Name: Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Ontdek CUT&RUN voor enkelcelanalyse van eiwitlokalisatie op chromatine met een handmatig 96-well formaat. Deze methode vereist minimale celinvoer en kan binnen één dag worden voltooid, wat waardevol is voor zeldzame en kostbare patiëntstalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken leden van het Hainer Lab voor het lezen en becommentariëren van een eerdere versie van dit manuscript. Dit project gebruikte de NextSeq500 beschikbaar bij de University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core in het UPMC Children's Hospital of Pittsburgh voor sequencing met speciale dank aan de directeur, William MacDonald. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het University of Pittsburgh Center for Research Computing via de verstrekte computerbronnen. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (aan S.J.H.).

Ethische verklaring: Alle studies werden goedgekeurd door het Institutional Biosafety Office of Research Protections aan de Universiteit van Pittsburgh.
1. Bereid magnetische kralen voor
OPMERKING: Voer uit voordat u de cel sorteert en houd ijs vast tot gebruik.
<ol><li>Pipetteer 30 μL conA-geconjugeerde paramagnetische microsferen pareldrijfmestmengsel per reactie op een verse microfugebuis van 1,5 ml en voeg 850 μL bindingsbuffer toe, pipetteer voorzichtig om te mengen. OPMERKING: ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen zijn lectine-gecoate magnetische kralen die lipidemembraanbinding mogelijk maken.</li>
	<li>Plaats de buis op een magnetisch rek en laat de kralen 1-2 minuten magnetiseren. Zodra het supernatant is opgeruimd, verwijdert u het supernatant en gooit u het weg zonder de kralen te storen.</li>
	<li>Verwijder de buis uit het magneetrek en was de kralen door ze opnieuw te gebruiken in 1 ml bindingsbuffer.</li>
	<li>Herhaal stap 1.2 en 1.3.</li>
	<li>Magnetiseer de kralen gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant om weg te gooien.</li>
	<li>Verwijder de buis uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 30 μL bindingsbuffer per reactie.</li>
	<li>Houd het gewassen kralenmengsel op ijs totdat de cellen zijn gesorteerd.</li>
</ol>2. Oogst cellen
OPMERKING: Deze stap is geschreven voor gehechte cellen en geoptimaliseerd voor murine E14 embryonale stamcellen. Het kweken en oogsten van de cellen is afhankelijk van het celtype.
<ol><li>Verwijder de cellen uit de incubator van 37 °C en onderzoek ze onder een microscoop om de kwaliteit te garanderen.</li>
	<li>Zuig de media uit de celplaat en spoel af met 5 ml 1x PBS.</li>
	<li>Zuig PBS uit de plaat en oogst de cellen (met behulp van traditionele celoogstmethoden die per celtype zullen verschillen). Verkrijg eencellige suspensie door zo nodig voorzichtig op en neer te pipetteren met een serologische pipet tegen de kweekschaal.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en draai gedurende 5 minuten met 200 x g naar beneden.</li>
	<li>Zuig de media af om de celkorrel weg te gooien en te wassen met 5 ml PBS + 1% FBS.</li>
	<li>Draai de cellen gedurende 5 minuten op 200 x g , gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 5 ml PBS + 1% FBS.</li>
	<li>Tel de cellen en breng 1 ml van 1 x 106 cellen over in een verse microfugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg 5 μL 7-Amino-Actinomycine D (7-AAD) toe, keer de buis goed om om te mengen en breng het monster vervolgens aan op de celsorteerder om levende afzonderlijke cellen te sorteren in individuele putten van een 96-well plaat. OPMERKING: 7-AAD-kleurstof is uitgesloten van levende cellen en kan daarom worden gebruikt bij het sorteren van levende cellen.</li>
</ol>3. Cel sorteren en lysis
<ol><li>Bereid een celsorteerder-compatibele 96-well plaat met 100 μL nucleaire extractie (NE) buffer in elke put voordat de cel wordt gesorteerd.</li>
	<li>Sorteer de cellen in 96-putplaten volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Draai de plaat snel (600 x g gedurende 30 s) om ervoor te zorgen dat cellen zich in de buffer in de putten bevinden. OPMERKING: Het is de moeite waard om in een voorlopig experiment te testen of de cellen die worden gebruikt betrouwbaar naar de bodem van de putten worden gebracht.</li>
	<li>Houd de monsters 15 minuten op ijs.</li>
	<li>Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 600 x g en pipetteer voorzichtig om het supernatant te verwijderen (5 μL achterlatend).</li>
	<li>Resuspend elk monster in 55 μL NE-buffer en voeg 30 μL van de voorgewassen ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen (vanaf stap 1.7; in Binding Buffer) toe aan elke reactie.</li>
	<li>Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.</li>
</ol>4. Pre-block monsters om vroege vertering door MNase te voorkomen
<ol><li>Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat de kralen minimaal 5 minuten binden en verwijder en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 100 μL Blocking Buffer toe aan de kerngebonden kralen en meng met zacht pipetteren.</li>
	<li>Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
</ol>5. Toevoeging van primair antilichaam
<ol><li>Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.</li>
	<li>Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 100 μL wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.</li>
	<li>Plaats de plaat terug op het magnetische rek met 96 putten, laat het supernatant wissen en verwijder en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Resuspend de kralen in 25 μL wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.</li>
	<li>Maak een primaire antilichaammastermix: 25 μL washbuffer + 0,5 μl antilichaam per reactie.</li>
	<li>Terwijl u de kerngebonden kralen voorzichtig vortext, voegt u 25 μL van de primaire antilichaammastermix toe aan elk monster dat wordt behandeld met een antilichaam dat zich richt op het eiwit van belang (meestal 1:100 uiteindelijke verdunning). Voeg 25 μL wasbuffer zonder antilichaam toe als u een controle uitvoert.</li>
	<li>Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats de monsters op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.</li>
	<li>Verwijder de plaat uit het magneetrek en was de kralen met 100 μL wasbuffer, resuspenderend door pipetteren.</li>
</ol>6. Toevoeging van pA-MNase of pA/G-MNase
OPMERKING: Eiwit A heeft een hoge affiniteit voor IgG-moleculen van bepaalde soorten zoals konijnen, maar is niet geschikt voor Igg's van andere soorten zoals muizen of ratten. Als alternatief kan Protein A /G-MNase worden gebruikt. Deze hybride bindt IgG's van konijnen, muizen en ratten, waardoor de noodzaak van secundaire antilichamen wordt vermeden wanneer primaire antilichamen van muizen of ratten worden gebruikt.
<ol><li>Plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.</li>
	<li>Verwijder de plaat uit het magnetische rek en breng elk monster opnieuw uit in 25 μL wasbuffer.</li>
	<li>Maak een pA-MNase master mix (25 μL Wash Buffer + geoptimaliseerde hoeveelheid pA-MNase per reactie).</li>
	<li>Voeg tijdens het vortexen voorzichtig 25 μL van de pA-MNase-mastermix toe aan elk monster, inclusief de controlemonsters. OPMERKING: De concentratie van pA-MNase varieert afhankelijk van de bereiding, indien zelfgemaakt, en moet vóór gebruik bij elke onafhankelijke zuivering worden getest. Voor pA/G-MNase moet 2,5 μL van de 20x bouillon worden gebruikt.</li>
	<li>Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.</li>
	<li>Verwijder de plaat van het magneetrek en was de kralen met 100 μL wasbuffer, resuspendatie door zacht pipetteren.</li>
</ol>7. Gerichte DNA-vertering
<ol><li>Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 bronnen, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg.</li>
	<li>Verwijder de monsters uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 50 μL wasbuffer door zachtjes te pipetteren.</li>
	<li>Breng de monsters gedurende 5 minuten in evenwicht tot 0 °C in een mengsel van ijs en water.</li>
	<li>Verwijder de monsters uit het ijs-/waterbad van 0 °C en voeg 1 μL van 100 mM CaCl2 toe met behulp van een meerkanaalspipet. Meng goed (3-5 keer) met zacht pipetteren met een meerkanaalspipet met een groter volume en breng de monsters terug tot 0 °C. OPMERKING: Goed mengen is hier essentieel. CaCl2 wordt toegevoegd om de MNase-vertering van DNA te activeren dat het eiwit van belang flankeert.</li>
	<li>Start een timer van 10 minuten zodra de plaat weer in het ijs/waterbad ligt.</li>
	<li>Stop de reactie door 50 μL 2XRSTOP+ Buffer in elke put te pipetteren, in dezelfde volgorde als de CaCl2 werd toegevoegd. OPMERKING: Maak 2XRSTOP + Buffer voordat de 10 minuten vertering voorbij is om oververtering te voorkomen.</li>
</ol>8. Fractionering van monsters
<ol><li>Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Draai de plaat gedurende 5 minuten bij 4 °C op 16.000 x g .</li>
	<li>Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten leegmaken en breng de bovennatuurlijke stoffen over naar een verse plaat met 96 putten. Gooi de kralen weg.</li>
</ol>9. DNA-extractie
<ol><li>Voeg 1 μL 10% natriumdodecylodylsulfaat (SDS) en 0,83 μL 20 mg/ml proteïnase K toe aan elk monster. LET OP: SDS poeder is schadelijk bij inademing. Gebruikers moeten in goed geventileerde ruimtes een bril, handschoenen en een N95-grade gasmasker dragen, waarbij ze voorzichtig moeten omgaan.</li>
	<li>Meng de monsters door zachtjes te pipetteren.</li>
	<li>Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij 70 °C.</li>
	<li>Breng de plaat terug op kamertemperatuur en voeg 46,6 μL van 5 M NaCl en 90 μL van 50% PEG 4000 toe. Meng door zachtjes te pipetteren.</li>
	<li>Voeg 33 μL polystyreen-magnetietkorrels toe aan elk monster en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: Zorg ervoor dat u polystyreen-magnetiet kralen op kamertemperatuur brengt (~ 30 min) en meng goed voor gebruik.</li>
	<li>Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat het supernatant gedurende ~ 5 minuten wissen en gooi het supernatant vervolgens voorzichtig weg zonder de kralen te verstoren.</li>
	<li>Spoel 2x met 150 μL 80% ethanol zonder de kralen te storen. LET OP: Ethanol is licht ontvlambaar en veroorzaakt huid-, oog- en longirritatie. Voer deze stap uit met geschikte laboratoriumkleding en in een geventileerde capuchon.</li>
	<li>Draai de plaat kort op 1000 x g gedurende 30 s. Plaats de plaat terug op een 96-well magnetisch rek en verwijder alle resterende EtOH zonder de kralen te verstoren.</li>
	<li>Droog de monsters aan de lucht gedurende ~ 2-5 minuten. LET OP: Droog de kralen niet langer dan 5 min. Als u ijverig bent over het verwijderen van de EtOH, is 2-3 minuten drogen voldoende.</li>
	<li>Resuspend de kralen met 37,5 μL van 10 mM Tris-HCl (pH 8) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat de kralen 5 minuten binden.</li>
	<li>Breng 36,5 μL van het supernatant over op een verse thermocycler compatibele 96-well plaat. Gooi de kralen weg. OPMERKING: Het experiment kan hier worden gestopt door monsters op te slaan bij -20 °C of kan doorgaan met het bouwen van de bibliotheek (stappen 10-15).</li>
</ol>10. Eindreparatie, fosforylering, adenylering
OPMERKING: De reagentia zijn afkomstig zoals vermeld in de tabel met materialen. Het onderstaande protocol volgt een vergelijkbare methode als de commerciële kit zoals DE NEBNext Ultra DNA II-kit.
<ol><li>Verdun 5 U/μL T4 DNA polymerase 1:20 in 1x T4 DNA ligase buffer.</li>
	<li>Bereid een eindreparatie/3'A mastermix voor: 2 μL 10x T4 DNA ligase buffer, 2,5 μL van 10 mM dNTPs, 1,25 μL van 10 mM ATP, 3,13 μL van 40% PEG 4000, 0,63 μL van 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL verdund T4 DNA polymerase, 0,5 μL van 5U/μL Taq DNA polymerase, met een totaal volume van 13,5 μL per reactie. OPMERKING: Zorg ervoor dat u 40% PEG 4000 op kamertemperatuur brengt voordat u pipettert.</li>
	<li>Voeg 13,5 μL eindreparatie/3'A mastermix toe aan 36,5 μL DNA.</li>
	<li>Meng de reactie door een snelle vortex en vervolgens een snelle spin (500 x g gedurende 10 s).</li>
	<li>Incubeer met behulp van de volgende reactieomstandigheden in een voorgekoelde thermocycler met een verwarmd deksel voor temperaturen >20 °C. Gebruik de reactieomstandigheden: 12 °C gedurende 15 minuten, 37 °C gedurende 15 minuten, 72 °C gedurende 20 minuten, houd bij 4 °C.</li>
</ol>11. Adapter ligatie
OPMERKING: Houd de monsters op ijs tijdens het instellen van de volgende reactie. Laat de ligasebuffer op kamertemperatuur komen voordat u gaat pipetteren. Verdun de adapter (zie materiaaltabel) in een oplossing van 10 mM Tris-HCl met 10 mM NaCl (pH 7,5). Vanwege de lage opbrengst, niet vooraf kwantificeren van het CUT & RUN-verrijkte DNA. Genereer in plaats daarvan 25-voudige verdunningen van de adapter, met behulp van een eindwerkadapterconcentratie van 0,6 μM.
<ol><li>Maak een ligatiemastermix: 55 μL ligasebuffer (2x), 5 μL T4 DNA-ligase en 5 μL verdunde adapter, met een totaal volume van 65 μL per reactie.</li>
	<li>Voeg 65 μL van het hoofdligatiemengsel toe aan 50 μL DNA uit stap 10.5.</li>
	<li>Meng door snel vortexen, gevolgd door snel draaien (500 x g gedurende 10 s).</li>
	<li>Incubeer bij 20 °C in een thermocycler (zonder verwarmd deksel) gedurende 15 min. OPMERKING: Ga onmiddellijk verder met de volgende stap.</li>
</ol>12. Gebruikersvertering
<ol><li>Voeg 3 μL USER-enzym toe aan elk monster, vortex en spin (500 x g gedurende 10 s).</li>
	<li>Incubeer in thermische cycler bij 37 °C gedurende 15 minuten (verwarmd deksel ingesteld op 50 °C).</li>
</ol>13. Polystyreen-magnetiet kraal opruimen na ligatiereactie
OPMERKING: Laat polystyreen-magnetietparels in evenwicht brengen bij kamertemperatuur (~ 30 min). Vortex om de kraaloplossing te homogeniseren voor gebruik. Voer de volgende stappen uit bij kamertemperatuur.
<ol><li>Voeg 39 μL (0,33x) polystyreen-magnetietkraaloplossing toe aan elke put die adaptor-geligeerd DNA bevat.</li>
	<li>Meng grondig door te pipetteren en incubeer de monsters vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om DNA aan de kralen te laten binden.</li>
	<li>Plaats de monsters op een magnetisch rek met 96 putten en incubeer gedurende 5 minuten totdat het supernatant helder is.</li>
	<li>Houd de plaat op het magnetische rek en verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kralen te storen.</li>
	<li>Spoel de kralen af met 200 μL van 80% EtOH zonder de kralen te storen.</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 s op een magnetisch rek met 96 putten om de oplossing te laten wissen.</li>
	<li>Verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.</li>
	<li>Herhaal stap 13,5-13,7 voor in totaal twee wasbeurten.</li>
	<li>Draai de plaat kort op 500 x g gedurende 10 s, plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten en verwijder de resterende EtOH zonder de kralen te verstoren.</li>
	<li>Houd de plaat op het magneetrek en droog de monsters gedurende 2 minuten aan de lucht. LET OP: Droog de kralen niet te veel.</li>
	<li>Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw uit in 28,5 μL van 10 mM Tris-HCl (pH 8). LET OP: Zoutzuur is zeer corrosief. Gebruikers moeten er voorzichtig mee omgaan in een chemische zuurkast met een bril, handschoenen en een laboratoriumjas.</li>
	<li>Reuspend kralen grondig door pipetteren, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bubbels ontstaan.</li>
	<li>Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat de oplossing 5 minuten leegmaken.</li>
	<li>Breng 27,5 μL supernatant over op een nieuwe PCR-plaat en gooi de kralen weg.</li>
</ol>14. Bibliotheekverrijking
OPMERKING: Primers worden verdund met dezelfde oplossing als de adapter. Gebruik voor deze bibliotheekopbouw een eindwerkprimerconcentratie van 0,6 μM.
<ol><li>Voeg 5 μL verdunde geïndexeerde primer (zie Materiaaltabel) toe aan elk monster. OPMERKING: Elk monster heeft een andere index nodig die na sequencing moet worden geïdentificeerd.</li>
	<li>Bereid een PCR-mastermix voor: 10 μL 5x high fidelity PCR-buffer, 1,5 μL van 10 mM dNTPs, 5 μL verdunde Universal primer, 1 μL van 1 U hot start high fidelity polymerase, met een totaal mastermixvolume van 17,5 μL per monster.</li>
	<li>Voeg 17,5 μL pf PCR-mix toe aan 32,5 μL gezuiverd adaptor-geligeerd DNA (5 μL geïndexeerde primer is inbegrepen in dit volume).</li>
	<li>Meng de oplossing door te pipetteren.</li>
	<li>Incubeer in een thermocycler met behulp van de volgende reactieomstandigheden met een maximale hellingsnelheid van 3 °C/s: 98 °C gedurende 45 s, 98 °C gedurende 45 s, 60 °C gedurende 10 s, herhaal de tweede en derde stap 21 keer, 72 °C gedurende 1 minuut, houd bij 4 °C. OPMERKING: De monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C voor opslag op korte termijn of -20 °C voor langdurige opslag.</li>
</ol>15. Polystyreen-magnetiet kraal opruimen
<ol><li>Voeg 60 μL (1,2x) polystyreen-magnetietparels toe aan elk monster.</li>
	<li>Resuspend de kralen door te pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats de plaat gedurende 5 minuten op een magnetisch rek totdat de oplossing helder is.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en spoel de kralen met 200 μL van 80% EtOH zonder de kralen te storen.</li>
	<li>Herhaal de wasstap voor in totaal twee 80% EtOH-wasbeurten.</li>
	<li>Draai de plaat op 500 x g gedurende 10 s, plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat de kralen 5 minuten binden.</li>
	<li>Pipetteer om overtollige EtOH te verwijderen zonder de kralen te storen en laat de kralen 2 minuten aan de lucht drogen. LET OP: Droog de kralen niet te veel.</li>
	<li>Resuspend de kralen in 21 μL nucleasevrij water en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat de oplossing 5 minuten leegmaken.</li>
	<li>Breng 20 μL van het supernatant over op een nieuwe plaat. OPMERKING: Het experiment kan hier worden gestopt door het monster bij -20 °C te bewaren.</li>
	<li>Kwantificeer bibliotheekconcentraties met een fluorometer (zie Tabel met materialen), met behulp van een 1x HS-reagens.</li>
	<li>Als de concentratie het toelaat, voer dan 30 ng monster uit op 1,5% agarosegel met een ladder met een laag molecuulgewicht om te visualiseren. U kunt ook visualiseren op een Fragment Analyzer of een gerelateerd instrument.</li>
	<li>Sequentiebibliotheken op een Illumina-platform om ~ 50.000-100.000 uniek in kaart gebrachte reads te verkrijgen.</li>
</ol>

<ol><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li>
<li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li>
<li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III%2C+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li>
<li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-tube+linear+DNA+amplification+%28LinDA%29+for+robust+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li>
<li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li>
<li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232(2013).</li>
<li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cChIP-seq%3A+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083(2015).</li>
<li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033(2015).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChlC+and+ChEC%3B+genomic+mapping+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733(2015).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856(2017).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314(2019).</li>
<li>Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li>
<li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT%26RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li>
<li>Zheng, X. -Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen met betrekking tot dit project.

CUT&RUN is een effectief protocol om eiwitlokalisatie op chromatine te bepalen. Het heeft veel voordelen ten opzichte van andere protocollen, waaronder: 1) hoge signaal-ruisverhouding, 2) snel protocol en 3) lage sequencing leesdekking vereist, wat leidt tot kostenbesparingen. Het gebruik van Protein A- of Protein A/G-MNase maakt het mogelijk om CUT&RUN toe te passen met elk beschikbaar antilichaam; daarom heeft het de potentie om snel en gemakkelijk veel eiwitten te profileren. Aanpassing aan eencellige voor elke eiwitp...

Veel nucleaire eiwitten functioneren door interactie met chromatine om DNA-gemodelleerde activiteiten te bevorderen of te voorkomen. Om de functie van deze chromatine-interagerende eiwitten te bepalen, is het belangrijk om de genomische locaties te identificeren waarop deze eiwitten gebonden zijn. Sinds de ontwikkeling in 1985 is Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) de gouden standaard om te bepalen waar een eiwit bindt aan chromatine 1,2. De traditionele ChIP-techniek heeft de volgende basisworkflow: cellen worden geoogst en gecrosslinkt (meestal met formaldehyde), chromatine wordt geschoren (meestal met agressieve ultrasoonapparaatmethoden, waardoor crosslinking nodig is), het eiwit van belang wordt immunoprecipiteerd met behulp van een antilichaam dat zich richt op het eiwit (of gelabeld eiwit) gevolgd door een secundair antilichaam (gekoppeld aan agarose of magnetische kralen), crosslinking wordt omgekeerd, eiwit en RNA worden verteerd om DNA te zuiveren, en dit ChIP verrijkt-DNA wordt gebruikt als de sjabloon voor analyse (met behulp van radioactief gelabelde sondes 1,2, qPCR3, microarrays 5,6 of sequencing4). Met de komst van microarrays en massaal parallelle diepe sequencing, zijn ChIP-chip 5,6 en ChIP-seq4 recenter ontwikkeld en maken genoombrede identificatie van eiwitlokalisatie op chromatine mogelijk. Crosslinking ChIP is sinds zijn komst een krachtige en betrouwbare techniek met grote vooruitgang in resolutie door ChIP-exo7 en ChIP-nexus8. Parallel aan de ontwikkeling van ChIP-seq zijn native (niet-crosslinking) protocollen voor ChIP (N-ChIP) vastgesteld, die nucleasevertering gebruiken (vaak met behulp van microkokkennuclease of MNase) om het chromatine te fragmenteren, in tegenstelling tot ultrasoonapparaat uitgevoerd in traditionele crosslinking ChIP-technieken9. Een groot nadeel van zowel crosslinking ChIP- als N-ChIP-technologieën is echter de vereiste voor hoge celaantallen vanwege de lage DNA-opbrengst na de experimentele manipulatie. Daarom zijn er in meer recente jaren veel inspanningen geleverd om ChIP-technologieën te optimaliseren voor lage celinvoer. Deze inspanningen hebben geresulteerd in de ontwikkeling van vele krachtige ChIP-gebaseerde technologieën die variëren in hun toepasbaarheid en invoervereisten 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Eencellige ChIP-seq-gebaseerde technologieën ontbreken echter, vooral voor niet-histoneiwitten.
In 2004 werd een alternatieve technologie ontwikkeld om de eiwitbezetting te bepalen op chromatine genaamd Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) en Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Deze single-locus technieken maken gebruik van een fusie van MNase met het eiwit van belang (ChEC) of met eiwit A (ChIC) voor directe knip van DNA naast het eiwit van belang. In meer recente jaren zijn zowel ChEC als ChIC geoptimaliseerd voor genoombrede eiwitprofilering op chromatine (respectievelijk ChEC-seq en CUT&RUN)20,21. Hoewel ChEC-seq een krachtige techniek is voor het bepalen van factorlokalisatie, vereist het de ontwikkeling van MNase-fusie-eiwitten voor elk doelwit, terwijl ChIC en zijn genoombrede variatie, CUT & RUN, vertrouwen op een antilichaam gericht op het eiwit van belang (zoals bij ChIP) en recombinant eiwit A-MNase, waar het eiwit A het IgG-constante gebied van het antilichaam kan herkennen. Als alternatief is een fusie-eiwit A / Eiwit G-MNase (pA / G-MNase) ontwikkeld dat een breder scala aan antilichaamconstante regio's kan herkennen22. CUT&RUN is snel een populair alternatief geworden voor ChIP-seq voor het bepalen van eiwitlokalisatie op chromatine genoombreed.
Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), een variant van CUT&RUN die het gebruik van lage en single-cell ingangen mogelijk maakt, werd beschreven in 201923. Hier wordt de methodologie voor een handmatige 96-well formaat single-cell applicatie beschreven. Het is belangrijk op te merken dat sinds de ontwikkeling van uliCUT&RUN twee alternatieven voor histonprofilering, CUT&Tag en iACT-seq, zijn ontwikkeld, die robuuste en zeer parallelle profilering van histoneiwitten24,25 bieden. Bovendien is scCUT&Tag geoptimaliseerd voor het profileren van meerdere factoren in een enkele cel (multiCUT&Tag) en voor toepassing op niet-histoneiwitten26. Samen biedt CUT&RUN een aantrekkelijk alternatief voor ChIP-seq met lage input, waar uliCUT&RUN kan worden uitgevoerd in elk laboratorium voor moleculaire biologie dat toegang heeft tot een celsorteerder en standaardapparatuur.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL clear microfuge tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90410</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tube magnetic rack</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tube-compatible cold centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5404000537</td><td></td></tr><tr><td>10 cm sterile tissue culture plates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 DNA Ligase buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>1X TE buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;L PCR tubes</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>2X quick ligase buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>Ligase Buffer</td></tr><tr><td>5X KAPA HiFi buffer</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>5X high fidelity PCR buffer</td></tr><tr><td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB559925</td><td></td></tr><tr><td>96-well magnetic rack</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027 or 12331D</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer&rsquo;s instructions</td></tr><tr><td>Antibody to protein of interest</td><td>varies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>BioMag Plus Concanavalin A beads</td><td>Polysciences</td><td>86057-10</td><td>ConA-conjugated paramagnetic microspheres</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62905AP</td><td></td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>BD FACSAria II cell sorter</td><td></td><td>Requires training</td></tr><tr><td>Cell-specific media for cell culture</td><td>Varies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C298-500</td><td>Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td></tr><tr><td>Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster</td><td></td><td></td><td>For computational analyses of resulting sequencing datasets</td></tr><tr><td>DNA spin columns</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1920-250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis equipment</td><td>varies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td>100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid&nbsp; (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>VWR</td><td>97063-256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in</td><td>homemade</td><td></td><td>Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid&nbsp; (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>varies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator with temperature and atmosphere control</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030284</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>hotstart high fidelity polymerase</td></tr><tr><td>Laminar flow hood</td><td>Bakery Company</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Manganese Chloride (MnCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette set</td><td>Rainin</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>NEB Adaptor</td><td>New England Biolabs</td><td>E6612AVIAL</td><td>Adaptor</td></tr><tr><td>NEB Universal primer</td><td>New England Biolabs</td><td>E6611AVIAL</td><td>Universal Primer</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td><td>Indexed Primers</td></tr><tr><td>Negative control antibody</td><td>Antibodies-Online</td><td>ABIN101961</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free water</td><td>New England Biolabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>2231000666</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock tubes</td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15593049</td><td>Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td></tr><tr><td>Phsophate buffered saline (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>Pipette aid</td><td>Drummond Scientific</td><td># 4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td><td>VWR</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles</td></tr><tr><td>Protease Inhibitors</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>ProteinA/G-MNase</td><td>Epicypher</td><td>15-1016</td><td>pA/G-MNase</td></tr><tr><td>ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN</td><td>Addgene</td><td>86973</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>New England Biolabs</td><td>T3010</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate&nbsp; (NaOAc)</td><td>ThermoFisher Scientific</td>

single-cell factor lokalisatie op chromatine met behulp van ultra-low input cleavage under targets en release met nuclease

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

Het bepalen van de bindingslocaties van een eiwit op chromatine is essentieel voor het begrijpen van de functie en potentiële regulerende doelen. Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) is al meer dan 30 jaar de gouden standaard voor het bepalen van eiwitlokalisatie en wordt gedefinieerd door het gebruik van een antilichaam om het eiwit van belang uit gesoniseerd of enzymatisch verteerd chromatine te halen. Meer recent zijn antilichaam-tetheringtechnieken populair geworden voor het beoordelen van eiwitlokalisatie op chromatine vanwege hun verhoogde gevoeligheid. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) is het genoombrede derivaat van Chromatin Immunocleavage (ChIC) en maakt gebruik van recombinant Protein A vastgebonden aan micrococcebasnuclease (pA-MNase) om het IgG-constante gebied van het antilichaam te identificeren dat zich richt op een eiwit van belang, waardoor site-specifieke splitsing van het DNA mogelijk wordt dat het eiwit van belang flankeert. CUT & RUN kan worden gebruikt om histonmodificaties, transcriptiefactoren en andere chromatine-bindende eiwitten zoals nucleosoomremodelleringsfactoren te profileren. Belangrijk is dat CUT&RUN kan worden gebruikt om de lokalisatie van euchromatische of heterochromatische geassocieerde eiwitten en histonmodificaties te beoordelen. Om deze redenen is CUT&RUN een krachtige methode voor het bepalen van de bindingsprofielen van een breed scala aan eiwitten. Onlangs is CUT&RUN geoptimaliseerd voor transcriptiefactorprofilering in lage populaties van cellen en enkele cellen en het geoptimaliseerde protocol wordt ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN) genoemd. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor eencellige factorprofilering met behulp van uliCUT & RUN in een handmatig 96-well-formaat.

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor eencellige eiwitprofilering op chromatine met behulp van een 96-well handmatig formaat uliCUT & RUN. Hoewel de resultaten zullen variëren op basis van het eiwit dat wordt geprofileerd (vanwege de overvloed aan eiwitten en de kwaliteit van antilichamen), celtype en andere bijdragende factoren, worden de verwachte resultaten voor deze techniek hier besproken. Celkwaliteit (celuitstraling en percentage levensvatbare cellen) en eencellige sortering moeten worden beoord...

CUT&RUN en zijn varianten kunnen worden gebruikt om de eiwitbezetting op chromatine te bepalen. Dit protocol beschrijft hoe de eiwitlokalisatie op chromatine kan worden bepaald met behulp van eencellige uliCUT & RUN.

Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN is een krachtige techniek voor het bepalen van eiwitlokalisatie op chromatine, en hier beschrijven we een eencellige versie van deze techniek in een handmatig 96-well formaat. De meeste eiwitlokalisatietechnieken, zoals ChIP-seq, vereisen een hoge celinvoer en duren ongeveer drie dagen om te voltooien. CUT&RUN is vanwege het hoge signaal en de lage achtergrond geoptimaliseerd voor toepassingen met lage cellen en een cellen en kan in één dag worden voltooid.We stellen ons voor dat deze techniek kan worden toegepast op bijna elk biologisch monster en bijzonder krachtig kan zijn om factorlokalisatie te bepalen in zeldzame en weinig voorkomende monsters, zoals kostbare patiëntmonsters. Voordat u eencellige experimenten uitvoert, test u het antilichaam en de techniek op een groot aantal niet-kostbare cellen. De belangrijkste beperking van dit experiment is de afhankelijkheid van een robuust antilichaam.De procedure wordt gedemonstreerd door Santana Lardo, een ervaren onderzoeksspecialist uit mijn laboratorium. Na het sorteren van enkele cellen en het binden van kernen aan kralen, plaatst u de 96-well plaat op een 96-well magnetisch rek en laat u de kralen minimaal vijf minuten binden. Verwijder vervolgens het supernatant en gooi het weg.Voeg 100 microliter blokkerende buffer toe aan de kerngebonden kralen, meng met zacht pipetteren en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat het supernatant minimaal vijf minuten leegmaken. Verwijder vervolgens het supernatant en gooi het weg zonder de kralen te storen.Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen per reactie opnieuw in 100 microliter wasbuffer per reactie met zacht pipetteren. Plaats de plaat terug op het magnetische rek met 96 putten, laat het supernatant wissen en verwijder en gooi het supernatant weg. Resuspend de kralen in 25 microliter wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.Maak een primair antilichaammastermengsel door 25 microliter wasbuffer per reactie te aliquoteren en voeg vervolgens 0,5 microliter antilichaam per reactie toe. Voeg 25,5 microliter van het antilichaamwasbuffermengsel toe, gevolgd door zacht pipetteren aan elk monster dat wordt behandeld met een antilichaam dat zich richt op het eiwit van belang. Incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur.Plaats de monsters vervolgens opnieuw op het magnetische rek met 96 putten. Zodra het supernatant helder is, verwijder en gooi het weg zonder storende kralen. Nadat u de plaat uit het magneetrek hebt verwijderd, wast u de kralen met 100 microliter wasbuffer en past u deze opnieuw op door pipetteren.Na het terugplaatsen van de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en het weggooien van supernatant zoals eerder aangetoond, resuspendeert u elk monster in 25 microliter wasbuffer. Maak een eiwit A MNase master mengsel door 25 microliter wasbuffer en een geoptimaliseerde hoeveelheid eiwit A MNase per reactie toe te voegen. Voeg 25 microliter eiwit A MNase-mastermengsel toe aan elk monster, inclusief de controlemonsters.Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten. Laat het supernatant minimaal vijf minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.Nadat u de plaat uit het magneetrek hebt verwijderd, wast u de kralen met 100 microliter wasbuffer en past u deze opnieuw aan door zacht pipetteren. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en gooi het supernatant weg zoals eerder gedemonstreerd. Verwijder vervolgens de monsters uit het magnetische rek en resuspend de kralen in 50 microliter wasbuffer door zacht te pipetteren.Breng de monsters gedurende vijf minuten in een ijswatermengsel op nul graden Celsius en verwijder vervolgens de monsters uit het ijswaterbad. Voeg een microliter calciumchloride van 100 millaris toe met behulp van een meerkanaalspipet. Meng drie tot vijf keer goed met zacht pipetteren met behulp van een meerkanaalspijlpipet met groot volume en breng de monsters vervolgens terug tot nul graden Celsius.Start een timer van 10 minuten zodra de plaat weer in het ijswaterbad ligt. Stop de reactie door 50 microliter van een oplossing met tweemaal de concentratie RSTOP+ te pipetteren en in elke put te bufferen in dezelfde volgorde als het calciumchloride werd toegevoegd. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius.Draai de plaat vijf minuten op 16.000 keer G bij vier graden Celsius. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten. Laat het supernatant minimaal vijf minuten leegmaken.Breng vervolgens supernatanten over op een verse 96-well plaat en gooi de kralen weg. Voeg voor DNA-extractie één microliter van 10% SDS en 0,83 microliter van 20 milligram per milliliter proteïnase K toe aan elk monster en meng de monsters door zacht te pipetteren. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius.Breng de plaat terug op kamertemperatuur. Voeg 46,6 microliter natriumchloride met vijf molair en 90 microliter 50%PEG4000 toe en meng door voorzichtig pipetteren. Voeg 33 microliter polystyreenmagnetietparels toe aan elk monster en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat het supernatant ongeveer vijf minuten leegmaken. Gooi vervolgens voorzichtig het bovennatuurlijke weg zonder de kralen te storen. Spoel tweemaal met 150 microliter 80% ethanol zonder de kralen te storen.Draai de plaat kort op 1000 keer G gedurende 30 seconden. Plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten en verwijder alle resterende ethanol zonder de kralen te verstoren. Droog de monsters ongeveer twee tot vijf minuten aan de lucht.Resuspend de kralen in 37,5 microliter 10-millimolair TRIS-hydrochloride van pH 8 en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat terug op een magnetisch rek en laat de kralen vijf minuten binden. Breng 36,5 microliter van het supernatant over op een verse thermocycler-compatibele 96-well plaat en gooi de kralen weg.Na het uitvoeren van een beoordeling van de celkwaliteit werden het uiterlijk en het percentage van de cel onderzocht, waaruit bleek dat embryonale stamcellen van lage kwaliteit niet mogen worden gebruikt. Eencellige sortering werd uitgevoerd met behulp van Hoechst 33342-kleuring en de testcellen werden geteld om ervoor te zorgen dat er nul of één cel in elke put wordt gevonden. Agarose-gelanalyse onthulde een ladder met een laag molecuulgewicht en individuele eencellige uliCUT & RUN-bibliotheken.Suboptimale en optimale bibliotheekanalyse toont een ladder met een laag molecuulgewicht, een suboptimale bibliotheek als gevolg van inefficiënte Mnase-vertering en een succesvolle bibliotheek met de juiste spijsvertering. Fragment analyzer distributie laat zien dat de verwachte grootte van eencellige varieert van 150 tot 500 basenparen. In grote eiwitten zal DNA echter ongeveer 270 basenparen hebben.Eiwitbezetting met behulp van single-locus genoombrowser met een hoog celnummer of negatieve controle en eencellige CTCF uliCUT & RUN onthulde dat eencellige grotendeels sterke pieken vertegenwoordigde, vergelijkbaar met hoogcellige uliCUT & RUN. Heatmaps van eencellige CTCF of negatieve controle onthulden een duidelijk patroon van leesverrijking direct over gevestigde CTCF-bindingsplaatsen in de cellen. Eendimensionale heatmaps tonen een hogere leesdichtheid over gevestigde CTCF-bindingsplaatsen in eencellige bibliotheken ten opzichte van omliggende regio's en controles zonder antilichamen, wat antilichaamspecifieke verrijking op gevestigde bindingsplaatsen aantoont.Het in evenwicht brengen van de parelgebonden kernen op het ijswaterbad en het niet oververhitten van het monster bij toevoeging van calciumchloride is belangrijk om oververtering van het chromatine te voorkomen.

single-cell-factor-localization-on-chromatin-using-ultra-low-input

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

De identificatie van de fysieke interacties tussen genen en regelgevende elementen is uitdagend maar heeft bevorderd door chromosoom conformatie opname methoden. Deze wijziging van het 4C-seq-protocol PCR bias vermindert door het minimaliseren van de over-amplificatie van PCR sjablonen en maximaliseert de mappability van leest door het opnemen van een toevoeging restrictie-enzym digest stap.

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

Een zeer parallelle methode voor het meten van het site-specifieke decolleté van DNA op het niveau van één molecuul wordt beschreven. Dit protocol toont de techniek met behulp van de beperking endonuclease NdeI. De methode kan eenvoudig worden aangepast om elk proces dat resulteert in site-specifieke DNA-decolleté te bestuderen.

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay voor site-specifieke DNA Decolleté

Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&amp;Tag) is een efficiënte chromatine epigenomische profileringsstrategie. Dit protocol presenteert een verfijnde CUT&amp;Tag strategie voor de profilering van histonmodificaties in planten.

Profilering van H3K4me3 Modificatie in Planten met behulp van Splitsing onder Doelen en Tagmentatie

Hi-C 3.0 is een verbeterd Hi-C protocol dat formaldehyde en disuccinimidylglutaraat crosslinkers combineert met een cocktail van DpnII en DdeI restrictie enzymen om de signaal-ruisverhouding en de resolutie van chromatine interactie detectie te verhogen.

Chromosoomconformatie vastleggen over lengteschalen

Een protocol voor het in kaart brengen van de driedimensionale genoomorganisatie met nucleosoomresolutie met behulp van de genoomwijde chromosoomconformatie-capture-methode Micro-C-XL wordt hier gepresenteerd.

3D-genoominteracties van zoogdieren in kaart brengen met Micro-C-XL

Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen, aangepast aan de studie van transcriptieregulatie in spiervezels door splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&amp;RUN).

Een efficiënt protocol voor CUT&amp;RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen

Genexpressie wordt gereguleerd door interacties van genpromotors met distale regulerende elementen. Hier beschrijven we hoe low input Capture Hi-C (liCHi-C) de identificatie van deze interacties in zeldzame celtypen mogelijk maakt, die voorheen niet meetbaar waren.

Een geïntegreerde workflow om de promotor-centrische spatio-temporele genoomarchitectuur in schaarse celpopulaties te bestuderen

Dit protocol leidt beginners in de bio-informatica door een inleidende CUT&amp;RUN-analysepijplijn die gebruikers in staat stelt om een eerste analyse en validatie van CUT&amp;RUN-sequencinggegevens te voltooien. Het voltooien van de hier beschreven analysestappen, in combinatie met stroomafwaartse piekannotatie, stelt gebruikers in staat om mechanistische inzichten te verkrijgen in chromatineregulatie.

Inleidende analyse en validatie van CUT&#38;RUN-sequencinggegevens

Een geoptimaliseerd Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease gevolgd door next generation sequencing (CUT&amp;RUN-seq) protocol wordt beschreven voor neuro-endocriene kleincellige longkankercellijnen. Het maakt genoombrede mapping mogelijk van diverse histonmodificaties en transcriptiefactoren (bijv. E2F7) bindingsplaatsen om epigenetische en transcriptionele deregulatie in de SCLC-pathobiologie te onderzoeken.

Genoom-brede mapping van histonmodificaties en bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren in neuro-endocriene kleincellige longkankercellijnen met behulp van CUT&amp;RUN

Ontdek CUT&RUN voor enkelcelanalyse van eiwitlokalisatie op chromatine met een handmatig 96-well formaat. Deze methode vereist minimale celinvoer en kan binnen één dag worden voltooid, wat waardevol is voor zeldzame en kostbare patiëntstalen.

Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease

Meer video's verkennen