Atomic Force Microscopie om de fysieke eigenschappen van epidermale cellen van levende Arabidopsis-wortels te bestuderen

Deze methode maakt het mogelijk om veranderingen in de fysieke eigenschappen van de plantencelwand tijdens de ontwikkeling te kwantificeren en deze microscopische veranderingen te relateren aan de groei van een heel orgaan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het niet invasief is en dat er geen behandeling nodig is die de in vivo kwantificering van fysieke eigenschappen van de celwand relatief snel subcellulaire resolutie mogelijk maakt. Om te beginnen, verspreid een dunne laag siliconenlijm in de petrischaal met een afdekslip en laat het 45 seconden in de lucht.

Plaats met een pincet de zaailing op de lijm en richt de richting om contact tussen de uitstekende delen van de zaailing en de uitkraging te voorkomen. Druk vervolgens de wortel zachtjes op de siliconenlijmlaag om deze stevig te binden. Laat het 45 seconden staan en voeg de 1X PBS-oplossing toe.

Monteer de standaard siliciumnitride cantilever met een piramidale punt in de AFM-sondehouder voor vloeistof en lijn de laser uit op de cantilever dicht bij de positie van de tip. Verplaats vervolgens de fotodiode om de laserspot in het midden van de detector te plaatsen. Kalibreer de doorbuigingsgevoeligheid door een inkeping uit te voeren met een hellinggrootte van 3 micrometer, een inkepings- en retractiesnelheid van 0,6 micrometer per seconde en een triggerdrempel van 0,5 volt.

Zorg ervoor dat de sonde geen interactie heeft met het monster en kalibreer de veerconstante van de cantilever. Klik met behulp van het hulpprogramma thermal tune op calibrate gevolgd door thermal tune of op het thermal tune-pictogram in de nanoscope-werkbalk en voer de cantilevertemperatuur in. Nadat u een frequentiebereik hebt geselecteerd, klikt u op de knop harmonische oscillatorvloeistof van het monster.

Klik vervolgens op verkregen gegevens in het thermische tunepaneel. Pas nu de mediane filterbreedte aan op drie. Pas de PSD-binwidth aan om de ruis in de verkregen gegevens te verminderen door het gemiddelde te nemen en pasgrenzen in rond de eerste resonantiepiek.

Klik op bereken veerconstante K en klik vervolgens op ja in het pop-upvenster, met de vraag of de gebruiker deze waarde wil gebruiken. Gebruik de omgekeerde optische microscoop bij 10, 20 en 40 keer de vergroting van het oogstuk en plaats de AFM-sonde op het oppervlak van de vierde langwerpige epidermale cel van de primaire wortel en zorg ervoor dat deze in het midden van de cel wordt geplaatst. Met de eerder berekende veerconstantewaarde verkregen krachtcurven met een hellinggrootte van 3 micrometer, een triggerdrempel van 11 nanonewton en een inkepings- en retractiesnelheid van 0,6 micrometer per seconde op geselecteerde punten.

Verkrijg krachtcurven van drie cellen per wortel voor elke behandeling en vang ten minste 150 krachtcurven voor elke wortel. Deze grafiek toont een verwacht resultaat wanneer een krachtinkepingsexperiment wordt uitgevoerd op levende monsters die zich in het midden van de cel van de wortelrekzone bevinden. Wanneer de AFM-tip begint in te krimpen, begint het oppervlak van de celwand, de kracht toe te nemen vanwege de celwand die tegen de laster is.

De toename van de kracht gaat door totdat de maximale krachtwaarde is bereikt. Na dit punt begint het losgedeelte van de inspringing. De kracht groeit na een parabool in het inspringingsgedeelte, wat belangrijk is om elke curve aan te passen aan het voorspellingsmodel voor piramidale inspringers die worden gebruikt voor berekeningen.

Als passende parameter moet de positie van het contactpunt overeenkomen met het celwandoppervlak vóór de inkeping en wordt deze beschouwd als de oorsprong van de verplaatsing van de AFM-tip. Krachtcurven waarin het onmogelijk is om het contactpunt vóór de inkeping te detecteren, moeten worden weggegooid. Voorts moet de laad- en loscurve van het krachtinspringingsexperiment zonder geluid zijn.

Na het aanpassen van elke krachtcurve aan het model, werden histogrammen verkregen die de verdeling van de frequentie van de verkregen waarden van de schijnbare Young's modulus toonden. Dit histogram toont de frequentie verkregen met een set van 201 succesvolle inkepingen op negen verschillende cellen van drie verschillende planten van Columbia Zero gekweekt in controleomstandigheden. Inkeping kan voor sommige genotypen moeilijk zijn vanwege de morfologie van de wortel.

Bijvoorbeeld, de TTL 1 PRC 1-1 dubbele mutant groeide in ernstige osmotische stress. Deze histogrammen tonen de kansverdeling van de verkregen waarden van de schijnbare Young's modulus uit negen verschillende cellen. Alleen histogram H dat overeenkomt met één cel kon worden aangebracht in een Gaussische verdeling.

Het hier gepresenteerde metaal kan worden gecombineerd met andere technieken zoals groeisnelheidsstudies of analyse van de chemische samenstelling van de celwand. Deze andere technieken zullen de informatie verder aanvullen om te begrijpen hoe de chemische samenstelling op de fysische eigenschappen van de celwand de groei van een orgaan beïnvloedt.