Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease

CUT&RUN is een krachtige techniek voor het bepalen van eiwitlokalisatie op chromatine, en hier beschrijven we een eencellige versie van deze techniek in een handmatig 96-well formaat. De meeste eiwitlokalisatietechnieken, zoals ChIP-seq, vereisen een hoge celinvoer en duren ongeveer drie dagen om te voltooien. CUT&RUN is vanwege het hoge signaal en de lage achtergrond geoptimaliseerd voor toepassingen met lage cellen en een cellen en kan in één dag worden voltooid.

We stellen ons voor dat deze techniek kan worden toegepast op bijna elk biologisch monster en bijzonder krachtig kan zijn om factorlokalisatie te bepalen in zeldzame en weinig voorkomende monsters, zoals kostbare patiëntmonsters. Voordat u eencellige experimenten uitvoert, test u het antilichaam en de techniek op een groot aantal niet-kostbare cellen. De belangrijkste beperking van dit experiment is de afhankelijkheid van een robuust antilichaam.

De procedure wordt gedemonstreerd door Santana Lardo, een ervaren onderzoeksspecialist uit mijn laboratorium. Na het sorteren van enkele cellen en het binden van kernen aan kralen, plaatst u de 96-well plaat op een 96-well magnetisch rek en laat u de kralen minimaal vijf minuten binden. Verwijder vervolgens het supernatant en gooi het weg.

Voeg 100 microliter blokkerende buffer toe aan de kerngebonden kralen, meng met zacht pipetteren en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat het supernatant minimaal vijf minuten leegmaken. Verwijder vervolgens het supernatant en gooi het weg zonder de kralen te storen.

Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen per reactie opnieuw in 100 microliter wasbuffer per reactie met zacht pipetteren. Plaats de plaat terug op het magnetische rek met 96 putten, laat het supernatant wissen en verwijder en gooi het supernatant weg. Resuspend de kralen in 25 microliter wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.

Maak een primair antilichaammastermengsel door 25 microliter wasbuffer per reactie te aliquoteren en voeg vervolgens 0,5 microliter antilichaam per reactie toe. Voeg 25,5 microliter van het antilichaamwasbuffermengsel toe, gevolgd door zacht pipetteren aan elk monster dat wordt behandeld met een antilichaam dat zich richt op het eiwit van belang. Incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Plaats de monsters vervolgens opnieuw op het magnetische rek met 96 putten. Zodra het supernatant helder is, verwijder en gooi het weg zonder storende kralen. Nadat u de plaat uit het magneetrek hebt verwijderd, wast u de kralen met 100 microliter wasbuffer en past u deze opnieuw op door pipetteren.

Na het terugplaatsen van de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en het weggooien van supernatant zoals eerder aangetoond, resuspendeert u elk monster in 25 microliter wasbuffer. Maak een eiwit A MNase master mengsel door 25 microliter wasbuffer en een geoptimaliseerde hoeveelheid eiwit A MNase per reactie toe te voegen. Voeg 25 microliter eiwit A MNase-mastermengsel toe aan elk monster, inclusief de controlemonsters.

Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten. Laat het supernatant minimaal vijf minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.

Nadat u de plaat uit het magneetrek hebt verwijderd, wast u de kralen met 100 microliter wasbuffer en past u deze opnieuw aan door zacht pipetteren. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en gooi het supernatant weg zoals eerder gedemonstreerd. Verwijder vervolgens de monsters uit het magnetische rek en resuspend de kralen in 50 microliter wasbuffer door zacht te pipetteren.

Breng de monsters gedurende vijf minuten in een ijswatermengsel op nul graden Celsius en verwijder vervolgens de monsters uit het ijswaterbad. Voeg een microliter calciumchloride van 100 millaris toe met behulp van een meerkanaalspipet. Meng drie tot vijf keer goed met zacht pipetteren met behulp van een meerkanaalspijlpipet met groot volume en breng de monsters vervolgens terug tot nul graden Celsius.

Start een timer van 10 minuten zodra de plaat weer in het ijswaterbad ligt. Stop de reactie door 50 microliter van een oplossing met tweemaal de concentratie RSTOP+ te pipetteren en in elke put te bufferen in dezelfde volgorde als het calciumchloride werd toegevoegd. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius.

Draai de plaat vijf minuten op 16.000 keer G bij vier graden Celsius. Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten. Laat het supernatant minimaal vijf minuten leegmaken.

Breng vervolgens supernatanten over op een verse 96-well plaat en gooi de kralen weg. Voeg voor DNA-extractie één microliter van 10% SDS en 0,83 microliter van 20 milligram per milliliter proteïnase K toe aan elk monster en meng de monsters door zacht te pipetteren. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius.

Breng de plaat terug op kamertemperatuur. Voeg 46,6 microliter natriumchloride met vijf molair en 90 microliter 50%PEG4000 toe en meng door voorzichtig pipetteren. Voeg 33 microliter polystyreenmagnetietparels toe aan elk monster en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat het supernatant ongeveer vijf minuten leegmaken. Gooi vervolgens voorzichtig het bovennatuurlijke weg zonder de kralen te storen. Spoel tweemaal met 150 microliter 80% ethanol zonder de kralen te storen.

Draai de plaat kort op 1000 keer G gedurende 30 seconden. Plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten en verwijder alle resterende ethanol zonder de kralen te verstoren. Droog de monsters ongeveer twee tot vijf minuten aan de lucht.

Resuspend de kralen in 37,5 microliter 10-millimolair TRIS-hydrochloride van pH 8 en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat terug op een magnetisch rek en laat de kralen vijf minuten binden. Breng 36,5 microliter van het supernatant over op een verse thermocycler-compatibele 96-well plaat en gooi de kralen weg.

Na het uitvoeren van een beoordeling van de celkwaliteit werden het uiterlijk en het percentage van de cel onderzocht, waaruit bleek dat embryonale stamcellen van lage kwaliteit niet mogen worden gebruikt. Eencellige sortering werd uitgevoerd met behulp van Hoechst 33342-kleuring en de testcellen werden geteld om ervoor te zorgen dat er nul of één cel in elke put wordt gevonden. Agarose-gelanalyse onthulde een ladder met een laag molecuulgewicht en individuele eencellige uliCUT & RUN-bibliotheken.

Suboptimale en optimale bibliotheekanalyse toont een ladder met een laag molecuulgewicht, een suboptimale bibliotheek als gevolg van inefficiënte Mnase-vertering en een succesvolle bibliotheek met de juiste spijsvertering. Fragment analyzer distributie laat zien dat de verwachte grootte van eencellige varieert van 150 tot 500 basenparen. In grote eiwitten zal DNA echter ongeveer 270 basenparen hebben.

Eiwitbezetting met behulp van single-locus genoombrowser met een hoog celnummer of negatieve controle en eencellige CTCF uliCUT & RUN onthulde dat eencellige grotendeels sterke pieken vertegenwoordigde, vergelijkbaar met hoogcellige uliCUT & RUN. Heatmaps van eencellige CTCF of negatieve controle onthulden een duidelijk patroon van leesverrijking direct over gevestigde CTCF-bindingsplaatsen in de cellen. Eendimensionale heatmaps tonen een hogere leesdichtheid over gevestigde CTCF-bindingsplaatsen in eencellige bibliotheken ten opzichte van omliggende regio's en controles zonder antilichamen, wat antilichaamspecifieke verrijking op gevestigde bindingsplaatsen aantoont.

Het in evenwicht brengen van de parelgebonden kernen op het ijswaterbad en het niet oververhitten van het monster bij toevoeging van calciumchloride is belangrijk om oververtering van het chromatine te voorkomen.