Laagmicrodissectie van tricuspidalisklepfolders voor biaxiale mechanische karakterisering en microstructurele kwantificering

Deze methode kan de bijdragen van weefsellagen aan het algehele weefselgedrag isoleren, waardoor nieuw inzicht ontstaat in de weefselmicrostructuur. Ons microdissectie- en testraamwerk stelt ons in staat om de mechanische en microstructurele eigenschappen van hartklepfolders direct te vergelijken met hun eigen composietlagen. De microdissectie kan moeilijk onder de knie te krijgen zijn, daarom is het ten zeerste aan te raden om zoveel mogelijk te oefenen voordat je aan je studie begint.

Verzamel eerst de benodigde materialen, wasbord, DI-water, pipet, scalpel, microschaar, dunne tang, gebogen tang, dikke tang en pinnen. Ontkoppel het weefsel van de biaxiale tester en meet de dikte met behulp van de laserverplaatsingssensor. Leg het doekje op de wasplank.

Onderzoek de ventriculaire kant van het weefsel op grote chorda-inserties. Maak een foto ter referentie. Spreid het weefsel plat op de wasplank met de atrialis naar boven gericht.

Om het weefsel aan het bord te bevestigen, plaatst u in elke hoek een pin schuin van het weefsel af, zodat het weefsel iets strak trekt. Zorg ervoor dat de pinnen zich buiten de gaten bevinden die door de tanden zijn gemaakt bij het monteren van het weefsel en dat het weefsel vierkant is en niet verschuift tijdens de microdissectie van de laag. Plaats indien nodig pinnen langs de zijkant van het weefsel tijdens de dissectie om het weefsel meer uit te rekken.

Verwijder de fiduciale markers van de glaskraal. Plaats DI-water op het oppervlak van het weefsel met een pipet, zodat het het weefsel op een belachtige manier volledig bedekt. Om de eerste hoek te maken, selecteert u een hoek van het vastgepinde monster, waardoor grote chorda-inbrengingen in kwetsbare gebieden worden vermeden.

Snijd vervolgens de A / S-laag door het scalpel lichtjes over het weefseloppervlak langs de montagegaten te slepen voor mechanisch testen. De randen van de snede beginnen uit elkaar te trekken, waardoor de F/V-laag eronder zichtbaar wordt. Wrijf met een stompe, dunne tang stevig langs de snede om de randen verder te scheiden.

Als de snee in de A/S-laag niet uit elkaar begint te trekken, trek dan lichtjes over dezelfde snede met een scalpel. Maak een tweede snede loodrecht op de eerste snede. Als de twee sneden niet met elkaar verbonden zijn, laat u het dunne pincet onder het kleine gebied van weefsel lopen dat de twee sneden scheidt.

Gebruik vervolgens voorzichtig de schaar om het weefsel te knippen. Wrijf langs de sneden van de hoek met een dunne tang totdat het weefsel zich scheidt van de F / V-laag. Zodra een klein stukje weefsel is gescheiden, pak je het vast met het grote pincet en trek je het voorzichtig om de samengestelde lagen verder te scheiden.

Blijf het weefsel afpellen terwijl je het vastpakt met een groter pincet om ongewenst scheuren en scheuren van de A / S-composietlaag te voorkomen en wrijf over de naad totdat deze het einde van de twee sneden voor de hoek bereikt. Als de eerste bocht grote problemen heeft met de scheiding, probeer dan een andere hoek als uitgangspunt. Om vervolgens een tweede hoek te maken, verlengt u de twee sneden die voor de eerste hoek zijn gemaakt door de scalpelpunt aan de onderkant van elke snede te plaatsen en deze lichtjes langs het weefseloppervlak te slepen, zodat de gesneden extensies aansluiten op de oorspronkelijke sneden en de tand- of hechtgaten blijven volgen.

Ga door met het verlengen van de sneden en het afpellen van de bovenste composiet A / S-laag terwijl u de naad wrijft totdat één kant klaar is. Merk op dat het weefsel volledig gescheiden zal zijn langs één snede. Maak vervolgens een tweede hoek loodrecht op het einde van de volledig afgebladderde kant.

Verleng de resterende sneden terwijl u grote chorda-inbrengingen vermijdt. Sluit de chorda-inserties alleen uit van het A/S-scheidingsgebied wanneer deze uitsluiting een A/S-specimen mogelijk maakt dat groot genoeg is voor experimentele karakteriseringen. Ga door met het scheiden van de A/S- en F/V-lagen door gebruik te maken van de wrijf- en trektechnieken die voor de eerste bocht worden gebruikt.

Stop onmiddellijk met het scheiden van het weefsel als zich een scheur of gat vormt. Om te voorkomen dat een pincet wordt gevangen, plaatst u de schaar in een gat dat zich vormt en snijdt u het weefsel weg van het midden. Als het defect zich vormt langs de naad van scheiding, begin dan met het scheiden van het weefsel langs een andere rand.

Zoek naar tussenlaagverbindingen die kunnen optreden bij het scheiden van het weefsel en voorkom verdere weefselscheiding. Merk op dat dit dunne maar sterke strengen zijn die zorgvuldig met een schaar moeten worden geknipt. Vermijd het maken van een gat in de A/S-laag of het naar beneden snijden in de F/V-laag.

Ga door met dit proces totdat het grootst mogelijke monster van de A/S-laag is gescheiden. Markeer de oriëntatie van het monster met behulp van de chirurgische pen. Knip ten slotte met de schaar langs de scheidingsnaad voor de resterende weefselrand.

Leg de gescheiden A/S composietlaag plat op de snijmat. Gebruik indien nodig het scalpel om de randen van het weefsel recht te trekken en een vierkante weefselvorm te creëren die geschikt is voor biaxiaal mechanisch testen. Plaats de A/S-laag in DI-water totdat deze klaar is om te worden getest.

Markeer de oriëntatie van de F/V-laag die op het wasbord achterblijft. Knip het grootst mogelijke vierkant uit het gebied waar de A/S-laag is verwijderd. Plaats het vervolgens in DI-water.

Histologische analyse van de intacte folder en de twee ontleedde lagen controleerde of het weefsel correct was gescheiden langs de grens tussen de spongiosa en fibrosa. De histologiemicrografieën werden gebruikt om de dikte van de weefsellaag en de samenstellende massafracties te bepalen met behulp van ImageJ-software. De verplaatsing gecontroleerde mechanische testen en nabewerking produceerden membraanspanning versus rekgegevens van de tricuspidalisklep anterieure folder, tricuspidalisklep achterste folder en tricuspidalisklep septumfolder, die het niet-lineaire mechanische gedrag van het weefsel beschrijft.

De gepolariseerde ruimtelijke frequentiedomeinbeeldvormingsgegevens leverden kleurenkaarten op van de collageenvezeloriëntatie en de mate van optische anisotropie. In het bijzonder gaven deze kleurenkaarten een uitgebreid inzicht in de collageenvezelarchitectuur in het hele weefselmonster. Het is belangrijk op te merken dat de composietlaag krimpt zodra ze zijn gescheiden van het vastgepinde weefsel.

Verzamel het grootst mogelijke monster om ervoor te zorgen dat er voldoende weefsel is voor de daaropvolgende tests.