozuurzijketens is goed opgelost en het atoommodel kan ondubbelzinnig binnen de kaart worden gebouwd.
De afbeelding hier toont twee verschillende datasets met verschillende onscherptewaarden verzameld uit hetzelfde Cryo-EM-raster met vergelijkbare rastervierkanten met een spleet volledig open en een 10-elektronvoltspleet, wat aangeeft dat de 10-elektronvoltspleet het beeldcontrast aanzienlijk verbetert. De figuur hierin toont een overzicht van de 20S proteasoom Cryo-EM kaart met gesegmenteerde subeenheden die worden gebruikt als standaard Cryo-EM monster. En de ingezoomde weergave met een aangepast atomair model vertegenwoordigt de stabiele katalytische kern van het proteasoomcomplex met de D7-symmetrie.
Het protocol bevat twee cruciale stappen. Eén, op zoek naar gebieden met dun glasachtig ijs met homogene deeltjes. En twee, het instellen van parallelle verlichting voor data-acquisitie.
Met hoge resolutie reconstructies van eiwitten die twee tot drie angstroms in resolutie bereiken, bent u beter in staat om de moleculaire mechanismen van ziekte te begrijpen en medicijnleads te verbeteren. Vroeger was kristallisatie noodzakelijk als je de structurele basis van biologische verschijnselen wilde bestuderen. Vandaag met Cryo-EM is dat niet meer nodig.
En dus stellen we wetenschappers met Cryo-EM in staat om een breder scala aan biologische fenomenen op structureel niveau te bestuderen.
Overzicht
Dit protocol beschrijft de best practices voor het verkrijgen van cryo-EM-datasets met een hoge resolutie met behulp van 200 kV TEM-microscopen. De nadruk ligt op nauwkeurige optische uitlijningen, schema's voor gegevensverwerving en de selectie van het beeldmaakgebied.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Cryo-elektronenmicroscopie
- Structurele biologie
Achtergrond
- Cryo-EM is een standaardtechniek voor de bepaling van proteïnestructuren.
- Het maakt de studie van proteïnen onder bijna-natuurlijke omstandigheden mogelijk.
- Deze methode kan meerdere conformationele en functionele toestanden gelijktijdig vastleggen.
- Recente ontwikkelingen hebben de bediening van Cryo-TEMs eenvoudiger gemaakt.
Doel van de studie
- Om de kritieke stappen bij het verkrijgen van Cryo-EM-gegevens met een hoge resolutie te demonstreren.
- Om een protocol te bieden voor het gebruik van standaardmonsters zoals apoferritine en proteasoom.
- Om structuurgebaseerd geneesmiddelonderzoek te faciliteren door middel van gedetailleerde structurele informatie.
Gebruikte methoden
- Gebruik van auto grids en vloeibare stikstofcondities voor monstervoorbereiding.
- Geautomatiseerde verzameling van atlassen van geselecteerde grids.
- Handmatige selectie van gridvelden voor gegevensverzameling.
- Gebruik van geavanceerde automatiseringsfuncties voor efficiënte gegevensverwerving.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle acquisitie van datasets met een hoge resolutie vanuit 200 kV TEM-microscopen.
- Identificatie van optimale gridvakken voor beeldvorming.
- Demonstratie van geautomatiseerde en handmatige datacollectietechnieken.
- Vestiging van een betrouwbaar protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het protocol biedt een uitgebreide handleiding voor het verkrijgen van Cryo-EM-gegevens met een hoge resolutie.
- Training door ervaren gebruikers wordt aanbevolen voor beginners.
- Vooruitgang in automatisering verbetert de efficiëntie van Cryo-EM-operaties.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Hoge-resolutie cryo-EM met behulp van 200 kV TEM-systemen maakt routinematige eiwitstructuurbepaling op atomair niveau mogelijk, waardoor de toegang wordt uitgebreid voorbij gespecialiseerde 300 kV-platforms. Automatisering en kwaliteitsbeoordeling in real-time stroomlijnen de gegevensverwerving, wat de snelle en reproduceerbare generatie van structurele inzichten voor vroege fasen van geneesmiddelenontwikkeling ondersteunt. Deze mogelijkheid versterkt het voorspellende vertrouwen bij de knelpunten van targetvalidatie en lead-identificatie binnen biofarmaceutische portfolio's.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om moleculaire mechanismen die ten grond liggen aan eiwitfunctie en ziekte-relevantie te ontrafelen.
- Ondersteunt structuurgebaseerd geneesmiddelontwerp door atomaire resolutiekaarten te bieden voor de analyse van targets.
- Faciliteert functionele targetvalidatie via directe visualisatie van conformationele en bindingsstaten.
- Vermindert de afhankelijkheid van kristallisatie, waardoor het bereik van hanteerbare targets wordt verbreed.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gevalideerde structurele templates voor downstream screening- en assay-ontwikkelingsworkflows.
- Standaardiseert beeldparameters en datakwaliteit, waardoor reproduceerbaarheid tussen experimenten wordt gegarandeerd.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van ligandbinding en conformationele veranderingen mogelijk.
- Ondersteunt schaalbare, geautomatiseerde gegevensverzameling voor high-throughput structurele screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt structurele resultaten uit met ziekterelevante modellen voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door mechanistische risicoreductie mogelijk te maken.
- Verbetert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door structuur-functie-relaties te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol positioneert 200 kV cryo-EM als een kerncompetentie van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waarmee targetvalidatie, lead-identificatie en mechanistische risicoreductie worden overbrugd.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door eiwitstructuren op te lossen in bijna-natuurlijke toestanden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve structurele gegevens voor de evaluatie van verbindingen en assay-gereedheid.
- Analytics: Maakt metingen met een hoge resolutie en statistische vergelijking van structurele condities en ligand-interacties mogelijk.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt inzichten op atomair niveau met ziektemodellen en biomarkerstrategieën.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerde, geautomatiseerde workflow die aanpasbaar is voor diverse eiwitdoelwitten en onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij target-validatie.
- Operationele waarde: Verbetert standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid via automatisering en real-time kwaliteitscontrole.
- Strategische waarde: Maakt beter geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van structureel gevalideerde targets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in cryo-EM bediening en data-interpretatie, waarbij een initiële training wordt aanbevolen.
- Toegang tot 200 kV TEM-systemen uitgerust met energiefilters en directe elektronendetectoren is noodzakelijk.
- Vereist een robuuste infrastructuur voor datamanagement en kwaliteitsbeoordeling voor high-throughput workflows.
- Standaardisatie van beeldparameters en automatiseringsprotocollen is cruciaal voor reproduceerbaarheid tussen teams.
- Aanpassing aan specifieke eiwitdoelen kan optimalisatie van de monstervoorbereiding en beeldcondities vereisen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
Grid Loading, Mapping, and Selection of Best Cryo-EM Grids for Data Collection
2:36
Setting up a Data Collection Session in the Single Particle Analysis Software
5:44
Final Microscope Alignments Before Starting Data Collection
7:15
Results: Gallery of Grids, Cryo-EM Reconstruction of Apo-Ferritin, and Effect of Energy Filtering on Cryo-EM Images
8:56
Conclusion
