Engineering antivirale middelen via Surface Plasmon Resonance

Oppervlakteplasmonresonantiespectroscopie is vastgesteld voor de bepaling van eiwitligand op een medium throughput manier. Verschillende affiniteiten voor bindingsplaatsvarianten van hetzelfde molecuul worden gepresenteerd, namelijk voor de van ijzerbindende hoge manieren oligosacchariden op virussen. SPR is een labelvrije techniek om real-time macromoleculaire binding van oppervlakte-geïmmobiliseerde receptoren te bestuderen.

Multisite-interacties worden in de kinetische analyse herkend door competitieve binding onafhankelijk van de grootte van de specifieke gebieden in onderzoek die SPR gebruiken, zijn medicijnontwikkeling om te zoeken naar remmers of antilichaamkarakterisering. Kinetische constanten en affiniteiten worden direct berekend uit de sensorrespons. Breng om te beginnen 100 microliter van de oplossing over op LB-agar-platen en verspreid deze voorzichtig met behulp van een steriele celverspreider.

Start een reeks monsterreacties met behulp van meerdere concentraties dubbelstrengs DNA-sjabloon variërend van vijf tot 50 nanogram terwijl de primerconcentratie constant blijft. Voeg vervolgens het DpnI-restrictie-enzym toe onder de minerale olie-overlay en incubeer onmiddellijk bij 37 graden Celsius gedurende een uur voor het verteren van het ouderlijke supercoiled dubbelstrengs DNA. Om de XL1-Blue Supercompetent Cells te ontdooien, aliquot u de cellen tot een voorgekoelde, kleine, ronde bodembuis.

Breng vervolgens één microliter van het met DpnI behandelde enkelstrengs DNA over van elke controle- en monsterreactie naar afzonderlijke aliquots van de supercompetente cellen die de complementaire streng synthetiseren. Nadat u de transformatiereacties zorgvuldig hebt gezwenkt om te mengen, incubeert u de reacties gedurende 30 minuten op ijs. Breng gedurende 45 seconden warmtepuls aan op de transformatiereacties bij 42 graden Celsius en plaats de reacties vervolgens gedurende twee minuten op ijs.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter NZY +Bouillon toe en incubeer de transformatiereacties bij 37 graden Celsius met schudden bij 225 tot 250 RPM gedurende een uur. Plaats daarna het juiste volume van elke transformatiereactie op LB Ampicilline Agar-platen zoals eerder aangetoond. Voor een zaadcultuur ent u een kleine hoeveelheid ampicilline met LB-media met een enkele kolonie van de getransformeerde plaat.

Gebruik de nachtcultuur ent de expressiecultuur met additieven, waaronder 10 millimol magnesiumchloride, 10 millimol magnesiumsulfaat en 20 millimol glucose, waardoor de zaadcultuur tot één bij 100 wordt verdund. Laat vervolgens cellen groeien met krachtig schudden bij 37 graden Celsius tot een absorberende 600 nanometer tussen 0,4 en 0,6 voordat de cellen worden gekoeld tot 20 graden Celsius en induceer met één millimolaire IPTG en groei 's nachts. Oogst vervolgens de cellen door 15 minuten op 4.000 g te centrifugeren bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.

Na resuspendatie van de celpellet in fosfaat gebufferde zoutbuffer, recente toevlucht bij 4.000 g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant vervolgens weg met een pipet. Resuspenseer vervolgens de resterende pellet in 10 milliliter lysisbuffer en incubeer de suspensie gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Scheid vervolgens oplosbare en onoplosbare fracties door centrifugering bij 4.000 g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Gebruik bovendien HIS-Select Ni2 + Affinity Gel in buizen van 14 milliliter om zijn gelabelde recombinant tot expressie gebrachte cyanovirine-N te binden en te resuspenderen in bufferoplossingen met respectievelijk 20 millimolidazool en 250 millimolar imidazol. Incubeer in batch gedurende ten minste 30 minuten tussen deze stappen.

Toevoeging van de elutiebuffer met 250 millimolair imidazol aan eluuteiwit. Breng de eiwitoplossingen over in centrifugatiebuizen met een Dalton-afsnijfilter van 10 kilo en concentreer ze door ze gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 4, 500 g en vier graden Celsius. Voeg spr-loopbuffer toe aan een verdunningsfactor van één tot 10 en centrifugeer vier keer tot het oorspronkelijke volume gedurende 10 minuten bij 4, 500 g en vier graden Celsius.

Bepaal daarna de eiwitconcentratie op 280 nanometer met behulp van een NanoDrop UV-Visible Spectrophotometer op basis van de berekende extinctie co-efficiënt voor het hoofdeiwit CVN2L0 met een grootte van 23.474 Dalton. Gebruik voor het tweekanaals SPR-systeem HBSCP plus als loopbuffer, 10 millimolar glycine zoutzuur van pH 1,5 tot 1,6 als regeneratiebuffer en schakel de instrumentontgasser, autosampler en pomp in. Was vervolgens het hele systeem met dubbel gedestilleerd water gedurende een uur.

Laat vervolgens dompelolie op de detector vallen en monteer een glazen sensorchip die is bedekt met een dunne gouden film. En aan de bovenzijde, gefunctionaliseerd met carboxymethyl dextran hydrogel direct op de detector onder de driepoorts flowcel. Repareer vervolgens de instelling door de bediening naar beneden te trekken.

Om de eiwithoudende liganden te immobiliseren tot sensorchips, opent u een run-tabel door op Formulier in de menubalk te klikken en voert u de tabeleditor uit in de geïntegreerde SPP auto link-software. Kies en klik vervolgens op Basic Immobilization in de lijst met beschikbare uitvoeringstabellen en volg de stappen van de experimentele procedure op het computerscherm. Klik vervolgens op Sample Set Editor in het formuliergedeelte om de reagentialijst in te vullen voor twee racks die in de autosampler zijn geplaatst voor verdere analyse.

Klik op Autosampler Direct Control als hulpmiddel in de menubalk om de racks naar voren of terug naar huis te brengen en kies vier graden Celsius als bedrijfstemperatuur. Start de pomp om dubbel gedestilleerd water te injecteren door op gereedschappen te klikken en directe regeling van de pomp te pompen. En leg gegevens vast door op SPR Instrument Direct Control te klikken.

En begin elke keer in het nieuw verschijnende venster. Nadat u de koppelreagentia in flacons van 300 microliter hebt toegevoegd, plaatst u ze in de autosampler-rekken en start u de run-tabel door op Uitvoeren te klikken. Voor de eenvoudige eiwit-eiwitinteractie voert u na het bijvullen van de pomp met 25.000 microliter per minuut de basislijnaanpassing gedurende 30 seconden uit.

Laat de daaropvolgende basislijnaanpassing met dubbel gedestilleerd water gedurende 1,5 minuut toe voordat u het geactiveerde chipoppervlak dooft met één molaire ethanolaminehydrochloride, pH 8,5. Schakel vervolgens de buizen van de vloeibare sampler naar de ontgasser van dubbel gedestilleerd water in de fles met HBS-EP + Klik op Formulier, scroll naar beneden en verander naar Nabewerking door op deze bewerkingsmodus te klikken. Klik vervolgens op Toevoegen om bindingscurven te selecteren die in de loop van de tijd in het gegevensplatform voor elke stroomcel zijn gegenereerd en exporteer de overlay als een scrubberbestand.

Klik vervolgens op Bestand om de opties voor het opslaan van bestanden te openen en responscurven te verkrijgen door linker- en rechtercurven uit te lijnen en signalen van het tweede referentiekanaal af te trekken van die van het ligandkanaal. Enkelvoudige injecties van CVN2L0 en variantie V2 en V5 werden eerst getest op binding aan de hemagglutinine gekoppelde sensorchip om de bindingscapaciteit te schatten met behulp van de autosampler en lopende tafeleditor. Herhaalde injecties werden geautomatiseerd in verschillende concentraties in het nanomolaire en micromolaire bereik in het systeem in de loop van de tijd, wat aantoonde dat er geen verzadiging op het chipoppervlak of evenwichtsbinding werd bereikt.

Concentratie versus respons werd uitgezet voor CVN wild-type binding aan RBD, uitgaande van specifieke targeting van mogelijk geconserveerde koolhydraten op de RBD S1-subeenheid met zwakkere affiniteit met een dissociatiesnelheidsconstante van 260 micromol. Dezelfde affiniteitsplot voor CVN2L0-V4-binding aan DM wordt niet langer analyseerbaar vanwege de vervanging van disulfidebindingen die interfereren met hoge affiniteitsbinding aan kleine geglycosyleerde peptiden en een hogere respons dan responsmaximumwaarde opleveren. CVN wild-type binding aan RBD op SARS-CoV-2 toont binding aan S-eiwit en RBD met een dissociatie woede constante van respectievelijk 18,6 micromol en 260 micromol.

Hoewel SPR-respons voor analytconcentraties resulteert in hoge responseenheden en typische SPR-sensorgrammen voor CVN wild-type en E41A-binding. De mutant is echter onstabiel wanneer hij verdund is. SPR-biosensing richt zich op bindingen met hoge affiniteit en lage affiniteit van gezuiverde eiwitten en zijn varianten op liganden.

In ons geval glycoproteïnen die gebruik maken van optische uitlezing en het tweekanaals stroomsysteem op het oppervlak van de sensorchip. Enzyme being immunosorbent assay is een alternatieve immunologische methode die eiwitepionaten herkent, maar ook gegevens levert over de concentratie van peptiden en kleine moleculen uit complexe matrices. Het testen van recombinant tot expressie gebrachte eiwitten door SPR-bindingstests omvatte biosensing van bevestigingsveranderingen die nuttig is voor de verificatie en voorspelling van eiwitstabiliteit per computationele eiwitzijde.