Name: Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer co-cultuur van murine dunne darm organoïden met type-1 aangeboren lymfoïde cellen. Deze methode onderzoekt bidirectionele interacties tussen epitheelcellen en ILC1 voor darmbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

E.R. erkent een Ph.D. fellowship van de Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. erkent een Ph.D. fellowship van de Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. erkent een Ph.D. studentship van de NIHR GSTT BRC. J.F.N. erkent een Marie Skłodowska-Curie Fellowship, een King's Prize fellowship, een RCUK/UKRI Rutherford Fund fellowship (MR/R024812/1) en een Seed Award in Science van de Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). We bedanken ook het BRC flowcytometrie kernteam in Guy's Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 reporter muizen waren een gulle gift van G. Eberl (Institut Pasteur, Parijs, Frankrijk). CD45.1 C57BL/6 muizen werden vriendelijk gegeven door T. Lawrence (King's College London, Londen) en P. Barral (King's College London, Londen).

<ol><li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mend+your+fences%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mend your fences.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li>
<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).</li>
<li>Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cell-epithelial+cell+modules+sustain+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis.</a> Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).</li>
<li>Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+major+players+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+10+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: 10 years on.</a> Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).</li>
<li>Klose, C. S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+type+1+ILCs+from+a+common+progenitor+to+all+helper-like+innate+lymphoid+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages.</a> Cell. 157 (2), 340-356 (2014).</li>
<li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+and+-23+control+plasticity+of+CD127%2B+group+1+and+group+3+innate+lymphoid+cells+in+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria.</a> Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).</li>
<li>Jowett, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ILC1+drive+intestinal+epithelial+and+matrix+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling.</a> Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).</li>
<li>Wong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+ROR%CE%B1+is+critical+for+nuocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor RORα is critical for nuocyte development.</a> Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).</li>
<li>Neill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuocytes+represent+a+new+innate+effector+leukocyte+that+mediates+type-2+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity.</a> Nature. 464, 1367-1370 (2010).</li>
<li>Mjösberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA3+is+essential+for+the+function+of+human+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).</li>
<li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-25-responsive%2C+lineage-negative+KLRG1hi+cells+are+multipotential+%27inflammatory%27+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529, 221-225 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529, 226-230 (2016).</li>
<li>Eberl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+nuclear+receptor+RORgamma%28t%29+in+the+generation+of+fetal+lymphoid+tissue+inducer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells.</a> Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+lymph+nodes+collect+CD4%2BCD3-+LTbeta%2B+cells+that+can+differentiate+to+APC%2C+NK+cells%2C+and+follicular+cells+but+not+T+or+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells.</a> Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).</li>
<li>Lindemans, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+intestinal-stem-cell-mediated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration.</a> Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).</li>
<li>Meininger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+features+of+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific features of innate lymphoid cells.</a> Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).</li>
<li>Dutton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+innate+lymphoid+cell+populations+at+different+sites+in+mice+with+defective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity.</a> Wellcome Open Research. 2, 117(2018).</li>
<li>Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+innate+lymphoid+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of innate lymphoid cell subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).</li>
<li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+type+1+innate+lymphoid+cells+accumulate+in+inflamed+mucosal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues.</a> Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).</li>
<li>Date, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-gut+organoids%3A+reconstitution+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).</li>
<li>Bartfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+infectious+diseases+and+host-microbe+interactions+in+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids.</a> Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Tallapragada, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflation-collapse+dynamics+drive+patterning+and+morphogenesis+in+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lymphocytes+from+the+mouse+small+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281(2018).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+maintenance+of+mouse+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells.</a> Bio-protocol. 6 (4), 1733(2016).</li>
<li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).</li>
<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Cardoso, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+type+2+innate+lymphoid+cells+via+neuromedin+U%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U.</a> Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).</li>
<li>Gury-BenAri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+and+regulatory+landscape+of+intestinal+innate+lymphoid+cells+are+shaped+by+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome.</a> Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).</li>
<li>Seehus, C., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+murine+innate+lymphoid+cells+from+common+lymphoid+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells.</a> Bio-protocol. 6 (6), 1770(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Dit protocol beschrijft de methoden voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van zeldzame ILC1 door het minimaliseren van het verlies van lymfocyten tijdens het intestinale dissociatieprotocol en het vaststellen van co-culturen tussen deze twee compartimenten. Er zijn veel stappen in dit protocol, en hoewel sommige specifiek zijn voor ILC1's, kan deze aanpak worden toegepast op andere intestinale immuunceltypen en kunnen co-kweekopstellingen modulair worden aangepast aan individuele onderzoeks...

Communicatie tussen het darmepitheel en het darm-residente immuunsysteem staat centraal in het onderhoud van intestinale homeostase1. Verstoringen van deze interacties worden geassocieerd met zowel lokale als systemische ziekten, waaronder inflammatoire darmziekte (IBD) en gastro-intestinale kankers2. Een opmerkelijk voorbeeld van een meer recent beschreven kritische regulator van homeostase komt uit de studie van aangeboren lymfoïde cellen (LIC's), die naar voren zijn gekomen als belangrijke spelers in het intestinale immuunlandschap3. ILCs zijn een groep heterogene aangeboren immuuncellen die intestinale homeostase reguleren en ontstekingen grotendeels orkestreren via cytokine-gemedieerde signalering4.
Murine ILCs zijn grofweg onderverdeeld in subtypen op basis van transcriptiefactor, receptor en cytokine expressieprofielen5. Type-1 ILCs, waaronder cytotoxische Natural Killer (NK) cellen en helper-achtige type-1 ILCs (ILC1s), worden gedefinieerd door expressie van de transcriptiefactor (eomesodermin) Eomen en T-box eiwit uitgedrukt in T-cellen (T-bet)6, respectievelijk, en scheiden cytokines geassocieerd met T helper type-1 (TH1) immuniteit: interferon-γ (IFNγ) en tumor necrose factor (TNF), in reactie op interleukine (IL)-12, IL-15 en IL-187. Tijdens homeostase scheiden weefselbewonende ILC1's Transforming Growth Factor β (TGF-β) uit om epitheliale proliferatie en matrixremodellering8 te stimuleren. Type-2 ILCs (ILC2's) reageren voornamelijk op worminfectie via secretie van T-helper type-2 (TH2) geassocieerde cytokines: IL-4, IL-5 en IL-13, en worden gekenmerkt door de expressie van retinoïnezuur-gerelateerde weesreceptor (ROR) α (ROR-α)9 en GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Bij muizen worden intestinale "inflammatoire" ILC2's verder gekenmerkt door expressie van Killer cell lectine-achtige receptor (subfamilie G-lid 1, KLRG)13 waar ze reageren op epitheliale plukcel afgeleide IL-2514,15. Ten slotte zijn type-3 ILCs, waaronder lymfoïde weefselinductorcellen en helperachtige type-3 ILCs (ILC3s), afhankelijk van de transcriptiefactor ROR-γt16 en clusteren ze zich in groepen die Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), IL-17 of IL-22 afscheiden als reactie op lokale IL-1β- en IL-23-signalen17. Lymfoïde weefselinductorcellen clusteren in Peyer's patches en zijn cruciaal voor de ontwikkeling van deze secundaire lymfoïde organen tijdens de ontwikkeling18, terwijl ILC3's het meest voorkomende ILC-subtype zijn in de volwassen muriene dunne darm lamina propria. Een van de vroegste muriene intestinale organoïde co-kweeksystemen met ILC3's werd gebruikt om de impact van het cytokine IL-22 op signaaltransducer en activator van transcriptie 3 (STAT-3) gemedieerde Leucine-Rich Repeat Containing G Protein Coupled Receptor 5 (Lgr5) + intestinale stamcelproliferatie19 uit elkaar te halen, een krachtig voorbeeld van een regeneratieve ILC-epitheliale interactie. ILCs vertonen imprint-heterogeniteit tussen organen20,21 en vertonen plasticiteit tussen subsets als reactie op polariserende cytokines22. Wat deze weefselspecifieke indrukken en plasticiteitsverschillen drijft, en welke rol ze spelen bij chronische ziekten zoals IBD23, blijven spannende onderwerpen die kunnen worden aangepakt met behulp van organoïde co-culturen.
Intestinale organoïden zijn naar voren gekomen als een succesvol en betrouwbaar model om het darmepitheelte bestuderen 24,25. Deze worden gegenereerd door het kweken van intestinale epitheliale Lgr5 + stamcellen, of hele geïsoleerde crypten, waaronder Paneth-cellen als een endogene bron van Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Deze 3D-structuren worden onderhouden in synthetische hydrogels26 of in biomaterialen die de basale lamina propria nabootsen, bijvoorbeeld Thermal-crosslinking Basal Extracellular Matrix (TBEM), en worden verder aangevuld met groeifactoren die de omliggende niche nabootsen, met name Epithelial Growth Factor (EGF), de Bone Morphogenetic Protein (BMP)-inhibitor Noggin en een Lgr5-ligand en Wnt-agonist R-Spondin127 . Onder deze omstandigheden handhaven organoïden epitheliale apico-basale polariteit en recapituleren ze de crypt-villi-structuur van het darmepitheel met ontluikende stamcelcrypten die terminaal differentiëren in absorberende en secretoire cellen in het midden van de organoïde, die vervolgens door anoikis 28 in het interne pseudolumenworden afgeworpen. Hoewel intestinale organoïden alleen al enorm voordelig zijn geweest als reductionistische modellen van epitheliale ontwikkeling en dynamiek in isolatie29,30, hebben ze een enorm toekomstig potentieel om te begrijpen hoe dit gedrag wordt gereguleerd, beïnvloed of zelfs verstoord door het immuuncompartiment.
In het volgende protocol wordt een methode van co-kweek tussen muriene dunne darm organoïden en lamina propria afgeleide ILC1's beschreven, die onlangs werd gebruikt om te identificeren hoe deze populatie onverwacht intestinale signaturen van ontsteking vermindert en in plaats daarvan bijdraagt aan verhoogde epitheliale proliferatie via TGF-β in dit systeem8.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (BV510)</td><td>BioLegend</td><td>103137</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse NK1.1 (PE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-5941-83</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD127 Monoclonal Antibody (APC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>COLLAGENASE D, 500MG</td><td>Merck</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells</td><td>Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II)</td><td>Merck</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNASE I, GRADE II</td><td>Merck</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>Ethilenediamine Tetraacetate Acid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2482-100</td><td></td></tr><tr><td>FC block</td><td>2B Scientific</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>3050-038</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (10X)</td><td>Gibco</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1X)</td><td>Gibco</td><td>12549069</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T- mNoggin-Fc Cells</td><td>Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5893-82</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine (500mM)</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1 X) 7.2 pH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12549079</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>247-GMP</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-2 (carrier free)</td><td>BioLegend</td><td>589106</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse IL-7 (carrier free)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>407-ML-005/CF</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td><td>Bio-techne</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tube</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>10 mL pippette</td><td>StarLab</td><td>E4860-0010</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tube</td><td>Falcon</td><td>11507411</td><td></td></tr><tr><td>25 mL pippette</td><td>StarLab</td><td>E4860-0025</td><td></td></tr><tr><td>p10 pippette tips</td><td>StarLab</td><td>S1121-3810-C</td><td></td></tr><tr><td>p1000 pippette tips</td><td>StarLab</td><td>I1026-7810</td><td></td></tr><tr><td>p200 pippette tips</td><td>StarLab</td><td>E1011-0921</td><td></td></tr><tr><td>Standard tissue culture treated 24-well plate</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 and temperature controled incubator</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R/S</td><td></td></tr><tr><td>Flow Assisted Cellular Sorter</td><td>BD equipment</td><td>FACS Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Heated shaker</td><td>Stuart Equipment</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Ice box</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)</td><td></td></tr><tr><td>p10 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000016</td><td></td></tr><tr><td>p1000 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000063</td><td></td></tr><tr><td>p200 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000032</td><td></td></tr><tr><td>Pippette gun</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Wet ice</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complexe co-culturen van organoïden met immuuncellen bieden een veelzijdig hulpmiddel voor het onderzoeken van de bidirectionele interacties die de delicate balans van mucosale homeostase ondersteunen. Deze 3D, multicellulaire systemen bieden een reductionistisch model voor het aanpakken van multifactoriële ziekten en het oplossen van technische problemen die zich voordoen bij het bestuderen van zeldzame celtypen zoals weefselbewonende aangeboren lymfoïde cellen (LIC's). Dit artikel beschrijft een muizensysteem dat dunne darmorganoïden en dunne darm lamina propria afgeleide helper-achtige type-1 ILCs (ILC1's) combineert, die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar andere ILC- of immuunpopulaties. ILCs zijn een weefsel-residente populatie die bijzonder verrijkt is in het slijmvlies, waar ze homeostase bevorderen en snel reageren op schade of infectie. Organoïde coculturen met ILCs zijn al begonnen met het werpen van licht op nieuwe epitheliaal-immuun signaleringsmodules in de darm, wat onthult hoe verschillende ILC-subsets de integriteit en regeneratie van intestinale epitheliale barrières beïnvloeden. Dit protocol zal verder onderzoek mogelijk maken naar wederzijdse interacties tussen epitheel- en immuuncellen, die het potentieel hebben om nieuwe inzichten te verschaffen in de mechanismen van mucosale homeostase en ontsteking.

Wanneer ze met succes zijn voltooid, moeten vers geïsoleerde crypten binnen 2-4 dagen ontluikende cryptestructuren vormen (figuur 1A). Gezonde en robuuste organoïde culturen moeten actief groeien en kunnen worden gepasseerd en uitgebreid zoals beschreven in het protocol.
Dit protocol beschrijft de isolatie van dunne darm ILC1 van de RORγtGFP murine transgene reporterlijn, die de isolatie van levende ILC1 door FACS mogelijk maakt (fi...

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Dit protocol biedt een belangrijk hulpmiddel om de interacties tussen intestinale immuuncellen en het epitheel te bestuderen en om te ontleden hoe deze interacties kunnen reguleren in intestinale homeostase en ontsteking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de voortreffelijke hoeveelheid experimentele controle die wordt vergemakkelijkt door het reductie-in vitromodel, dat kan worden gebruikt om vragen in epitheliale en immuunbiologie aan te pakken. Dit systeem is al gebruikt om de rol van ILC1 in de uitbreiding van CD44-positieve epitheliale crypten te bepalen en heeft het potentieel om ons begrip van ontstekingsgemedieerde gastro-intestinale ziekten verder te bevorderen.Plaats om te beginnen thermische cross-linking basale extracellulaire matrix op ijs om een standaard weefselkweekbehandelde 24-well plaat te ontdooien en voor te verwarmen door deze in een incubator van 37 graden Celsius te plaatsen. Verwijder daarna de plaat met organoïden uit de incubator en gooi de media weg uit de put die moet worden gepasseerd. Voeg vervolgens 500 microliter ijskoude geavanceerde DMEM F12 toe aan de putten en oogst met behulp van een P-1000-tip de organoïden uit alle putten in een

co-culture-murine-small-intestine-epithelial-organoids-with-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Uit stamcellen afgeleide culturen bevatten een enorm potentieel om infectieziekten te modelleren. Hier wordt de kweek van muis en menselijke gastrische organoïden, afgeleid van volwassen stamcellen, beschreven. De organoïden worden gemicro-injecteerd met het gastrische pathogeen Helicobacter pylori.

Organoids als model voor Infectieziekten: cultuur van de mens en muizen Maag Organoids en Micro-injectie van Helicobacter pylori

Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids

In dit protocol beschrijven we hoe murine primaire epitheliale colon monolayers rechtstreeks uit intestinale crypten kunnen worden gegenereerd. We bieden experimentele benaderingen om samenvloeiende monolagen te genereren op doorlatende filters, confluente monolagen voor kraswondgenezing en biochemische studies, en schaarse en samenvloeiende monolagen voor immunofluorescentieanalyse.

Generatie van Murine Primaire Colon Epitheliale Monolayers uit Intestinal Crypts

Hier presenteren we twee protocollen die het modelleren van intestinale apicale-specifieke interacties mogelijk maken. Organoïde-afgeleide intestinale monolagen en Air-Liquid Interface (ALI) culturen vergemakkelijken de generatie van goed gedifferentieerde epithelia toegankelijk vanaf zowel luminale als basolaterale zijden, terwijl polariteit-omgekeerde intestinale organoïden hun apicale kant blootstellen en vatbaar zijn voor hoge doorvoertesten.

Kweekmethoden om apicale-specifieke interacties te bestuderen met behulp van intestinale organoïde modellen

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

Hier beschrijven we een protocol om varkensdarm 3D-organoïden te kweken uit gecryopreserveerde epitheelcrypten. We beschrijven ook een methode om celmonolagen vast te stellen die zijn afgeleid van 3D-organoïden, waardoor toegang wordt verkregen tot de apicale kant van epitheelcellen.

Kweek van biggendarm 3D-organoïden uit gecryopreserveerde epitheliale crypten en oprichting van celmonolagen

We beschrijven een protocol om murine dunne darmcrypten en kweekdarm 3D-organoïden uit de crypten te isoleren. Daarnaast beschrijven we een methode om organoïden te genereren uit een enkele darmstamcel in afwezigheid van een sub-epitheliale cellulaire niche.

De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

De studie presenteert een methode voor in vitro onderzoek van bacteriële infecties met behulp van intestinale organoïden afkomstig van weefselstamcellen. Het protocol beschrijft hoe organoïden in twee dimensies kunnen worden gekweekt en onderscheiden, geïnfecteerd met adherent-invasieve Escherichia coli, en belangrijke metingen worden beoordeeld, waaronder het doorbreken van de epitheliale barrière, infectiebeeldvorming en de repitheliale RNA-respons.

Een tweedimensionale organoïde cultuur op invasine of basement membraanextract om gastheer-bacteriën interacties te bestuderen

We beschrijven confocale beeldvormings- en volgpijplijnen toegepast op twee rapportagestrategieën: mozaïekorganoïden voor het oplossen van individueel celgedrag en lotsreporterorganoïden voor het monitoren van celtypeovergangen in menselijke en muis-intestinale organoïden.

Levende-cel beeldvorming en single-cel tracking om klonale dynamiek en lotsovergangen in menselijke en muisachtige intestinale organoïden te monitoren

Leer co-cultuur van murine dunne darm organoïden met type-1 aangeboren lymfoïde cellen. Deze methode onderzoekt bidirectionele interacties tussen epitheelcellen en ILC1 voor darmbiologie.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Meer video's verkennen