Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten

Membraanfusie bemiddelt veel biologische functies. Dit protocol beschrijft een methode om fusieporiënopening en transmitter release dynamiek te detecteren en drie fusiemodi te onderscheiden; close fusion, stay fusion en shrink fusion. De combinatie van confocale microscoop en de patch-clamp-opname vergemakkelijkt de visualisatie van het openen en sluiten van fusieporiën en de bepaling van hun kinetiek.

Hoewel beschreven voor chromaffinecellen, kan het principe van de hier beschreven methode op grote schaal worden toegepast op veel secretoire cellen ver buiten chromaffinecellen. Succesvolle implementatie van deze methode hangt af van verschillende algemene stappen, zoals het genereren van gezonde primaire chromaffinecelkweek, voldoende plasmidetransfectie-efficiëntie en een hoog elektrofysiologisch opnamesuccespercentage. Kies drie intacte klieren zonder snijwonden of bloedingen op het oppervlak en verwijder het vetweefsel met een schaar.

Was de klieren door perfusie met Locke's oplossing totdat er geen bloed uitkomt. Injecteer voor de spijsvertering de enzymoplossing door de bijnierader met behulp van een spuit van 30 millimeter die is bevestigd met een filter van 0,22 micrometer totdat de klier begint op te zwellen. Laat de klieren vervolgens 10 minuten op 37 graden Celsius staan.

Injecteer opnieuw en laat de klieren nog 10 minuten op 37 graden Celsius staan. Snijd na de spijsvertering de klier in de lengterichting van de bijnierader naar het andere uiteinde met een schaar om de klier te ontvouwen. Isoleer het witte medulla door het in stukjes uit te tweeten in een petrischaaltje van 10 centimeter met de oplossing van Locke.

Knip en gehakt de medulla met een schaar. Filtreer de medulla suspensie met een nylon gaas van 80 tot 100 micrometer in een bekerglas. Breng het filtraat over in een conische buis van 50 milliliter en centreer gedurende drie minuten bij 48 x g kamertemperatuur met een vertraging van drie.

Verwijder na centrifugatie het supernatant en resuspenseer de celpellet met locke's oplossing door pipetteren. Filtreer de celsuspensie met een zeef van 80 tot 100 micrometer en centreer bij 48 x g kamertemperatuur gedurende drie minuten met vertraging drie. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet met 30 milliliter kweekmedium.

Bepaal het celnummer met behulp van een hemocytometertelkamer. Breng 2. 800.000 cellen over in een buis van 15 milliliter. Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 48 x g gedurende twee minuten met de vertraging van drie.

Voeg 100 microliter transsectiebuffer toe die door de fabrikant is verstrekt aan de celpellet. En voeg dan twee microgram PH-mNG plasmide toe. Meng de suspensie voorzichtig door de oplossing op en neer te pompen en breng het mengsel onmiddellijk over in een elektroporatiecuvet.

Breng de cuvette onmiddellijk over naar de elektroporator, selecteer het 005-programma in de schermlijst en druk op Enter om elektroporatie uit te voeren. Voeg na elektroporatie onmiddellijk 1,8 milliliter medium toe aan de cuvette en meng voorzichtig met een micropipette uitgerust met een steriele punt. Voeg 300 microliter van de suspensie van de geëlektropoeerde cellen toe aan de afdekslip in elke schotel met in totaal vijf tot zes schotels voor één elektroporatiereactie.

Breng de gerechten voorzichtig over naar een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 9% koolstofdioxide gedurende 30 minuten en voeg na 30 minuten voorzichtig twee milliliter voorgewarmd medium toe aan elk gerecht. Bereid patchpipetten van borosilicaatglascapillairen door ze te trekken met een pipettrekker, hun uiteinden te bedekken met vloeibare was en ze te polijsten met een microforge. Schakel de patchklem opnameversterker in en start de software.

Stel de juiste calciumstroom- en capaciteitsregistratieparameters van de software in. Stel een opnameprotocol in van in totaal 60 seconden waarbij de stimulatie begint bij 10 seconden. Stel de houdpotentiaal voor spanningsklemregistratie in op 80 millivolt.

Stel een depolarisatie van één seconde in van min 80 millivolt naar 10 millivolt als de stimulans om calciuminstroom en capaciteitssprong te induceren. Schakel het confocale microscoopsysteem in en stel de juiste parameters in de software in. Schakel de lasers in, waaronder 458 nanometer, 514 nanometer en 633 nanometer en stel het emissieverzamelingsbereik voor elke laser in volgens elke fluorescentiesonde.

Kies een gerecht met een goede celtoestand en de juiste expressie en voeg twee microliter fluorescentie valse neurotransmitter FFN511 toe aan het medium in het gerecht. Zet het gerecht 20 minuten terug in de couveuse. Bereid na het laden van FFN511 de opnamekamer voor en voeg twee microliter fluorescentiekleurstof A655 toe aan 50 microliter badoplossing.

Breng de afdeksel van de schaal met een pincet over in de opnamekamer en voeg onmiddellijk de A655 met badoplossing toe. Plaats een druppel olie op het 100X olie-onderdompelingsdoel. Monteer de kamer in de microscoop en gebruik de instelknop om de olie gewoon contact te laten maken met de onderkant van de afdekslip.

Breng de cellen in beeld en gebruik bright field en confocale beeldvorming om een geschikte cel met mNG-expressie te vinden. Zoom in op de geselecteerde cel en centreer deze in het gezichtsveld, waardoor lege gebieden worden geminimaliseerd. Stel parameters in voor XY-vlak confocale beeldvorming op een vast Z-vlak van FFN511, PH-mNG en A665 met een geminimaliseerd tijdsinterval.

Pas de scherpstelling aan de onderkant van de cel aan met een fijnstelknop. Pas het excitatielaservermogen in de software aan om een instelling te vinden om de beste signaal-ruisverhouding te krijgen en significante fluorescentiebleking te voorkomen. Voeg negen microliter interne oplossing toe aan een patchpipet en bevestig de pipet aan de houder van de patchklemversterkertrap.

Breng een kleine hoeveelheid positieve druk aan met een spuit en beweeg de pipetpunt om de badoplossing aan te raken met een micromanipulator. Zorg ervoor dat de versterker laat zien dat de pipetweerstand ongeveer tussen de twee en vier megaohms ligt met een spanningspulstest. Druk op LJ/Auto om de vloeistofverbinding te annuleren.

Verplaats de pipet naar de geselecteerde cel met een micromanipulator. Als u een celgebonden modus wilt vormen, verplaatst u de pipetpunt om de cel aan te raken. Verander het houdvermogen van nul naar min 80 millivolt terwijl u zachte onderdruk uitoefent met een spuit.

Zodra de weerstand een gigaohm passeert, wacht u ongeveer 30 seconden totdat de configuratie is gestabiliseerd. Druk op C-fast/Auto om de snelle capaciteit te compenseren. Om een groothandelsmodus te vormen, past u korte maar krachtige onderdrukpulsen toe met de spuit totdat het membraan scheurt.

Druk op C- slow/Auto om de trage capaciteit te compenseren. Pas de beeldfocus iets aan om scherp te stellen op de onderkant van de cel. Start de confocale timelapse imaging en patch clamp opname gelijktijdig door op de Start knoppen te klikken met twee verschillende software applicaties.

Zorg er na het opnemen voor dat de gegevens zijn opgeslagen. Verander het houdpotentieel terug naar nul millivolts. Haal de pipet uit de badoplossing en gooi deze weg.

Open de RAW-beeldbewerkingsbestanden met een fabrikant of meegeleverde software. Ga naar Proces, klik op ProcessTools en gebruik de tools om voortschrijdende gemiddelde bestanden te genereren voor elke timelapse-afbeelding. Sla deze bestanden op.

Ga onder kwantificeren naar Tools en klik op stackprofielknoppen om tijdpunten voor en na stimulatie te controleren en fluorescentieveranderingen in elk kanaal te identificeren. Klik op de knop Ellips tekenen om regio's te omcirkelen die interessant zijn voor fusiegebeurtenissen. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en klik op SLA's op om op te slaan.

Klik op Projecten openen om het RAW-bestand te zoeken. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en klik op ROIs laden om het ROI-bestand in het ONBEWERKTE afbeeldingsbestand te laden om de fluorescentie-intensiteiten te meten. Ga naar Tools en klik op Sorteer-ROI's in de software en plot de sporen voor alle drie de kanalen van elke ROI.

Klik op Rapporteren om de ROI-gegevens, inclusief digitale gegevens en beeldtraceringen voor elke ROI, op te slaan in een bestandsmap. De registratie van de hele celpleisterklem en het aanbrengen van een depolarisatie van één seconde van 80 tot 10 millivolts werd uitgevoerd om exo- en endocytose op te roepen. De toegepaste depolarisatie veroorzaakte een inwaartse calciumstroom, een capaciteitssprong, wat duidt op exocytose, en een capaciteitsverval na de sprong, wat wijst op endocytose.

Met timelapse-beeldvorming aan de celbodem werden fusiegebeurtenissen geïnduceerd door het depolarisatieprotocol van één seconde aangegeven als FFN-afname als gevolg van FFN511-afgifte, vergezeld van FPH- en A655-spotfluorescentietoename, die PH-mNG- en A655-diffusie van het plasmamembraan en de badoplossing in het fuserende blaasje weerspiegelt. De figuur presenteert nauwe fusie geïdentificeerd als F655 dimming, terwijl FPH met een vertraging aanhield of verviel. De figuur vertegenwoordigt de fusie van het verblijf gedetecteerd door de aanwezigheid van zowel PH-mNG- als A655-vlekken.

De figuur vertegenwoordigt krimpfusie gedetecteerd als parallel FPH- en F655-verval, vergezeld van een parallelle verkleining van de PH-mNG-spot en de A655-spot Succesvolle opname vereist het genereren van de hele celconfiguratie met patch-clamp en beeldvorming aan de celbodem met de juiste fluorescerende intensiteit voor elk kanaal. De combinatie van elektrofysiologie en superresolutiemicroscopie die hier wordt beschreven, is een waardevol hulpmiddel voor het meten van fusieporiëndynamica en neurocircuits.