Subconjunctivale toediening van Adeno-geassocieerde virusvectoren in modellen met kleine dieren

Dit protocol biedt een methode voor gentherapie die op een veilige, gemakkelijke en effectieve manier aan meerdere oogweefsels wordt toegediend. Het is ook aanpasbaar voor intrastromale en subretinale injecties bij kleine dieren. Het gebruik van de subconjunctivale injectieroute is minimaal invasief.

Het brengt minder risico's met zich mee en houdt een grote belofte in voor AV-toediening om meerdere oogziekten te behandelen. Met meer dan 1 miljard mensen wereldwijd die lijden aan visuele beperkingen, biedt het gebruik van een veilige en eenvoudige methode voor medicijnafgifte een brede toepasbaarheid voor de behandeling van veel verschillende oorzaken van blindheid. De genafgiftemethoden die in dit protocol worden beschreven, zijn van bijzonder belang voor degenen die potentiële interventiestrategieën ontwikkelen en oogartsen beoefenen, die deze geneesmiddelen uiteindelijk aan patiënten zullen leveren.

De grootste uitdaging voor iemand die dit protocol voor het eerst uitvoert, is waarschijnlijk het inbrengen van de naald in de concept conjunctivale ruimte. Om te beginnen, monteer het injectiesysteem door een stereomicroscoop en een spuitpomp in een bioveiligheidskast te plaatsen. Snijd vervolgens de polyethyleenbuis tot een lengte van ongeveer 50 centimeter.

Steek het uiteinde van een naald van 36 gauge in het ene uiteinde van de buis. Vul vervolgens een wegwerpspuit van 3 milliliter met steriel water en steek deze in de zijkant van de buis tegenover de naald. Spoel de slang drie keer door, afwisselend steriel water en 70% alcohol om de slang te desinfecteren en ervoor te zorgen dat er geen lekken, verstoppingen of schade in de slang zijn.

Vul met de wegwerpspuit van 3 milliliter de slang met steriel water en laat de slang aan de wegwerpspuit zitten. Plaats vervolgens een stuk parafoam op het oppervlak van de bioveiligheidskast en voeg er een plas steriel water aan toe. Dompel het deel van de buis dat op de naald is aangesloten onder in de plas steriel water.

Trek vervolgens de wegwerpspuit uit de buisopening om te voorkomen dat er lucht in het slangsysteem komt bij het verwijderen van de spuit. Vul vervolgens een Hamilton spuit van 10 microliter met steriel water. Sluit vervolgens de Hamilton spuitnaald aan op het open uiteinde van de slang door de naaldpunt van de Hamilton-spuit onder te dompelen in de plas steriel water op de parafilm.

Houd de snelomkeerknop op het pompscherm ingedrukt om de duwblokken naar de geschatte lengte van de spuit te verplaatsen. Schroef vervolgens de klemknoppen van de beugel los om de bevestigingsbeugels op de duwer en de spuithouderblokken los te maken. Plaats vervolgens de Hamilton-spuit op het spuithouderblok en bevestig de spuit volgens de instructies van de fabrikant.

Om de parameters in het pompinstellingsscherm aan te passen, drukt u op de Force"-knop en stelt u het krachtniveau in op 30%Accepteer vervolgens de wijzigingen om terug te gaan naar het instellingsscherm. Druk op de knop Snel aan de slag, selecteer Methode en selecteer vervolgens de optie Alleen infuseren. Voor de spuitoptie selecteert u Hamilton 1700, klikt u vervolgens op Glas" en selecteert u 10 microliter.

Selecteer later de infusiesnelheid en het injectievolume. Werp het water uit de Hamilton-spuit terwijl u de slang en injectienaald vol water laat zitten door op de knop Infuse" te drukken. Trek vervolgens het virus op door de injectienaald in een aliquot van de virusvoorraad te plaatsen.

Trek vervolgens de Hamilton-spuit iets terug door op de omgekeerde knop te drukken om een kleine luchtbel in de slang te brengen. Na het verdoven van het dier, pak je het bindvlies vast met een tang. Steek vervolgens de naald in het bindvlies totdat de schuine kant volledig bedekt is door het conjunctivale membraan en leg de naald tegen de bol.

Start tegelijkertijd de injectie door op de Start-knop te drukken met behulp van de voetschakelaar. Om de verdeling van de AAV-vector te onderzoeken, werden de oculaire en omliggende weefsels gekleurd met hematoxyline en eosine. De representatieve sagittale secties toonden aan dat de dispersie van Indiase inkt voornamelijk plaatsvond naast de extraoculaire spieren in het buitenoppervlak van de sclera in de perioculaire losse bindweefsels.

Om de transductie van zelfcomplementaire AAV 8 acht weken na injectie te bevestigen, werd de overvloed aan groene fluorescentie-eiwitten in de doorsneden onderzocht door immunofluorescentiekleuring. De resultaten toonden aan dat AAV 8-vectoren de perioculaire spieren achter het oog en het hoornvlies efficiënt transduceerden. Om de vectorbiodistributie te analyseren, werden vectorgenoomkopienummers en verschillende oogcompartimenten in andere organen, waaronder lever en hart, onderzocht door kwantitatieve polymerasekettingreactie met behulp van primers en sondes die specifiek zijn voor het transgen.

Expressie van het transgen werd bevestigd door kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie, die suggereerde dat de subconjunctivale injectie van AAV 8 resulteert in transgene expressie in het ooglid, bindvlies, hoornvlies en oogzenuw. De luchtbel zal dienen als een barrière tussen het water in de buis en het therapeutische medicijn. Deze techniek stelt andere onderzoekers in staat om het gebruik van de subconjunctivale toedieningsroute te onderzoeken voor zowel oogheelkundige oplossingen als oculaire gentherapieën voor meerdere ziekten.