Imaging-guided bioreactor voor het genereren van bio-technisch luchtwegweefsel

Dit protocol maakt in vitro kweek en directe microscopische visualisatie van de geïsoleerde luchtwegweefsels mogelijk tijdens verschillende weefselmanipulatieprocedures, zoals de-epithelisatie en regeneratie van luchtwegweefsel. De in situ beeldvorming voorgesteld in deze studie maakt snelle en niet-destructieve monitoring van het tracheale lumen mogelijk tijdens beeldvormingsgeleide gecontroleerde verwijdering van het endogene epitheel en levering van de exogene cellen. Het beeldvormingsgestuurde bioreactieve platform en de weefselmanipulatieprotocollen kunnen worden gebruikt om bio-ingenieur luchtwegweefsel te genereren voor ziektemodellering en geneesmiddelenscreening.

De constructie en het gebruik van de beeldvormingsgerichte luchtwegweefselbioreactor zal worden gedemonstreerd door twee promovendi van onze onderzoeksgroep, Mohammad Mir en Jiawen Chen. Om te beginnen met het maken van een in-situ beeldvormingsapparaat, plaatst u een buislens in een stapelbare lensbuis en bevestigt u deze met een bevestigingsring. Monteer vervolgens de lenstafelassemblage op een wetenschappelijke CMOS-camera via een C-mount adapter.

Gebruik Micromanager-software om de camera te bedienen en foto's en video's te verkrijgen. Terwijl u mikt op een object op 10 meter van de camera, past u de afstand tussen de buislens en de beeldsensor van de camera aan totdat een scherp beeld van het object op het computerscherm wordt gevormd. Gebruik vervolgens optische kooisysteemcomponenten, zoals montagestang, kooiplaat met schroefdraad en kooikubus om een filterlens op een dubbele rand, superresolutie, dichroïsche spiegel en een laser op het apparaat te monteren.

Sluit een objectieflens van 20x aan op het apparaat. Monteer vervolgens een groene lens met een diameter van 500 micrometer aan het distale uiteinde van de lensbuis via de X-Y-vertaler. Pas de afstand tussen de groene en de objectieve lenzen aan om de scherpgestelde microscopische beelden te vormen.

Om het lumen van de geïsoleerde rattenpijp in helder veld of fluorescerend te visualiseren, plaatst u de bioreactor op het beeldvormingsstadium. Injecteer vervolgens 500 microliter van de vers bereide carboxyfluoresceïne succinimidylester, of CFSE-oplossing, met een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut door de luchtpijp via de spuitpomp die is aangesloten op de slang van de luchtpijpcanule. Zodra de CFSE-oplossing de luchtpijp vult, stopt u de pomp.

Was na 10 minuten het luchtpijplumen door 10 milliliter PBS toe te dienen met behulp van de spuitpomp om de resterende niet-geïncorporeerde CFSE-reagentia te verwijderen. Breng na de wasbeurt het distale beelduiteinde van de groene lens in de luchtpijp via de luerconnector die aan het ene uiteinde van de luchtpijp is bevestigd. Beweeg vervolgens voorzichtig de groene lens in de luchtpijp totdat het luchtpijpoppervlak is scherpgesteld.

Om de heldere veldbeelden in de micromanager-software vast te leggen, verlicht u het luchtpijplumen met wit licht door de kooikubus. Klik vervolgens op het live-pictogram om het lumenoppervlak van de luchtpijp in realtime weer te geven. Gebruik de tabbladen Imaging-instelling en Belichting om de belichtingstijd te wijzigen in de gewenste waarde.

Als u het contrast en de helderheid van afbeeldingen wilt aanpassen, gebruikt u het diagram- en intensiteitsschaalvenster om zwart-witpijlen op het eindpunt van de interactieve histogramweergave te verplaatsen. Klik op Live stoppen om het Snap-pictogram te activeren en klik vervolgens op het Snap-pictogram om de afbeelding te bevriezen. Gebruik vervolgens de instelling Exporteren en vervolgens Afbeeldingen als verplaatste tabbladen om de afbeeldingen in het gewenste formaat op te slaan.

Om foto's en video's in een fluorescerende modus te verkrijgen, verlicht u het luchtpijplumen met CFSE-specifiek laserlicht door de kooikubus en verkrijgt u de beelden in realtime door de beeldvormingsonde heen en weer te bewegen. Zodra de foto's en video's zijn verkregen, verwijdert u voorzichtig de groene lens uit de luchtpijp. Voor de de-epithelisatie van de luchtpijp, instilleer 50 microliter van het vers bereide 2% natriumdodecylsulfaat door de trachea canule om een dunne film van de wasmiddeloplossing op het luchtpijplumen te genereren.

Sluit na de instillatie de buisverbindingen van de bioreactor met behulp van mannelijke of vrouwelijke luerpluggen en breng de bioreactor gedurende 10 minuten over naar een incubator van 37 graden Celsius om het SDS in de luchtpijp te laten wonen. Herhaal de instillatie één keer. Verwijder na de tweede instillatie het gelyseerde epitheel en SDS door het luchtpijplumen driemaal te irrigeren met 500 microliter PBS via een spuitpomp met een debiet van 10 milliliter per minuut.

Plaats vervolgens de bioreactor op een shaker om mechanisch te trillen met een frequentie van 20 Hertz en een verplaatsingsamplitude van 0,3 millimeter om fysiek loslating van met SDS behandelde epitheelcellen uit het luchtpijplumen te bevorderen. Terwijl de luchtpijp mechanisch wordt getrild, indruppel 500 microliter PBS tweemaal door het luchtpijplumen om de resterende SDS en celresten te verwijderen. Evalueer na de verwijdering van het epitheel de klaring van de epitheellaag door de intensiteit van de CVSE te meten met behulp van het beeldvormingsapparaat met groene lens.

Na het bereiden van een gede-epithelialiseerde rattenluchtpijp, ontdooi bevroren mesenchymale stamcellen, of MSC's, gedurende 30 seconden in een waterbad van 37 graden Celsius. Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer, gevolgd door het bereiden van een celoplossing met een concentratie van vijf keer 10 tot de zes cellen per milliliter. Label vervolgens de cellen fluorescerend door ze te incuberen met twee milliliter 100-micromolaire CFSE-oplossing bij kamertemperatuur.

Spoel de cellen na 15 minuten driemaal met vijf milliliter PBS voordat u ze opnieuw opschordt in een vers DMEM-kweekmedium in een eindconcentratie van driemaal 10 tot de zeven cellen per milliliter. Onmiddellijk na de bereiding van collageen I hydrogel, zoals beschreven in het manuscript, voeg de cellen toe aan de hydrogel-oplossing met de gewenste concentratie. Meng vervolgens de cellen en geloplossing met een micropipette om een uniform cel-hydrogelmengsel te verkrijgen.

Bevestig vervolgens het ene uiteinde van de luchtpijp in de bioreactor aan een programmeerbare spuitpomp via een luerconnector en lever vijf milliliter vers kweekmedium in de bioreactorkamer bij 37 graden Celsius om het buitenoppervlak van de luchtpijp te bedekken. Dien vervolgens 10 microliter bolus van het cel-hydrogelmengsel toe aan de gede-epitheelvormige luchtpijp in de bioreactor om een cel-hydrogellaag op het luchtpijplumen te genereren. Plaats de bioreactor na celinjectie in een steriele celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor gellation gedurende 30 minuten om gelatie mogelijk te maken.

Om de verdeling van geïmplanteerde cellen te visualiseren, steriliseert u de groene lens met 70% isopropylalcohol of ethanol en plaatst u de bioreactor op het beeldvormingsstadium om de foto's en video's in zowel heldere veld- als fluorescerende modi te verkrijgen. Na 30 minuten celzaaien, infundeer een milliliter kweekmedium in het luchtpijplumen met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Kweek ten slotte de celgezaaide luchtpijp in de bioreactor in een incubator op 37 graden Celsius gedurende de gewenste tijd.

Houd tijdens de celkweek de media in het lumen statisch, terwijl media buiten de luchtpijp continu worden doordrenkt via een unidirectionele stroom. In de heldere veld- en fluorescerende beelden van de gede-epitheliseerde luchtpijp werd geen fluorescerend signaal waargenomen voorafgaand aan de CFSE-etikettering. Bij de CVSE werd een uniform fluorescerend signaal waargenomen in het hele epitheel.

Na de-epithelisatie was de fluorescerende intensiteit aanzienlijk afgenomen, wat wijst op ablatie van het epitheel. De hematoxyline- en eosinekleuring van de gede-epithelialiseerde luchtpijp illustreerde de verwijdering van het pseudo-gestratificeerde epitheel uit het luchtpijplumen en het behoud van cellen en extracellulaire matrix, of ECM-microstructuren, in onderliggende weefsellagen. Bovendien bevestigden de pentachrome en trichrome kleuring het behoud van luchtpijpweefselarchitectuur en ECM-componenten, zoals collageen en proteoglycanen.

De immunofluorescentie van epitheelcellen en collageen I onthulde volledige verwijdering van het epitheel en behoud van collageen I in het subepitheelweefsel. De scanning elektronenmicrofoto's gaven aan dat de inheemse luchtpijp bevolkt was met multicilliated en goblet cellen. In de gede-epitheliseerde luchtpijp werd het keldermembraan blootgesteld, zoals aangegeven door een mesh-netwerk van extracellulaire matrixvezels en de afwezigheid van epitheelcellen.

De fluorescentiebeelden van de gede-epithelialiseerde luchtpijp, bij het zaaien met PBS en collageen, worden hier getoond. Vergeleken met de cellen die via kweekmedium werden gezaaid, bleven de fluorescerend gelabelde cellen die via hydrogel werden afgeleverd gelijkmatiger over het lumen kleven. De cel levensvatbaarheidsstudie toonde aan dat de levensvatbaarheid niet werd beïnvloed door de celafgifteprocedure en dat meer dan 90% van de cellen levensvatbaar bleef.

Het creëren van een dunne film van wasmiddel in het de-epithelisatieproces en het gebruik van hydrogel als een leveringsvoertuig voor cellen zijn essentiële stappen voor het succes van dit protocol. Ons volgende onderzoeksdoel is om in het laboratorium gekweekte luchtweg primaire of stamcel te implanteren op het gede-epithelialiseerde luchtwegweefsel om te onderzoeken of functioneel luchtwegweefsel kan worden voorbereid.