Spanningsmeter tether sondes voor het kwantificeren van groeifactor gemedieerde integrinemechanica en adhesie

Dit protocol is belangrijk vanwege de eenvoud van het TGT-sensorplatform dat wordt gebruikt om EGFR-integrine-overspraak en de invloed ervan op celmechanische krachten te bestuderen. Rao schetste om EGF-afhankelijke regulatie van celmechanica te onderzoeken. Het protocol is aanpasbaar voor verschillende liganden, celtypen, stimulatieparadigma's en kan worden gekoppeld aan TGT's van verschillende spanningsdrempels.

Oppervlaktesynthese lijkt in eerste instantie misschien intimiderend. De sleutel is om voorbereid en georganiseerd te zijn om de ingewikkelde stappen nauwkeurig uit te voeren door een checklist te gebruiken voor reagensvoorbereiding en berekeningen. Plaats op de eerste dag maximaal acht glazen afdekkingen van 25 millimeter in een polytetrafluorethyleenrek.

Plaats het rooster in een borosilicaatbeker van 50 milliliter met 40 milliliter 200-proof ethanol. Soniceren met een werkfrequentie van 35 kilohertz gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Vul een bekerglas van 50 milliliter met 40 milliliter piranha-oplossing vers bereid door zwavelzuur en waterstofperoxide in een verhouding van 3:1 te mengen in een Pyrex-bekerglas en te roeren met een glazen pipet.

Breng het afdekrek over in het bekerglas en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de zuurkast om het oppervlak van de afdekslip te etsen. Breng na het etsen het afdekrek over op een bekerglas met ultrapuur water met een pincet. Inspecteer de afdeksel slips visueel om ervoor te zorgen dat de oppervlakken er schoon uitzien zonder patronen of stofdeeltjes op het glasoppervlak.

Breng het afdekrek over op een bekerglas met 200-proof ethanol en was tweemaal gedurende 15 seconden om oppervlakken in evenwicht te brengen met organisch oplosmiddel. Breng het afdekrek gedurende één uur bij kamertemperatuur over in een 200-proof ethanoloplossing met 3% APTES om de afdekslips te silaniseren. Dompel het rek onder in een schoon bekerglas met 200-proof ethanoloplossing.

Droog de afdeksel slipt met stikstofgas met lage uitgangsdruk. Plaats de dekselglijders in een polystyreenschaal van 10 centimeter met een stuk parrafinefilm er plat in gelegd. Voeg 100 microliter van twee milligram per milliliter NHS-biotine-oplossing in DMSO toe aan vier afdekslipjes op paraffinefilm.

Zet een sandwich met de andere vier afdekslips bovenop, met twee afdekslips naar elkaar toe gericht met de functionalisatieoplossing ertussen. Haal op dag twee het gerecht van vier graden Celsius en scheid de ingeklemde hoeslipjes. Vermijd krassen of beschadiging van het gefunctionaliseerde oppervlak tijdens het scheiden van de sandwich.

Richt vervolgens de afdeksels in het rek met het gecoate oppervlak naar elkaar toe. Droog met stikstofgas. Plaats de dekselslips in een nieuwe schaal met een parrafinefilm erin.

Voeg 800 microliter runderserumalbumine in 1X PBS toe aan elke coverslip. Incubeer de afdeksel slips bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om het oppervlak te passeren en niet-specifieke binding van volgende functionalisatiereagentia te blokkeren. Om de afdekslips te functionaliseren, voegt u 800 microliter van één microgram per milliliter streptavidin toe in 1X PBS bij kamertemperatuur gedurende 45 tot 60 minuten.

Monteer de TGT-sondes in een PCR-buis met behulp van een thermocycler. Was na incubatie de hoes drie keer met 1X PBS. Voeg 100 microliter van de voorgemonteerde TGT-sondes toe aan vier afdekslips en maak sandwiches met behulp van de resterende vier afdekslips met de gefunctionaliseerde kant naar de sondes gericht.

Dek af met aluminiumfolie. Na de incubatie scheidt u de broodjes en wast u de afdekslipjes drie keer met 1X PBS. Monteer de hoes zorgvuldig in voorgezuiverde beeldkamers.

Om het effect van de epidermale groeifactorstimulatie op Cos-7-mechanica, adhesie en celverspreiding te onderzoeken, trypsinize Cos-7-cellen met 0,05% trypsine-EDTA gedurende twee minuten. Neutraliseer het trypsine door te wassen met HBSS en gedurende vijf minuten te centrifugeren op 800 G. Plaatcellen met een dichtheid van 40.000 cellen op de geassembleerde TGT-oppervlakken in DMEM aangevuld met 50 nanogram per milliliter EGF of DMEM zonder EGF.

Was de cellen na incubatie drie keer met 1X PBS. Bevestig met twee milliliter 4% paraformaldehyde gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur. Was de afdeksel slips vijf keer met 1X PBS met intervallen van vijf minuten bij kamertemperatuur.

Incubeer optioneel de afdekslips met 50-millimolair ammoniumchloride in 1X PBS gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg buffer A toe en plaats de beeldkamers met afdekslips in een vochtcontainer. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius om de cellen te blokkeren en te permeabiliseren.

Verdun het primaire anti-paxilline-antilichaam met 1:250 verdunningen in de blokkerende buffer. Incubeer met 200 microliter primaire antilichaamoplossing per afdekslip gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Label cellen gelijktijdig met een mengsel van di-geconjugeerd geit/anti-konijn secundair antilichaam bij 1:800 verdunning en di-geconjugeerd falloïdine bij 1:400 verdunningen in 200 microliter blokkerende buffer per afdekslip.

Was de oppervlakken vijf keer met 1x PBS met intervallen van vijf minuten. Voeg om te beginnen olie toe aan het objectief, reinig de bodem van de afdekplaat van de monsterkamer en plaats het monster op het podium. Focus op een cel en betrek de perfecte focus.

Lijn de RICM uit door het diafragma van de epi-verlichting te sluiten en te centreren. Richt de 488-nanometer laser op een kleine plek op het plafond van de kamer en vergroot de invalshoek tot voorbij de kritieke hoek, terwijl de fluorescentie op de camera in een live-modus wordt bewaakt. Neem een sterke vermindering van de achtergrondfluorescentie en een enkel in-focusvlak wanneer de kritische hoek wordt overschreden.

Identificeer cellen voor beeldvorming met behulp van de live-modus van de camera met BEHULP VAN RICM. Verkrijg de RICM- en TIRF-beelden van actine bij excitatie van 488 nanometer, integrinespanning bij excitatie van 561 nanometer en paxilline bij excitatie van 647 nanometer. Verkrijg sequentieel beelden met een belichtingstijd van 200 milliseconden.

Wijzig de dekkingsslips, focus en herhaal. Cos-7-cellen werden op dit TGT-oppervlak met of zonder EGF-stimulatie geplaatst om de impact van EGFR-activering met ligandstimulatie op de integrinemechanica te bestuderen. Als een integrine het ligand bindt en een kracht uitoefent die groter is dan het spanningsdrempeltotaal van de sonde, zal de DNA-duplex scheiden, wat leidt tot fluorescentie.

Elke TGT-sonde die een mechanische kracht niet heeft gescheurd, blijft niet-fluorescerend. De cellen werden geïncubeerd met of zonder EGF op de TGT-oppervlakken gedurende 60 minuten, gefixeerd en immunostained om de focale adhesieverdeling en de organisatie van het cytoskelet weer te geven. In de RICM-afbeelding werd de verspreiding van Cos-7-cellen op het 56-piconewton TGT-oppervlak significant verbeterd met EGF-stimulatie in vergelijking met zonder stimulatie.

Stimulatie met EGF resulteerde in een meer circulaire morfologie, die cos-7-celverspreiding en -groei vertegenwoordigt. De fluorescentie van open sondes is ook hoger bij EGF-stimulatie, zoals waargenomen in het spanningsfluorescentiebeeld. De geïntegreerde intensiteit van open sondes evenredig met het aantal open sondes was veel hoger bij EGF-stimulatie dan zonder stimulatie.

Onthoud altijd de oriëntatie van de afdekslips, waardoor het gefunctionaliseerde oppervlak naar boven gericht blijft. Wees bij het scheiden van de sandwich voorzichtig, zodat het oppervlak niet wordt bekrast of beschadigd. Na oppervlaktesynthese kan men onderzoeken op cytoplasmatische eiwitten die de celadhesie of mechanische transductie reguleren.

Dit maakt identificatie mogelijk van downstream signaalmoleculen die betrokken zijn bij het orkestreren van celmechanica op het plasmamembraan.