Name: Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer substraatubiquitylering door E3-ligase in zoogdiercellysaten met immunoprecipitatie en Western blot. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van eiwitmodificatie in kanker en neurologische aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

F.R.T wordt ondersteund door FAPESP-subsidienummer 2020/15771-6 en CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P en V.S worden ondersteund door CAPES. C.R.S.T.B.C werd ondersteund door FAPESP-beursnummer 2019/23466-1. Wij danken Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) voor de materiële ondersteuning.

OPMERKING: Een overzicht van het ubiquitylatie-assayprotocol in zoogdiercellen is weergegeven in figuur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg"> Figuur 1. Overzicht van de ubiquitylatietestprocedure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
1. Celkweek
<ol><li>Kweek HEK293T cellijn in een 100 mm TC-behandeld kweekschaal tot 80%-90% samenvloeiing in groeimedia (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) hoge glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en penicilline (100 eenheden), streptomycine (100 μg) en L-glutamine (0,292 mg/ml)). Incubeer de kweek bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator bij 5% CO2.</li>
	<li>Om de cellen te passeren, aspirateert u de media uit de kweekschaal met behulp van een serologische pipet. Was de cellen eenmaal met 1 ml gesteriliseerde 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS 1x).</li>
	<li>Maak de cellen los door toevoeging van 1 ml trypsine/EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) oplossing. Incubeer het gerecht bij 37 °C gedurende 5 min. Resuspendeer de cellen met behulp van een serologische pipet in 2 ml groeimedia.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een frisse en schone buis van 15 ml en centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het supernatant door het voorzichtig uit te gieten. Resuspenseer de celpellet voorzichtig in 3 ml groeimedia door op en neer te pipetteren om een homogene celsuspensie te verkrijgen.</li>
	<li>Breng 1 ml van de celsuspensie over naar een 100 mm TC-behandelde kweekschaal met 9 ml groeimedia. OPMERKING: Als de cellen zich in goede omstandigheden bevinden, kan elk kweekschotel van HEK293T, waarbij de samenvloeiing 80% -90% is, 2 dagen na de passage drie kweekgerechten genereren met 80% samenvloeiing.</li>
</ol>2. Celtransfectie
OPMERKING: Het wordt niet aanbevolen om de celcultuur te transfecteren als de bereikte samenvloeiing minder dan 80% is.
<ol><li>Verklaar vóór transfectie of de cellen vrij zijn van verontreiniging en zich in een adequate samenvloeiing bevinden voor voorbijgaande transfecties.</li>
	<li>Bereid voor elk transfectiemonster de DNA-polyethylenimine (PEI 1 μg/μL bij pH 7,2) complexen als volgt:<ol>
<li>Verdun 3 μg van elk plasmide in 100 μL opti-MEM I gereduceerd serummedium zonder suppletie en meng het voorzichtig door de oplossing op en neer te pipetteren. OPMERKING: Hier werden de cellen getransfecteerd met 4 μg van elk plasmide: Lege vector (pcDNA3) of FLAG-Fbxo7-constructen en UXT-V2-HA, met of zonder 6xHis-myc-ubiquitine. Het totale DNA-gehalte was 12 μg.</li>
		<li>Ontdooi de PEI bij RT en voeg deze toe aan de oplossing na een verhouding van 3 μL PEI per 1 μg DNA. Homogeniseer de oplossing door op en neer te pipetteren. Incubeer het vervolgens gedurende 15 minuten bij RT om de vorming van DNA-PEI-complexen mogelijk te maken. OPMERKING: Het optimale aandeel PEI-volume per DNA-hoeveelheid verschilt afhankelijk van de geselecteerde cellijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg het totale volume DNA-PEI-complexen toe aan elk gerecht dat de celcultuur bevat en meng het voorzichtig door de plaat heen en weer te wiegen. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator met 5% CO2.</li>
	<li>Vervang het groeimedium na 5 uur, omdat langdurige blootstelling aan PEI giftig kan zijn voor HEK293T-cellen. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator met 5% CO2 gedurende 36 uur.</li>
</ol>3. Cellyse en immunoprecipitatie
<ol><li>Behandel na de incubatietijd en 6 uur voorafgaand aan de cellyse de getransfecteerde cellen met 10 μM van de proteasoomremmer MG-132. Incubeer de cellen nogmaals bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator met 5% CO2.</li>
	<li>Haal de media uit elke kweekschaal met behulp van een serologische pipet en was deze eenmaal met 1 ml 1x PBS. Maak de cellen los door 1 ml trypsine toe te voegen en het gerecht gedurende 5 minuten bij 37 °C te broeden. Resuspendeer de cellen in 1 ml groeimedia.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een frisse en schone buis van 15 ml en centrifugeer deze bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT.</li>
	<li>Verwijder het supernatant door het voorzichtig uit te gieten. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in 200 μL ijskoude NP-40 lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl en 1% NP-40), aangevuld met de cocktail van protease- en fosfataseremmers (10 mM NaF en 1 mM Na3VO4) en breng de oplossing over in een schone microbuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Incubeer de cel lysaat gedurende 30 minuten op ijs. Na incubatie centrifugeert de cellysaten bij 16.900 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Breng ondertussen de agarose-anti-HA-kralen in evenwicht met ijskoude NP-40 lysisbuffer. Gebruik 15 μL agarose-anti-HA kralen voor elk monster. Was de kralen met 200 μL NP-40 lysisbuffer door deze gedurende 1 minuut bij 4 °C in een microcentrifugebuis van 3.000 x g te pulseren. Met een pipet, aspirateer en gooi het supernatant heel voorzichtig weg; herhaal dit proces drie keer. Houd daarna de kralen in evenwicht op ijs tot gebruik.</li>
	<li>Na het centrifugeren van de cellysaten, herstelt u het supernatant. Kwantificeer het eiwitgehalte in het totale lysaat met behulp van de Bradford-methode16.</li>
	<li>Zorg ervoor dat elk monster dat wordt onderworpen aan immunoprecipitatie een gelijke hoeveelheid eiwit presenteert. Incubeer het benodigde volume cellysaat met de gebalanceerde agarose-anti-HA-kralen gedurende 4 uur, voorzichtig draaiend in een roterende incubator bij 4 °C, waardoor de UXT-V2-HA zich kan binden aan de agarose-anti-HA-kralen.</li>
	<li>Verzamel de agarose-anti-HA kralen door ze te pulseren in een microcentrifugebuis bij 3.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Aspirateer voorzichtig en gooi het supernatant weg. Was de kralen drie keer met ijskoude NP-40 cellysisbuffer en twee keer met ijskoude FLAG/HA-buffer (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl en 0,1% NP-40).</li>
	<li>Verwijder na de laatste wasbeurt al het supernatant voorzichtig met behulp van een pipet en eluuteer het polyubiquityleerde eiwit met HA-peptide (300 μg / ml) verdund op FLAG / HA-buffer. Incubeer de agarose-anti-HA kralen met HA peptide gedurende 1 uur bij 4 °C in een schommelend shakerplatform.</li>
	<li>Spin de kralen op 3.000 x g gedurende 2 min bij 4 °C en pipetteer voorzichtig het supernatant dat de polyubiquitinated eiwitten bevat. Bewaar het eluaat zo nodig in een frisse en schone microbuis bij -20 °C.</li>
	<li>Los de eluaten en de cellysaten op in 10% SDS-PAGE (natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese)17 en immunoblotting.</li>
	<li>In dit onderzoek werd een natte transfer WB uitgevoerd. Voor dit soort overdracht plaatst u de gel in een transfersandwich bestaande uit filterpapier-gel-membraanfilterpapier, dempt u het met pads en drukt u het samen door een ondersteuningsraster. Plaats dit systeem verticaal in een tank gevuld met transferbuffer en tussen roestvrijstalen/platina draadelektroden. De overdracht vindt plaats gedurende 90 minuten bij 150 V in natte overdrachtsbuffer (glycine 192 mM, tris-base 25 mM, 0,025% SDS, 20% Methanol). OPMERKING: Aangezien de celextracten zijn gekwantificeerd (stap 3.7), voert u een SDS-PAGINA uit met een gelijke hoeveelheid eiwit voor elk monster. Om het eluaat op te lossen, voert u ook gelijke volumes van elk monster uit.</li>
	<li>Onderzoek het immunoblotmembraan met behulp van geselecteerde antilichamen 11. Zorg ervoor dat een uitstrijksignaal wordt gedetecteerd in het eluaat van het polyubiquityleerde substraat dat in het IP-proces wordt getrokken door anti-myc-antilichamen te gebruiken in de monsters die het wild-type E3-ligase, het substraat en myc-ub bevatten. Zorg er in de cel lysaat (input) voor dat het signaal van het gekozen substraat, het Fbxo7-eiwit, ubiquitylated eiwitten en een huishoudeiwit (bijv. GAPDH en β-actine) wordt gedetecteerd om dezelfde hoeveelheid eiwitten in elke rijstrook te garanderen. OPMERKING: De verdunning voor elk gebruikt antilichaam werd bereid volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>

<ol><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Callis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitination+machinery+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The ubiquitination machinery of the ubiquitin system.</a> The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).</li>
<li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ubiquitination+factor%2C+E4%2C+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li>
<li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).</li>
<li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+discrimination+of+structurally+equivalent+Lys+63-linked+and+linear+polyubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains.</a> EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).</li>
<li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Davies, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vps9p+CUE+domain+ubiquitin+binding+is+required+for+efficient+endocytic+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).</li>
<li>Raasi, S., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+receptors+and+ERAD%3A+A+network+of+pathways+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).</li>
<li>Pan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ubr1-mediated+N-degron+polyubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination.</a> Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).</li>
<li>Raducu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+%28Fbxl17%29+ubiquitylation+of+Sufu+regulates+Hedgehog+signaling+and+medulloblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development.</a> The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).</li>
<li>Spagnol, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+SCF%28Fbxo7%29+mediates+proteasomal+degradation+of+UXT+isoform+2+%28UXT-V2%29+to+inhibit+the+NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).</li>
<li>Teixeira, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gsk3%CE%B2+and+Tomm20+are+substrates+of+the+SCFFbxo7%2FPARK15+ubiquitin+ligase+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease.</a> Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).</li>
<li>Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+SCF+adaptor+capture+proteomics+reveals+a+role+for+SCFFBXL17+in+NRF2+activation+via+BACH1+repressor+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover.</a> Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).</li>
<li>van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+ubiquitination+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Visualizing ubiquitination in mammalian cells.</a> EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).</li>
<li>Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibitors%3A+From+research+tools+to+drug+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates.</a> Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).</li>
<li>Bradford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 228, 726-734 (1970).</li>
<li>Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+UXT%2C+a+novel+gene+in+human+Xp11%2C+which+is+widely+and+abundantly+expressed+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue.</a> Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+facilitates+the+formation+of+MAVS+antiviral+signalosome+on+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria.</a> The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+protects+cells+against+TNF-induced+apoptosis+through+modulating+complex+II+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).</li>
<li>Sun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT+is+a+novel+and+essential+co-factor+in+the+NF-%CE%BAB+transcriptional+enhanceosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).</li>
<li>Huang, X., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+the+undruggables%3A+Exploring+the+ubiquitin+system+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development.</a> Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).</li>
<li>Rajkumar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+2020+update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).</li>
<li>Hideshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteasome+inhibitor+PS-341+inhibits+growth%2C+induces+apoptosis%2C+and+overcomes+drug+resistance+in+human+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells.</a> Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).</li>
<li>Tietsche, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+proteasome+inhibitors+in+the+treatment+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2C+Transfusion+and+Cell+Therapy%22%5BJournal%5D)">New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma.</a> Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+the+p53+pathway+by+small-molecule+antagonists+of+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2.</a> Science. 303 (5659), 844-848 (2004).</li>
<li>Kuiken, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+F-box+only+protein+7+as+a+negative+regulator+of+NF-kappaB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Iconomou, M., Saunders, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+approaches+to+identify+E3+ligase+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates.</a> Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).</li>
<li>Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitinases+sharpen+substrate+discrimination+during+membrane+protein+degradation+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER.</a> Cell. 154 (3), 609-622 (2013).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age+of+crosstalk%3A+Phosphorylation%2C+ubiquitination%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond.</a> Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Ubiquitylering is een essentiële posttranslationele modificatie die de niveaus van verschillende eiwitten reguleert en een cruciale rol speelt in veel signaalroutes en biologische processen, waardoor een gezonde intracellulaire omgeving wordt gewaarborgd. Het ubiquitine-proteasoomsysteem (UPS) is een van de belangrijkste aandachtspunten van recent farmaceutisch onderzoek en biedt de mogelijkheid om tumorsuppressoren te stabiliseren of de afbraak van oncogene producten te induceren22. De afwijkende...

Posttranslationele modificaties (PTM's) zijn een belangrijk mechanisme met betrekking tot eiwitregulatie, wat essentieel is voor celhomeostase. Eiwitubiquitylering is een dynamische en ingewikkelde modificatie die een assortiment van verschillende signalen creëert die resulteren in verschillende cellulaire uitkomsten in eukaryote organismen. Ubiquitylering is een omkeerbaar proces dat bestaat in de aanhechting van een ubiquitine-eiwit met 76 aminozuren aan het substraat, dat plaatsvindt in een enzymatische cascade bestaande uit drie verschillende reacties1. De eerste stap wordt gekenmerkt door ubiquitine-activering, die afhankelijk is van een ATP-hydrolyse om een hoogenergetisch thioester-gebonden ubiquitine te vormen tussen de ubiquitine C-terminus en het cysteïneresidu dat aanwezig is op de actieve plaats van het E1-enzym. Vervolgens wordt het ubiquitine overgebracht naar het E2-enzym dat een thioester-achtig complex vormt met het ubiquitine. Daarna wordt het ubiquitine covalent aan het substraat gehecht door de E2, of vaker, door het E3-enzym, dat het substraat herkent enermee interageert 2,3. Af en toe zijn E4-enzymen (Ubiquitine-keten rekfactoren) nodig om multiubiquitineketenassemblage te bevorderen3.
Ubiquitine heeft zeven lysineresiduen (K6, K11, K27, K29, K33, K48 en K63), waardoor de vorming van polyubiquitineketens mogelijk is die verschillende koppelingen genereren om verschillende driedimensionale structuren te produceren die door verschillende effectoreiwitten zullen worden herkend 4,5. Daarom is het soort polyubiquitineketen dat in het substraat wordt geïntroduceerd essentieel om het lot van de cel te bepalen 6,7,8. Bovendien kan het substraat ook worden alomtegenwoordig via zijn N-terminale residuen die N-degrons worden genoemd. Specifieke E3-ubiquitine-ligases zijn verantwoordelijk voor N-degron-herkenning, waardoor de polyubiquitylering van nabijgelegen lysineresidu9 mogelijk is.
Tegenwoordig zijn er meer dan 40 verschillende SCF-specifieke substraten gekarakteriseerd. Onder die, belangrijke regulatoren van verschillende biologische routes, waaronder celdifferentiatie en ontwikkeling, evenals celoverleving en dood, kunnen worden gevonden 10,11,12,13. De identificatie van specifieke substraten van elke E3-ubiquitine-ligase is dus essentieel om een uitgebreide kaart van verschillende biologische gebeurtenissen te ontwerpen. Hoewel de identificatie van echte substraten biochemisch uitdagend is, is het gebruik van biochemische methoden zeer geschikt om ketenspecificiteit en het onderscheid tussen mono- en polyubiquitylering te evalueren14. Deze studie beschrijft een compleet protocol voor ubiquityleringstest met behulp van de zoogdiercellijn HEK293T die het substraat UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) overexpressie met het E3 ubiquitine-ligase complex SCF (Fbxo7). UXT-V2 is een essentiële co-factor voor NF-κB-signalering, en zodra dit eiwit in cellen wordt neergehaald, remt het TNF-α-geïnduceerde NF-κB-activering11. Om polyubiquitylated UXT-V2 te detecteren, wordt de proteasoomremmer MG132 gebruikt, omdat deze het vermogen heeft om de proteolytische activiteit van de 26S-subeenheid van het proteasoomcomplex15 te blokkeren. Bovendien wordt het celextract onderworpen aan een kleinschalig IP om het substraat te zuiveren, met behulp van een specifiek antilichaam geïmmobiliseerd tot agarosehars voor latere detectie door WB met behulp van geselecteerde antilichamen. Dit protocol is zeer nuttig om substraatubiquitylering in de cellulaire omgeving te valideren, en het kan ook worden aangepast voor verschillende soorten zoogdiercellen en andere E3 ubiquitine-ligasecomplexen. Het is echter noodzakelijk om het geteste substraat ook te valideren door middel van een in vitro ubiquityleringstest, omdat beide protocollen elkaar aanvullen met betrekking tot de identificatie van echte substraten.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microtube</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-treated culture dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tube</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-anti-HA beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>Anti Mouse antibody</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>Geiten anti-Muis IgG</td></tr><tr><td>Anti Rabbit antibody</td><td>Seracare</td><td>5220-0337</td><td>Geiten anti-Konijn IgG</td></tr><tr><td>Anti-Actin antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>Gebruikte verdunning: 1:2000</td></tr><tr><td>Anti-Fbxo7 antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>Gebruikte verdunning: 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-HA antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>Gebruikte verdunning: 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Myc antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>2272</td><td>Gebruikte verdunning: 1:1000</td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>Bovien Serum Albumine</td></tr><tr><td>Cell incubator</td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 x g gedurende 5 min</td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital pH meter</td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CRV</td><td>Hoge glucose</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>F4135</td><td>Filtraat vóór gebruik</td></tr><tr><td>HA peptide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline rotator</td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose blotting membrane</td><td>GE Healthcare</td><td>10600016</td><td></td></tr><tr><td>NP40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>OPTIKA microscopes</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>Voor expressie in zoogdieren</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp;Vriendelijk gedoneerd door Dr. Marcelo Dam&aacute;rio</td><td></td><td>Tag 2xFlag (N-terminaal). Beperkingsenzymen: EcoRI en XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&Delta;F-box</td><td>&nbsp;Vriendelijk gedoneerd door Dr. Marcelo Dam&aacute;rio</td><td></td><td>Tag 2xFlag (N-terminaal). Beperkingsenzymen: EcoRI en XhoI. &Delta;335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA</td><td>&nbsp;Vriendelijk gedoneerd door Dr. Marcelo Dam&aacute;rio</td><td></td><td>Tag HA (C-terminaal). Beperkingsenzymen: EcoRI en XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin</td><td>&nbsp;Vriendelijk gedoneerd door Dr. Marcelo Dam&aacute;rio</td><td></td><td>Tag 6x-His-Myc (N-terminaal). Beperkingsenzymen: EcoRI en KpnI</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>Om een 1x PBS te verkrijgen, verdun de 10x PBS in ultrapuur water</td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Rocking Shaker</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE system</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>Solution Homogenizer</td><td>Phoenix Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (TrypLe Express)</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagent</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van substraatubiquitylering door e3 ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylering is een posttranslationele modificatie die optreedt in eukaryote cellen die van cruciaal belang is voor de regulatie van verschillende biologische routes, waaronder celoverleving, proliferatie en differentiatie. Het is een omkeerbaar proces dat bestaat uit een covalente aanhechting van ubiquitine aan het substraat door een cascadereactie van ten minste drie verschillende enzymen, samengesteld uit E1 (Ubiquitine-activeringsenzym), E2 (Ubiquitine-conjugaterend enzym) en E3 (Ubiquitine-ligase-enzym). Het E3-complex speelt een belangrijke rol bij substraatherkenning en alomtegenwoordigheid. Hier wordt een protocol beschreven om substraatubiquitylering in zoogdiercellen te evalueren met behulp van voorbijgaande co-transfectie van een plasmide dat codeert voor het geselecteerde substraat, een E3-ubiquitineligase en een gelabeld ubiquitine. Vóór lysis worden de getransfecteerde cellen behandeld met de proteasoomremmer MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) om proteasomale afbraak van substraat te voorkomen. Bovendien wordt het celextract onderworpen aan kleinschalige immunoprecipitatie (IP) om het polyubiquityleerde substraat te zuiveren voor daaropvolgende detectie door western blotting (WB) met behulp van specifieke antilichamen voor ubiquitine-tag. Daarom wordt een consistent en ongecompliceerd protocol voor alomtegenwoordyleringstest in zoogdiercellen beschreven om wetenschappers te helpen bij het aanpakken van alomtegenwoordigheid van specifieke substraten en E3-ubiquitine-ligases.

UXT (alomtegenwoordig uitgedrukt transcript) is een prefoldine-achtig eiwit dat alomtegenwoordig tot expressie gebrachte eiwitvouwcomplexen vormt in muizen- en menselijke weefsels zoals hart, hersenen, skeletspieren, placenta, pancreas, nieren en lever18. Twee splicing-isovormen van UXT, die UXT-V1 en UXT-V2 heten, zijn beschreven met verschillende functies en subcellulaire locaties. UXT-V1 is voornamelijk gelokaliseerd in het cytoplasma en in de mitochondriën, en het is betrokken bij TNF-α-geïndu...

We bieden een gedetailleerd protocol voor een alomtegenwoordyleringstest van een specifiek substraat en een E3-ubiquitine-ligase in zoogdiercellen. HEK293T-cellijnen werden gebruikt voor eiwitoverexpressie, het polyubiquityleerde substraat werd gezuiverd uit cellysaten door immunoprecipitatie en opgelost in SDS-PAGE. Immunoblotting werd gebruikt om deze posttranslationele modificatie te visualiseren.

Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Dit protocol maakt het mogelijk om de alomtegenwoordigheid van een specifiek substraat door een E3-ligase te evalueren. We weten dat de karakterisering van ligase-substraatinteractie cruciaal is om hun functie in cellen te begrijpen. Deze techniek vereist geen dure reagentia of geavanceerde apparatuur.Het heeft plasmiden nodig en codeert de genen van belang, ontwikkelt een immunoprecipitatietest met cellysaten en een Western blot om substraatubiquitylering te detecteren. Verschillende menselijke ziekten zoals kanker en neurologische aandoeningen worden geassocieerd met ontregeling van E3-ligase. Vandaar dat de identificatie van substraatubiquitylering door specifiek E3-ligase zou kunnen helpen bij de behandeling of diagnose van die ziekten.Het demonstreren van de procedure zal worden uitgevoerd door Valentine Spagnol. Om te beginnen, kweek HEK293T cellijn tot 80 tot 90% samenvloeiing in Dulbecco's gemodificeerde Eagles-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 eenheden penicilline, 100 microgram streptomycine en 0,292 milligram per milliliter L-glutamine. Incubeer vervolgens deze cultuur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde celkweekincubator met 5% koolstofdioxide.Passeer de cellen door de media uit de kweekschaal te halen met behulp van een serologische pipet en was ze eenmaal met één milliliter gesteriliseerde 1X PBS. Maak vervolgens de cellen los door een milliliter trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing toe te voegen en na vijf minuten incubatie bij 37 graden Celsius, resuspensieer deze cellen in twee milliliter groeimedia met behulp van een serologische pipet. Breng de celsuspensie over in een frisse en schone buis van 15 milliliter en centrifugeer op 500 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant en resuspendeer de celpellet in drie milliliter groeimedia door op en neer te pipetteren om een homogene celsuspensie te verkrijgen. Breng vervolgens een milliliter van deze celsuspensie over naar een 100 millimeter TC-behandelde kweekschaal met negen milliliter groeimedia. Verklaar vóór transfectie of de cellen vrij zijn van verontreiniging en zich in een adequate samenvloeiing bevinden voor voorbijgaande transfecties.Bereid voor elk transfectiemonster de DNA-polyethyleeniminecomplexen voor door drie microgram van elk plasmide te verdunnen in 100 microliter Opti-MEM 1 gereduceerd serummedium zonder suppletie en het voorzichtig te mengen door de oplossing op en neer te pipetteren. Ontdooi vervolgens het DNA-polyethyleenimine bij kamertemperatuur en voeg het toe aan de oplossing na een verhouding van drie microliter DNA-polyethyleenimine per één microgram DNA. Homogeniseer de oplossing door op en neer te pipetteren.Incubeer het vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van DNA-polyethyleeniminecomplexen mogelijk te maken. Voeg het totale volume DNA-polyethyleeniminecomplexen toe aan elke schotel die de celcultuur bevat en meng deze voorzichtig door de plaat heen en weer te wiegen. Incubeer deze cellen vervolgens bij 37 graden Celsius in een bevochtigde celkweekincubator.Behandel na de incubatie en zes uur voorafgaand aan de cellyse de getransfecteerde cellen met 10-micromolaire proteasoomremmer MG132 en incubeer de cellen in de bevochtigde celkweekincubator. Zuig vervolgens de media uit elke kweekschaal met behulp van een serologische pipet en was de cellen eenmaal met één milliliter 1X PBS. Maak vervolgens de cellen los door een milliliter trypsine toe te voegen en incubeer het gerecht gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.Resuspenseer de cellen in één milliliter groeimedia en breng de celsuspensie over in een frisse en schone microbuis van twee milliliter en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 500 maal G. Zodra de centrifugatie voorbij is, verwijdert u het supernatant door het voorzichtig uit te gieten en de celkorrel voorzichtig te resuspenseren in 200 microliter ijskoude MP40-lysisbuffer aangevuld met de cocktail van protease- en fosfataseremmers. Breng deze oplossing vervolgens over in een schone microbuis van 1,5 milliliter.Incubeer deze cel gedurende 30 minuten op ijs en centrifugeer na de incubatie de cel op 16.900 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Ondertussen, equilibrate de agarose anti-HA kralen met ijskoude MP40 lysis buffer. Gebruik 15 microliter agarose anti-HA kralen voor elk monster.Was de kralen met 200 microliter MP40-lysisbuffer door ze gedurende één minuut in een microcentrifugebuis op 3.000 maal G bij vier graden Celsius te pulseren. Aspirateer vervolgens en gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet en herhaal dit proces drie keer. Houd daarna de kralen in evenwicht op ijs tot gebruik.Na het centrifugeren van de cellysaten, herstelt u het supernatant en kwantificeert u het eiwitgehalte in het totale lysaat met behulp van de Bradford-methode om ervoor te zorgen dat elk monster dat wordt onderworpen aan immunoprecipitatie een gelijke hoeveelheid eiwit presenteert. Incubeer het benodigde volume cellysaat met de gebalanceerde agarose anti-HA kralen gedurende vier uur, voorzichtig draaiend in een roterende incubator op vier graden Celsius, waardoor de UXT-V2-HA kan binden aan de agarose anti-HA kralen. Verzamel de agarose anti-HA kralen door ze te pulseren in een microcentrifugebuis op 3.000 keer G gedurende één minuut bij vier graden Celsius.Aspirateer voorzichtig en gooi het supernatant weg. Was de kralen drie keer met ijskoude MP40 celllysis buffer en twee keer met ijskoude FLAG HA buffer. Verwijder na de laatste wasbeurt al het supernatant voorzichtig met behulp van een pipet en elueerde het poly-ubiquitylated eiwit met 300 microgram per milliliter HA-peptide verdund op FLAG HA-buffer.Incubeer de agarose anti-HA kralen met HA peptide gedurende een uur bij vier graden Celsius in een schommelend shaker platform. Draai vervolgens de kralen op 3.000 keer G gedurende twee minuten op vier graden Celsius en verwijder voorzichtig het supernatant dat de poly-ubiquitinated eiwitten bevat. Bewaar het eluent indien nodig in een frisse en schone microbuis bij min 20 graden Celsius.Los de eluenten en de cellysaten op in 10% natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese en immunoblotting. Om een western blotting met natte overdracht uit te voeren, plaatst u de gel in een transfersandwich bestaande uit filterpapier, gelmembraanfilterpapier, dempt u het met pads en drukt u het samen door een ondersteuningsraster. Plaats dit systeem vervolgens verticaal in een tank gevuld met overdrachtsbuffer tussen roestvrijstalen of platinadraadelektroden.De overdracht vindt gedurende 90 minuten plaats bij 150 volt in een natte overdrachtsbuffer. Onderzoek ten slotte het immunoblotmembraan met behulp van anti-myc-antilichamen. De specifieke poly-ubiquitylering van UXT-V2-HA gemedieerd door F-box eiwit 7 in cellen werd waargenomen na het onderzoeken van het eluent van anti-HA immunoprecipitatie met een anti-myc antilichaam, dat de myc-ub geconjugeerd aan het substraat detecteert.De specificiteit van anti-myc voor poly-ubiquitylated substraat werd gevisualiseerd in banen één en twee, waarbij een uitstrijkje van poly-ubiquitylated eiwitten niet werd gedetecteerd wanneer cellen werden getransfecteerd met F-box eiwit 7 en myc-ub in afwezigheid van UXT-V2-HA plasmide. Bovendien werd geen uitstrijkje gevisualiseerd dat overeenkomt met eiwitpoly-ubiquitinatie in de combinatie van F-box-eiwit 7 en UXT-V2-HA zonder het myc-ub plasmide. Wanneer een lege vector wild-type F-box eiwit 7 of F-box eiwit 7 mutant die niet in staat was om actieve SCF te assembleren werd getransecteerd in combinatie met UXT-V2-HA en myc-ub, werd een sterk uitstrijksignaal van poly-ubiquitylated UXT-V2 alleen waargenomen voor wild-type F-box eiwit 7, wat suggereert dat UXT-V2 poly-ubiquitylated was door SCF F-box protein 7 complex en cellen in vergelijking met de controles.De monoprecipitatiestappen, inclusief incubatie van cellysaten met de gebalanceerde kralen en elutie van immunoprecipitated eiwitten, zijn essentieel om het doel van dit protocol te bereiken. Na deze procedure moet in vitro ubiquityleringstest worden uitgevoerd om de specificiteit van de substraatubiquitylering door het E3-ligase te bevestigen.

evaluation-substrate-ubiquitylation-e3-ubiquitin-ligase-mammalian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte...

Detectie van eiwit ubiquitinering

This video demonstrates the in vitro method for SUMOylation of substrate proteins using a sequential enzyme cascade. Further, the SUMOylated status of the protein is identified using the electrophoresis and immunoblotting technique.

SUMOylation Assay: An In Vitro Technique to Detect the SUMOylation Status of Substrate Proteins by Immunoblotting

In tegenstelling tot ubiquitin ligases, zijn paar E3 SUMO ligases geïdentificeerd. Deze gewijzigde in vitro SUMOylation protocol vermag roman SUMO E3 ligases identificeren door een reconstructie in vitro assay.

In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen speelt in cellulaire processen en nauw gecoördineerd wordt door deubiquitination. Defecten in beide reacties ten grondslag liggen aan menselijke pathologieën. Wij bieden protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reactie in vitro met behulp van gezuiverde componenten.

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Het doel van dit manuscript is om een overzicht te presenteren voor de uitgebreide biochemische en functionele studies van de RING-type E3 ubiquitine ligases. Deze pijplijn met meerdere stappen, met gedetailleerde protocollen, valideert een enzymatische activiteit van de geteste eiwitten en laat zien hoe u de activiteit koppelt aan functie.

Functionele karakterisatie van RING-type E3 Ubiquitin ligases in vitro en in planta

Deze methode beschrijft de beoordeling van wereldwijde veranderingen in de ubiquitin ketentopologie. De beoordeling wordt uitgevoerd door de toepassing van een op massaspectrometrie gebaseerde gerichte proteomics-benadering.

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

De huidige studie biedt gedetailleerde in vitro ubiquitylatie assay protocollen voor de analyse van E3 ubiquitine ligase katalytische activiteit. Recombinante eiwitten werden tot expressie gebracht met behulp van prokaryote systemen zoals Escherichia coli-cultuur.

In vitro Analyse van E3 Ubiquitine Ligase Functie

Ubiquitinatie is een cruciale regulator van de functies van intracellulaire eiwitten. Hier beschrijven we twee cellysemethoden om substraatproteïneniveaus te detecteren in zoogdiercellen en vergelijken we hun effectiviteit bij het analyseren van ubiquitinatieniveaus. Eiwitoverexpressie in HEK293T cellen werd geïnduceerd door tijdelijke transfectie, en ubiquitinatieve eiwitten werden gedetecteerd door western blot-analyse.

Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model

Dit protocol beschrijft een methode om Streptococcus pneumoniae te ubiquitineren met behulp van zoogdiercellysaat of puur ubiquitine-enzymcomplex, gevolgd door behandeling met gezuiverd VCP/p97-UFD1-NPLOC4 eiwitcomplex om de bacteriolytische activiteit te beoordelen, waardoor het bestuderen van ubiquitine-afhankelijke immuuneffectoren mogelijk wordt.

In-vitro Reconstitutie van bacteriële ubiquitinatie en VCP/p97-gemedieerde eliminatie

Leer substraatubiquitylering door E3-ligase in zoogdiercellysaten met immunoprecipitatie en Western blot. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van eiwitmodificatie in kanker en neurologische aandoeningen.

Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Meer video's verkennen