Name: Fingerprinting Cardiolipine in leukocyten door massaspectrometrie voor een snelle diagnose van het Barth-syndroom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Leer cardiolipine fingerprinting in leukocyten met MALDI-TOF massaspectrometrie voor snelle diagnose van Barth-syndroom. Deze methode meet het monolysocardiolipine/cardiolipine-ratio met 100% sensitiviteit en specificiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn de mensen met BTHS en hun families dankbaar voor hun deelname aan ons onderzoek. We bedanken de Barth Syndrome Foundation US en de Barth Syndrome UK Trust voor hun steun en voor hun hulp bij het verzamelen van de bloedmonsters tijdens de jaarlijkse bijeenkomst in Bristol. Deze studie werd gefinancierd door Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus en Apulia Region.

Bloedmonsters van gezonde donoren en patiënten met hartfalen werden verzameld in het Policlinic Hospital van Bari (Italië), terwijl monsters van BTHS-patiënten werden verkregen door de National Health Service UK BTHS-kliniek in bristol Royal Hospital for Children (VK). Schriftelijke geïnformeerde toestemming van gezonde donoren, patiënten en ouders (indien van toepassing) en goedkeuringen door de respectieve ethische commissies werden verkregen.
OPMERKING: Indien niet onmiddellijk gebruikt, kan bloed (in K-EDTA gelbuis) worden bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 24-48 uur.
1. Isolatie van leukocyten door dextran sedimentatie van rode bloedcellen (RBC's)
<ol><li>Plaats bloedmonsters (in K-EDTA) op een orbitale shaker gedurende 10 minuten om bloed te mengen.</li>
	<li>Voeg aan 0,9 ml volbloed in een buis van 1,5 ml 0,1 ml 20% dextranoplossing (molecuulmassa > 100 kDa, in 0,9% NaCl) toe. Pipetteer en dispergeer de suspensie 20 keer voorzichtig, terwijl luchtbellen worden vermeden die anders RBC's aan de bovenkant van de buis zouden behouden. Laat RBC's ongeveer 1 uur bij kamertemperatuur bezinken.</li>
	<li>Verzamel en breng met behulp van een spuit het gele supernatant over naar een buis van 15 ml en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur bij 400 x g (geen rem, zwenkbakrotor).</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet die voornamelijk leukocyten en resterende RBC's bevat in 0,6 ml ijskoud bi-gedestilleerd water (ddH2O).</li>
	<li>Voeg na ~15 s 0,2 ml van 0,6 M KCl toe aan de celsuspensie om de juiste osmolariteit te herstellen. De korte osmotische shock zal RBC lyseren en leukocyten intact laten. Stel het uiteindelijke volume in op 2,5 ml met 1x PBS.</li>
	<li>Centrifugeer de ophanging bij 400 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (geen rem, zwenkbakrotor). Gooi het supernatant weg en was de leukocytenkorrel opnieuw met 2,5 ml 1x PBS.</li>
	<li>Centrifugeer zoals in stap 1.6 en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet met leukocyten in 200 μL gesteriliseerd ddH2O. OPMERKING: In de ervaring van de auteurs komt dit overeen met een eiwitgehalte variërend van 200 μg tot 400 μg.</li>
	<li>Vries de suspensie in bij -80 °C of voer de lipide-extractie als volgt direct uit.</li>
</ol>2. "Mini-extractie" van lipiden uit geïsoleerde leukocyten
<ol><li>Breng 20 μL leukocytensuspensie (ongeveer 20-40 μg eiwitten) over naar een buis van 1,5 ml en draai bij 16.000 x g gedurende 30 s.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg, voeg 10 μL CHCl3 toe aan de resterende pellet en pipetteer herhaaldelijk om lipide-extractie te bevorderen.</li>
	<li>Voeg ten slotte 10 μL 9-aminoacridine (9-AA) matrixoplossing (10 mg/ml 9-AA in 2-propanol/acetonitril, 60:40 v/v) toe aan de pellet in CHCl3. Pipetteer en dispergeer herhaaldelijk om te mengen.</li>
	<li>Draai de oplossing met lipiden in CHCl3 en 9-AA bij 16.000 x g gedurende 30 s en deponeer het supernatant vervolgens als druppeltjes van 0,35 μL (drie replicaties voor elk monster) op het te analyseren MALDI-doel (monsterplaat) ('gedroogde druppel'-afzettingsmethode).</li>
	<li>Laat de druppels minstens 10-15 min aan de lucht drogen.</li>
</ol>3. Lipidenanalyse door MALDI-TOF/MS
<ol><li>Verkrijg massaspectra van monsters in drielicaten op een MALDI-TOF massaspectrometer.</li>
	<li>Na kalibratie met lipidenstandaarden (zie Materiaaltabel), stelt u de analyses in de negatieve ionenmodus in en optimaliseert u het detectie m/z-bereik van 200 Th tot 2.000 Th voor analyse van kleine moleculen.</li>
	<li>Houd de laserfluence 5% boven de drempel (van CL en MLCL) om een S/N (ten minste 2) te hebben.</li>
	<li>Verkrijg spectra in reflectormodus met behulp van vertraagde gepulseerde extractie. Voor elk massaspectrum, gemiddeld 2.000 enkele laseropnamen (som van 4 x 500). Pas gated matrixonderdrukking toe op 400 Th om verzadiging van de detector te voorkomen.</li>
</ol>4. Hoe de (MLCL + CLi) / CLm-verhouding te berekenen
<ol><li>Voer de MALDI-TOF/MS-instrumentsoftware uit (zie Materiaaltabel) om de verkregen spectra te analyseren.</li>
	<li>Open met de opdracht Openen het dialoogvenster Spectrumbrowser waarmee u het gewenste spectrum kunt selecteren en laden.</li>
	<li>Klik in de menubalk op de pictogrammen Smooth Mass Spectrum en Subtract Mass Spectrum Baseline.</li>
	<li>Klik op Bestand > Exporteren > massaspectrum en kies het ASCII-formaat voor het exporteren van het spectrum als een tabel met twee kolommen met paren gegevenspunten: m / z (x) en intensiteit (y). Kopieer en plak de coördinaten in een spreadsheetprogramma (*.xls).</li>
	<li>Herhaal stap 4.2 tot en met 4.4 voor de drievoud van elk geanalyseerd monster en plak de coördinaten in hetzelfde spreadsheetprogrammabestand zoals weergegeven in figuur 1 (stap 1).</li>
	<li>Volg de x-bereiken in figuur 1 (stap 2) voor elke vermelde soort en bereken de som van de waarden y1, y2 en y3 (drievoudig) met de functie SOM om het piekgebied te krijgen (figuur 1; Stap 3).</li>
	<li>Voer het gemiddelde van de drievoudige gebiedswaarden uit per gemiddelde functie (figuur 1; Stap 3).</li>
	<li>Plaats de gemiddelde oppervlaktewaarden voor elke soort in de kolom zoals weergegeven in figuur 1 (stap 2).</li>
	<li>Om alleen de eerste isotopoloog van de CLm 72:7-soort als in28 te beschouwen, berekent u de isotopische correctie voor de overlapping tussen de M + 2 isotopoloog van de CLm 72:8 en de mono-isotopische piek van CLm 72:7 zoals weergegeven in figuur 1 (stap 4).</li>
	<li>Bereken ten slotte de (MLCL + CLi)/CLm-verhouding zoals weergegeven in figuur 1 (stap 5).</li>
</ol>

<ol><li>Barth, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+cardioskeletal+myopathy+and+neutropenia+%28Barth+syndrome%29%3A+respiratory-chain+abnormalities+in+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).</li>
<li>Steward, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((syndrome+%28X+linked+cardiac+and+skeletal+myopathy%2C+neutropenia%2C+and+organic+aciduria%29%3A+rarely+recognised%2C+frequently+fatal+%5Babstract%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract].</a> Archives of Disease in Childhood. 89, 48(2004).</li>
<li>Clarke, S. L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Barth syndrome.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23(2013).</li>
<li>Zegallai, H. M., Hatch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barth+syndrome%3A+cardiolipin%2C+cellular+pathophysiology%2C+management%2C+and+novel+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).</li>
<li>Taylor, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+presentation+and+natural+history+of+Barth+Syndrome%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).</li>
<li>Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+analysis+to+determine+the+prevalence+of+Barth+syndrome+in+the+pediatric+population%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population.</a> The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).</li>
<li>Bione, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+X-linked+gene%2C+G4.5.+is+responsible+for+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome.</a> Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).</li>
<li>Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven+functional+classes+of+Barth+Syndrome+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Seven functional classes of Barth Syndrome mutation.</a> Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).</li>
<li>Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+symmetry+in+mitochondrial+cardiolipins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).</li>
<li>Schlame, M., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+Tafazzin%2C+a+mitochondrial+phospholipid-lysophospholipid+acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).</li>
<li>Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+and+functional+role+of+cardiolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis and functional role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+membrane+domains+in+prokaryotes+and+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).</li>
<li>Claypool, S. M., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+cardiolipin+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The complexity of cardiolipin in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).</li>
<li>Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+mitochondrial+cardiolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).</li>
<li>Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cardiolipin+in+mitochondrial+function+and+dynamics+in+health+and+disease%3A+Molecular+and+pharmacological+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects.</a> Cells. 8 (7), 728(2019).</li>
<li>Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+ebb+and+flow+makes+mitochondria+go%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131(2020).</li>
<li>Schlame, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+abnormalities+in+children+with+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).</li>
<li>Wortmann, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+metabolism+with+3-methylglutaconic+aciduria+as+discriminative+feature%3A+proper+classification+and+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).</li>
<li>Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+3-methylglutaconic+acid+in+disorders+of+mitochondrial+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).</li>
<li>Kulik, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bloodspot+assay+using+HPLC-tandem+mass+spectrometry+for+detection+of+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome.</a> Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).</li>
<li>Vaz, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+functional+assay+in+blood+spot+to+diagnose+Barth+syndrome+using+the+monolysocardiolipin%2Fcardiolipin+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).</li>
<li>Bowron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Barth+syndrome+using+a+novel+LC-MS%2FMS+method+for+leukocyte+cardiolipin+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometric+analysis+of+cellular+glycerophospholipids+enabled+by+multiplexed+solvent+dependent+analyte-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).</li>
<li>Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+of+useful+MALDI+matrices+for+the+mass+spectrometric+characterization+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids.</a> Biomolecules. 8 (4), 173(2018).</li>
<li>Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF%2FMS+analysis+of+archaebacterial+lipids+in+lyophilized+membranes+dry-mixed+with+9-aminoacridine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine.</a> The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).</li>
<li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+of+intact+mitochondria+by+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS.</a> The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).</li>
<li>Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+method+for+the+determination+of+PC%2FLPC+ratio+in+intact+horse+serum+by+MALDI-TOF-MS%3A+an+easy-to-follow+lipid+biomarker+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).</li>
<li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+fingerprinting+of+leukocytes+by+MALDI-TOF%2FMS+as+a+screening+tool+for+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome.</a> The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).</li>
<li>Lobasso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipidomic+approach+to+identify+potential+biomarkers+in+exosomes+from+melanoma+cells+with+different+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential.</a> Frontiers in Physiology. 12, 748895(2021).</li>
<li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cholesterol+in+the+brain+by+on-tissue+derivatization+and+quantitative+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).</li>
<li>Greco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics.</a> Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).</li>
<li>Duncan, M., DeMarco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-MS%3A+Emerging+roles+in+pathology+and+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Mass+Spectrometry+%28Del+Mar%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine.</a> Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren dat de studie werd uitgevoerd in afwezigheid van een commerciële of financiële relatie die zou kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Barth-syndroom is een aangeboren fout van het metabolisme en een levensveranderende aandoening die waarschijnlijk ondergediagnosticeerd is 2,6. Zoals eerder vermeld, kan een bijdragende factor het ontbreken van een eenvoudige diagnostische test zijn. Hier werd een eenvoudige en snelle methode beschreven om de MLCL/CL-verhouding door MALDI-TOF/MS in leukocyten te meten voor BTHS-screening. Bovendien zijn MALDI-TOF massaspectrometers wijd verspreid over klinis...

Barth-syndroom (BTHS) is een zeldzame X-gebonden ziekte die wordt gekenmerkt door cardiomyopathie met vroege aanvang, myopathie van de skeletspieren, groeivertraging, neutropenie, variabele mitochondriale respiratoire ketendisfunctie en abnormale mitochondriale structuur 1,2,3,4,5. BTHS heeft een prevalentie van één geval per miljoen mannen met momenteel minder dan 250 bekende gevallen wereldwijd, hoewel het algemeen wordt aanvaard dat de ziekte ondergediagnosticeerd is 2,6. BTHS is het gevolg van functieverliesmutaties van het Tafazzin (TAFAZZIN)-gen gelokaliseerd op chromosoom Xq28.12 7,8, waardoor een gebrekkige remodellering van het mitochondriale fosfolippide-cardiolipine (CL) ontstaat, een proces dat normaal gesproken leidt tot een zeer symmetrische en onverzadigde acylsamenstelling 9,10. CL wordt beschouwd als het kenmerkende lipide van mitochondriën, waar het een belangrijk bestanddeel van het binnenmembraan is, van vitaal belang voor oxidatieve fosforylering (d.w.z. mitochondriaal energiemetabolisme), supercomplexvorming, eiwitimport en betrokken bij mitochondriale dynamica, mitofagie en apoptose 11,12,13,14,15,16 . Bij TAFAZZIN-functieverlies mislukt cl-remodellering en ontstaan specifieke fosfolipideafwijkingen in mitochondriën van BTHS-patiënten: het volwassen CL-niveau (CLm) is verlaagd, terwijl verhoogde niveaus van monolysocardiolipine (MLCL) en veranderde CL-acylsamenstelling (d.w.z. onrijpe CL-soorten, CLi) optreden. Dit brengt een dramatische stijging van de MLCL/CL-ratio17 met zich mee.
De diagnose van BTHS is vaak moeilijk, omdat de aandoening extreem variabele klinische en biochemische kenmerken vertoont en in de loop van de tijd kan verschillen tussen getroffen personen uit dezelfde familie en binnen een patiënt 3,5. Veel BTHS-jongens vertonen een zeer hoog niveau van uitscheiding van 3-methylglutaconzuur (3-MGCA) in de urine, maar het urineniveau kan normaal zijn of slechts licht verhoogd bij patiënten in de loop van de tijd3. Verhoogde 3-MGCA is echter een kenmerk van verschillende andere mitochondriale en niet-mitochondriale aandoeningen, zoals 3-methylglutaconyl-CoA hydratasedeficiëntie (AUH-defect), 3-methylglutaconzuuracidurie, dystonie-doofheid, encefalopathie, Leigh-achtig (MEGDEL) -syndroom, Costeff-syndroom en gedilateerde cardiomyopathie met ataxie (DCMA) -syndroom18,19 . Vandaar dat de slechte specificiteit van 3-MCGA als marker voor BTHS en de enorme variabiliteit bij patiënten de biochemische diagnose dubbelzinnig maken.
Bovendien zijn er meer dan 120 verschillende TAFAZZIN-mutaties beschreven die de aandoening5 veroorzaken en daarom kan een genetische diagnose ingewikkeld, traag en duur zijn. Bovendien kan moleculaire analyse van het TAFAZZIN-gen leiden tot vals-negatieve resultaten in de aanwezigheid van mutaties in niet-coderende of regulerende sequenties3. BTHS kan ondubbelzinnig worden getest door de relatieve hoeveelheden en verdeling van (monolyso-)CL-soorten te bepalen en bevestigd door TAFAZZIN-gensequencing of vice versa.
Een praktijktest voor diagnose is het meten van de MLCL/CL-verhouding door middel van High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) en Electro Spray Ionization / Mass spectrometry (ESI/MS) analyse in bloedvlek20,21. Het meten van het CL-niveau alleen is niet voldoende voor de diagnose, omdat sommige patiënten bijna normale niveaus van CL hebben, maar een veranderde MLCL / CL-verhouding. Daarom heeft de meting van de MLCL/CL-ratio 100% sensitiviteit en specificiteit voor BTHS-diagnose21. Een andere gevalideerde methode op basis van HPLC- en ESI/MS-analyse is opgezet op leukocyten22, maar de complexe chromatografische technieken voor scheiding van eerder geëxtraheerde lipiden en de duurheid van de instrumenten beperken deze analyse tot enkele klinische laboratoria. Al deze factoren, samen met het ontbreken van een eenvoudige diagnostische test, hebben bijgedragen aan de onderdiagnose van de aandoening.
MALDI-TOF/MS is een ander geldig hulpmiddel in lipidenanalyse23,24. Deze analytische techniek kan worden gebruikt om direct lipideprofielen van verschillende biologische monsters te verkrijgen, waardoor extractie- en scheidingsstappen 25,26,27,28,29 worden overgeslagen, inclusief in weefselsecties voor MS Imaging-toepassingen 30. Gezien dit voordeel werd een eenvoudige en snelle methode ontwikkeld om BTHS te diagnosticeren door mitochondriale CL in intacte leukocyten te profileren met MALDI-TOF/MS28. Leukocytenisolatie van slechts 1 ml volbloed door erytrocytenbezinking en lysis is eenvoudig en vereist geen speciale apparatuur of reagentia. Bovendien werd een snel lipide "mini-extractie" protocol beschreven dat van toepassing is op minieme hoeveelheden leukocyten om de succesvolle verwerving van spectra met schonere MS-signalen met een hogere signaal-ruisverhouding (S / N) te rechtvaardigen dan in die verkregen uit intacte leukocyten28. Deze verdere stap kost weinig tijd en zorgt ervoor dat analyses reproduceerbaar zijn, zelfs wanneer ze worden uitgevoerd op MS-instrumenten met een slechte gevoeligheid. Kortom, de hier beschreven analysemethode vereist minimale monstervoorbereiding omdat tijdrovende en arbeidsintensieve chromatografische lipidescheiding kan worden overgeslagen, waardoor de test wordt versneld.

<table><tbody><tr><td>1,1&prime;,2,2&prime;-tetratetradecanoyl cardiolipin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>750332</td><td>Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie</td></tr><tr><td>1,1&prime;2,2&prime;-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>710335</td><td>Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie</td></tr><tr><td>1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>878130</td><td>Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie</td></tr><tr><td>1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfaat</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>830845</td><td>Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie</td></tr><tr><td>1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-fosfo-(1&prime;-rac-glycerol)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840445</td><td>Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie</td></tr><tr><td>1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840033</td><td>Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie</td></tr><tr><td>2-Propanol, ACS reagens, &ge;99.5%</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>9-Aminoacridine hemihydraat, 98%</td><td>Acros Organics</td><td>134410010</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, ACS reagens, &ge;99.5%</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>360457</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform, ACS reagens, &ge;99.8%</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>Dextran van Leuconostoc spp. Mr 450.000-650.000</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>Flex Analysis 3.3</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>MALDI-TOF massaspectrometer Microflex LRF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Office</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>OmniPur 10X PBS Vloeibaar Concentraat</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>6505-OP</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride, ACS reagens, 99,0-100,5%</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride, ACS reagens, &ge;99,0%</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td><td>S9888</td><td></td></tr></tbody></table>

fingerprinting cardiolipine in leukocyten door massaspectrometrie voor een snelle diagnose van het barth-syndroom

Fingerprinting Cardiolipin in Leukocytes by Mass Spectrometry for a Rapid Diagnosis of Barth Syndrome

Cardiolipine (CL), een dimerisch fosfolipide met vier vetzuurketens in zijn structuur, is de lipidemarker van mitochondriën, waarbij het een cruciale rol speelt in de werking van het binnenmembraan. De metaboliet monolysocardiolipin (MLCL) is fysiologisch bijna afwezig in het lipide-extract van dierlijke cellen en het uiterlijk ervan is het kenmerk van het Barth-syndroom (BTHS), een zeldzame en vaak verkeerd gediagnosticeerde genetische ziekte die ernstige cardiomyopathie in de kindertijd veroorzaakt. De hier beschreven methode genereert een "cardiolipine-vingerafdruk" en maakt een eenvoudige test van de relatieve niveaus van CL- en MLCL-soorten in cellulaire lipideprofielen mogelijk. In het geval van leukocyten is slechts 1 ml bloed nodig om de MLCL / CL-verhouding te meten via matrixondersteunde laserdesorptie-ionisatie - time-of-flight / massaspectrometrie (MALDI-TOF / MS) net binnen 2 uur na bloedonttrekking. De test is eenvoudig en kan gemakkelijk worden geïntegreerd in het routinewerk van een klinisch biochemisch laboratorium om te screenen op BTHS. De test toont 100% sensitiviteit en specificiteit voor BTHS, waardoor het een geschikte diagnostische test is.

In deze studie is een eenvoudige en snelle methode beschreven voor het isoleren van leukocyten uit 1 ml volbloed en het verkrijgen van CL-vingerafdrukken door MALDI-TOF/MS (zie figuur 2). Figuur 3 toont de vergelijking van representatieve CL-vingerafdrukken van leukocyten, verkregen van controlepersonen en BTHS-jonge jongens, in het CL- en MLCL-massabereik (m/z). Tabel 1 geeft een overzicht van CL- en MLCL-soorten die in deze massaspect...

Dit protocol laat zien hoe een massaspectrometrische "vingerafdruk" van leukocyten cardiolipine kan worden verkregen voor de diagnose van het Barth-syndroom. De beoordeling van de verhoogde monolysocardiolipine tot cardiolipine ratio onderscheidt patiënten met barthsyndroom van controle hartfalen patiënten met 100% sensitiviteit en specificiteit.

Fingerprinting Cardiolipine in leukocyten door massaspectrometrie voor een snelle diagnose van het Barth-syndroom

Cardiolipin (CL), a dimeric phospholipid carrying four fatty acid chains in its structure, is the lipid marker of mitochondria, wherein it plays a crucial ...

Deze methode genereert een cardiolipine vingerafdruk van leukocyten door MALDI-TOF massaspectrometrie en maakt het mogelijk om de verhouding tussen monolysocardiolipine en cardiolipine te meten voor een snelle diagnose van het Barth-syndroom. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de detectie van diagnostische lipidesoorten door een enkele ronde massaspectrometrie onmiddellijk na de isolatie van leukocyten uit één milliliter bloed. Deze en de ooggevoeligheid en specificiteit maken deze test een geschikte diagnostische test om te worden geïntegreerd in het routinewerk van klinische laboratoria om te screenen op het Barth-syndroom.Begin met het plaatsen van bloedmonsters op een orbitale shaker gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens aan 0,9 milliliter volbloed in een buis van 1,5 milliliter 0,1 milliliter 20% dextran toe. Pipetteer en dispergeer de suspensie nu 20 keer voorzichtig terwijl luchtbellen worden vermeden en laat RBC's ongeveer een uur bij kamertemperatuur bezinken.Verzamel en breng het gele supernatant met behulp van een spuit over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur bij 400 maal G. Na het weggooien van

fingerprinting-cardiolipin-leukocytes-mass-spectrometry-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in de expressie profiel van glycosfingolipiden antigenen in het immuunsysteem organen en cellen wordt beschreven. De methode maakt gebruik van de ion trap massaspectrometrie waardoor stapsgewijze versnippering van glycosfingolipiden moleculen voor structurele analyse in vergelijking met chemisch gesynthetiseerde standaard.

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

This video demonstrates a capillary electrophoresis immunoassay protocol for detecting a protein biomarker associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human blood platelets. Confirmation of the presence of the ALS biomarker protein is achieved through size-based separation of the platelet proteins followed by chemiluminescent detection.

A Capillary Electrophoresis Immunoassay for Protein Biomarker Detection

Desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie (DESI-MS) is een ambient methode waarbij monsters, met inbegrip van biologische weefsels, kunnen worden afgebeeld met een minimale monstervoorbereiding. Door rastering het monster onder de ionisatie-elektrode, deze spray-gebaseerde techniek voldoende ruimtelijke resolutie om moleculaire kenmerken van belang te onderscheiden binnen coupes.

Beeldvorming van biologische weefsels door desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie

Het meten van biomarkers in complexe biologische monsters wordt in toenemende mate leidend klinische besluitvorming. We beschrijven een zeer gevoelige methode voor het gelijktijdig meten cardiale myosine bindend eiwit C, creatine kinase MB, troponine I en in serummonsters van patiënten met myocardiaal infarct en gezonde controlepersonen.

Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Biomarkers zijn direct gemeten biologische indicatoren van ziekte of gezondheid. Van de bevolking en de sociale wetenschappen, moeten biomarkers te zijn gemakkelijk te verkrijgen, het vervoer, en te analyseren. Gedroogde Blood Spot (DBS) collectie voldoet aan deze behoefte, kunnen worden verzameld in het veld met hoge respons en voor een verscheidenheid van biomarkers geanalyseerd.

Gedroogde Blood Spot Collectie van Volksgezondheid Biomarkers voor deelname aan Population Studies maximaliseren

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Op bloed gebaseerde biomarkers voor neurodegeneratieve ziekten zijn essentieel voor de uitvoering van grootschalige klinische studies. Een betrouwbare en gevalideerde bloedtest moet een klein monstervolume vereisen en een minder invasieve bemonsteringsmethode zijn, betaalbaar en reproduceerbaar. Dit document toont aan dat hoog-doorvoer capillaire elektroforese immunoassay voldoet aan criteria voor mogelijke biomarker ontwikkeling.

Gebruik van capillaire elektrofoforese immunoassay om te zoeken naar potentiële biomarkers van amyotrofische laterale sclerose in menselijke bloedplaatjes

Hierin beschrijven we de protocollen om de hoeveelheid fluorescerende fosfolipide te meten die specifiek uit lipidedonordeeltjes wordt verwijderd door lipoproteïne met hoge dichtheid (HDL) die aanwezig is in volledig menselijk plasma of serum. We hebben aangetoond dat deze metriek van HDL-functionaliteit incidentele hart- en vaatziekten voorspelt.

Lipoproteïne-specifieke fosfolipide-effluxtest met hoge dichtheid

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Leer cardiolipine fingerprinting in leukocyten met MALDI-TOF massaspectrometrie voor snelle diagnose van Barth-syndroom. Deze methode meet het monolysocardiolipine/cardiolipine-ratio met 100% sensitiviteit en specificiteit.

Fingerprinting Cardiolipine in leukocyten door massaspectrometrie voor een snelle diagnose van het Barth-syndroom

Meer video's verkennen