Name: Onderzoek naar littekenloze weefselregeneratie bij embryonale gewonde kikkererwtenhoorns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer een wondprotocol voor embryonale kikkervogelhoornen om littekenloze weefselregeneratie te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers de moleculaire en cellulaire mechanismen van regeneratieve genezing te ontrafelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een artistieke en wetenschappelijke ontwikkelingsbeurs via Illinois Wesleyan University aan TS en gedeeltelijk gefinancierd door NIH-R01EY022158 (PL).

De stam eieren die in dit protocol werd gebruikt, was White Leghorn en alle dierprocedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Illinois Wesleyan University.
1. Incubatie van kuikeneieren
<ol><li>Bewaar de eieren op ~ 10 ° C tot 1 week nadat ze zijn gelegd om de ontwikkeling te stoppen. Wanneer u klaar bent om de ontwikkeling van kuikenembryo's te starten, veegt u de hele eierschaal af met pluisvrije doekjes (zie Materiaaltabel) verzadigd met water op kamertemperatuur om vuil en vuil te verwijderen.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de eierschaal is ontsmet. Veeg het hele eioppervlak af met pluisvrije doekjes bevochtigd met 70% ethanol. Veeg de ethanol snel af om het ei te drogen en vermijd ethanolabsorptie door de eierschaal naar het embryo.</li>
	<li>Schik de eieren horizontaal op een bakje. Markeer de bovenkant van het ei om de verwachte positie van het embryo aan te geven. Incubeer de eieren horizontaal, met de schommelfunctie geactiveerd, in een bevochtigde incubator van 38 °C.</li>
</ol>2. De eieren vensteren om zich voor te bereiden op membraandissectie
<ol><li>Verwijder eieren uit de couveuse op de derde dag van de embryonale ontwikkeling (E3). Steriliseer de bovenkant van de eieren met pluisvrije doekjes bevochtigd met 70% ethanol. Droog de ethanol van de eierschaaloppervlakken. OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de ontwikkeling niet werd vertraagd tijdens de vensterprocedure, werden 6-12 eieren verwijderd en de procedure werd snel uitgevoerd terwijl de resterende eieren in de broedmachine werden achtergelaten.</li>
	<li>Plaats een ei horizontaal in een veilige eierhouder (zie Materiaaltabel). Maak met behulp van het scherpe uiteinde van de ontleedschaar een klein gaatje in de bovenkant van de eierschaal nabij het puntige uiteinde van het ei. OPMERKING: Dit gat vergemakkelijkt de verwijdering van albumine, wat nodig is om de dooier en het embryo weg te laten vallen van het binnenste eierschaaloppervlak. Voor eierhouders werden papierpulp-eiervullers gebruikt, waarbinnen de eieren worden verzonden.</li>
	<li>Steek door het gat (stap 2.2.) een afgeschuinde injectienaald van 18 G. Met de naald naar het onderste binnenoppervlak van het ei geduwd en de schuine kant van de naald naar het puntige uiteinde van het ei gericht (bijvoorbeeld weg van de verwachte locatie van de dooier en het embryo in het midden van het ei), verwijder 2-3 ml albumine uit het kippenei en gooi weg. OPMERKING: Als iemands naald tijdens deze stap het embryo of de bijbehorende vasculatuur insnijdt, zal dit ertoe leiden dat bloed wordt geaspireerd met het albumine. Dit zal resulteren in embryodood. Verder, als de dooier per ongeluk samen met het albumine tijdens deze stap wordt geaspireerd, zal het embryo niet levensvatbaar zijn. In beide gevallen moet het ei worden weggegooid als het embryo niet onmiddellijk voor andere doeleinden kan worden gebruikt.</li>
	<li>Reinig het eierschaaloppervlak rond het gat met pluisvrije doekjes die licht zijn bevochtigd met 70% ethanol en veeg droog. Dicht het gat dat is gemaakt voor het verwijderen van albumine af met doorzichtige tape.</li>
	<li>Maak met het scherpe uiteinde van de ontleedschaar een tweede "venster" -gat in de bovenkant van de eierschaal op de markeringsplaats (stap 1.3.). Zorg ervoor dat de schaar zich niet te ver in de eierschaal uitstrekt om te voorkomen dat het embryo of de embryonale vasculatuur, die vaak in het ei direct onder de plaats van het tweede gat wordt geplaatst, in contact komt en beschadigd raakt.</li>
	<li>Gebruik gebogen iristangen om het "venster" -gat te verbreden tot een diameter van ~ 2-3 cm en dien als een "venster" voor het zich ontwikkelende embryo onder de schaal.<ol>
<li>Steek het ene uiteinde van de tang in het gat en houd het parallel aan en dicht bij de eierschaal. Met het uiteinde van de andere tang buiten de eierschaal, knijp je de twee tanguiteinden voorzichtig samen, zodat ze kunnen breken en kleine stukjes van de eierschaal kunnen verwijderen. Ga door met het breken en verwijderen van eierschaalfragmenten totdat er een venster van 2-3 cm overblijft dat het embryo direct bedekt. OPMERKING: Eieren waarin embryo's niet direct onder het gat liggen dat in stap 2.6 is gemaakt. mogen niet worden gebruikt omdat de komende membraandissecties een uitdaging zouden zijn om te voltooien. Zelfs met het horizontaal schommelen van de eieren is ongeveer 10% van de eieren onbruikbaar vanwege de slechte positionering van het embryo. Deze embryo's kunnen voor andere doeleinden worden gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Om bacteriële besmetting te beperken, voegt u door het raamgat (bijv. in het ei) ~ 100-200 μL Ringer's oplossing (8 g NaCl, 0,37 g KCl en 0,23 g CaCl2,2H 2 0 per L gedestilleerde H20) toe die Penicilline / Streptomycine-antibiotica bevatten (50 U / ml penicilline en 50 μg / ml streptomycine, zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Dicht het raamgat af met doorzichtig plakband. Voer de eierafdichting uit door een hoek van de tape op de lange as van het gat uit te lijnen en de tape op de schaal ~ 1-2 cm van de rand van het gat te drukken.<ol>
<li>Blijf rond de opening afdichten totdat een hangende klep van tape aan één kant is achtergelaten. Druk de twee stukjes tape tegen elkaar, waardoor een koepelvormige vorm over het gat ontstaat en druk de flap van overhangende tape op de schaal om het ei af te sluiten. OPMERKING: Eieren moeten worden vensterd op E2 of E3. Volgens de ervaring resulteert windowing voorafgaand aan E2 in een lage levensvatbaarheid van het embryo. Bovendien worden door E4 de embryonale en extra-embryonale membranen gehecht aan de eierschaal10, en elke poging om op E4 of later te vensteren, resulteert vaak in embryoschade of scheuren van extra-embryonale bloedvaten, waarbij beide gebeurtenissen leiden tot de uitkomst van embryodood.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de "venstervormige" eieren terug naar de broedmachine voor verdere ontwikkeling. Zorg ervoor dat u de eieren horizontaal houdt en schakel de schommelfunctie van de incubator uit.</li>
	<li>Herhaal stap 2.2.-2.9. voor elk ei.</li>
</ol>3. Microdissecties van de extra-embryonale membranen
<ol><li>Verwijder een E5.5-vensterei uit de broedmachine. Leg het embryo bloot door de tape weg te snijden van het raam met een gesteriliseerde ontleedschaar.</li>
	<li>Gebruik een ontleedmicroscoop om het embryo en zijn extra-embryonale membranen door het raam te observeren. Gebruik indien nodig een schaar of een gebogen iristang om het venster te verbreden, zodat het embryo goed onder het raam wordt geplaatst en zorg ervoor dat de embryonale vasculatuur niet wordt beschadigd.<ol>
<li>Voeg twee druppels Ringer's oplossing met penicilline / streptomycine-antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een ontleedmicroscoop om ervoor te zorgen dat het embryo zich in het juiste ontwikkelingsstadium bevindt (Hamburger Hamilton stadium 27, ~E5.5)11,12 en lokaliseer de posities van het vruchtwatervlies (ACM) en het chorioallantoïsche membraan (CAM). OPMERKING: In dit stadium wordt het embryo omringd door de ACM, die bestaat uit het vruchtwatermembraan en het bovenliggende chorionmembraan gefuseerd en gedeeltelijk bedekt door de sterk gevasculariseerde allantois, die zich uitstrekt van het darmgebied van het embryo en fuseert met het overlappende chorion om de CAM11,12 te vormen. De ACM is niet zwaar gevasculariseerd, waardoor men deze membranen kan ontleden om het embryo bloot te stellen zonder de bloedvaten te beschadigen en het embryo te beschadigen.</li>
	<li>Voer in dit stadium extra-embryonale membraandissecties uit (E5.5). OPMERKING: E5.5 is het ideale moment om de extra-embryonale membraandissecties uit te voeren. Het eerder ontleden van de membranen (bijvoorbeeld bij E4) vóór CAM-vorming vermindert de toegankelijkheid van het embryo in latere stadia11. Bovendien wordt het embryo op E5.5 slechts gedeeltelijk bedekt door de sterk gevasculariseerde CAM, maar in de komende 1-2 dagen omhult de CAM snel en sluit verdere toegang tot het embryouit 11,12. Om deze reden is membraandissectie op E6 of later een uitdaging, omdat het risico op scheurende bloedvaten toeneemt.<ol>
<li>Gebruik een paar gesteriliseerde fijne tangen om de ACM voorzichtig vast te pakken en weg te trekken van het embryo. Gebruik vervolgens een gesteriliseerde micro-ontleedschaar om een gat in de ACM direct boven de voorpoot te snijden dat zich uitstrekt van het membraan boven de voorpoot tot het membraan boven het hoofd. OPMERKING: Deze stap ontspant de chorion- en amnionmembranen, waardoor ze gemakkelijker te grijpen zijn en verder te ontleden met een tang in de volgende stappen. Zie figuur 1 voor een nuttig schema van hoe membranen worden ontleed door het eierschaalvenster.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik twee paar fijne, steriele tangen om het amnion voorzichtig vast te pakken in twee aangrenzende posities tussen de ACM en de CAM (bijvoorbeeld een gebied tussen de snede boven de voorpoot en de dichtstbijzijnde rand van de CAM).<ol>
<li>Beweeg voorzichtig elk paar tangen, beide stevig het vruchtwatermembraan vastpakkend, van elkaar af, waarbij het ene paar dorsaal naar het embryo beweegt en het andere ventraal. OPMERKING: Deze beweging dient om het amnion verder te scheuren en tegelijkertijd de ACM (die door de ene tang in de dorsale richting ten opzichte van het embryo wordt getrokken) en de CAM (die door de andere tang in de ventrale richting ten opzichte van het embryo wordt getrokken) te scheiden.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de membranen worden gescheiden wanneer de CAM het embryo niet langer bedekt en de allantoïsche slagader en ader, die afkomstig zijn van de embryonale darm naar de CAM, gemakkelijk zichtbaar zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik gesteriliseerde fijne tangen om het resterende amnionmembraan dat het embryo bedekt te ontleden en te verwijderen. Het wordt meestal waargenomen dat het resterende amnion de caudale helft van het embryo gedeeltelijk bedekt.<ol>
<li>Pak met behulp van een gesteriliseerde tang het amnion in de buurt van het midden van de schedel van het embryo en trek het amnion voorzichtig in een caudale richting met betrekking tot het embryo naar de eerder verplaatste CAM. Het embryo zal nu volledig worden blootgesteld en verdere groei van de CAM zal voornamelijk plaatsvinden buiten het zich ontwikkelende embryo. OPMERKING: Zie figuur 1 voor een nuttig schema over hoe het blootgestelde embryo zal verschijnen na membraandissectie. Raadpleeg ook een eerder gepubliceerd rapport11 voor nuttige schematische diagrammen van stap 3.3.-3.6.</li>
	</ol></li>
	<li>Voeg een paar druppels Ringer's oplossing met penicilline / streptomycine antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.</li>
	<li>Sluit het raamgat opnieuw met doorzichtige tape, zoals beschreven in stap 2.8. Breng het ei terug naar de incubator voor verdere ontwikkeling, houd het ei horizontaal en houd de schommelfunctie van de incubator geïnactiveerd.</li>
	<li>Herhaal stap 3.1.-3.8. voor elk ei. OPMERKING: De hierboven beschreven extra-embryonale membraandissecties op E5.5 maken toegang tot het embryo mogelijk via E7, wanneer wonden kunnen worden uitgevoerd 8,9. Tegen E8 begint de voortdurende groei van het CAM-weefsel het schedelgebied van het embryo te bedekken, waardoor verdere toegang tot het hoornvlies wordt uitgesloten. Als men wonden wil uitvoeren in oudere E8-E9 hoornvliezen, is het mogelijk om de groeiende CAM ventraal te herpositioneren ten opzichte van het embryo (stap 3.10.). Als men op E7 wil verwonden, stap 3.10. is niet nodig om uit te voeren en men kan doorgaan naar stap 4, hoornvlieswonden.</li>
	<li>Verwijder een E7-ei uit de couveuse waarvan de extra-embryonale membranen eerder werden ontleed bij E5.5 (stappen 3.1.-3.8.). Pak met gesteriliseerde tang alle beschikbare amnionmembraanweefsels vast die met de CAM zijn gefuseerd en trek het amnionmembraan voorzichtig weg van het schedelgebied van het embryo in een ventrale richting ten opzichte van het embryo. OPMERKING: Aangezien het amnionische membraan dat van het embryo wordt verplaatst, is gefuseerd met de CAM, zal de groeiende en sterk gevasculariseerde CAM de amnion-grijpende tang volgen en weggaan van het schedelgebied. Herhaal deze stap dagelijks om de CAM voortdurend weg te verplaatsen van het embryo totdat het embryo de gewenste leeftijd heeft om te verwonden.</li>
</ol>4. Hoornvlies verwonding
<ol><li>Verkrijg een ei uit de couveuse voor verwonding op de gewenste embryonale leeftijd, E7-E9. Leg het embryo bloot door de tape weg te snijden van het raam met een gesteriliseerde ontleedschaar. Voeg een paar druppels Ringer's oplossing met penicilline / streptomycine antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.</li>
	<li>Gebruik een micro-ontleedmes om een incisie te maken die de omvang van het hoornvlies van het rechteroog overspant (vanwege de manier waarop het embryo in het ei ligt, is het linkeroog niet toegankelijk maar kan het dienen als een niet-gewonde controle), die parallel loopt aan en in overeenstemming is met de koraalspleet (figuur 1). De eerste snede doorkruist het hoornvliesepitheel.<ol>
<li>Gebruik het micro-ontleedmes om het hoornvlies opnieuw te scheuren op dezelfde plek als de eerste incisie 2x meer (bijv. drie sneden in totaal, waarbij snede 2 en snij 3 optreden, samen met dezelfde positie in het hoornvlies als gesneden 1)11. De tweede scheur zal het keldermembraan doorkruisen en de derde zal het voorste stroma binnendringen. OPMERKING: Als het embryo zich onder de ontleedde CAM heeft gevestigd, kan men gesteriliseerde gebogen iristangen gebruiken om het hoofd voorzichtig onder de CAM vandaan te bewegen. Plaats de gebogen iristang onder het hoofd en maak contact met de linkerkant van het hoofd. Wieg het hele hoofd bovenop de gesloten gebogen iristang en til het hoofd voorzichtig rond en boven de CAM op. Om te helpen bij de levensvatbaarheid, gebruikt u een vergelijkbare techniek met de gebogen iristang om het embryo na de operatie terug onder de CAM te stoppen om een goede groei van de CAM te bevorderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 3-4 druppels Ringer's oplossing met Penicilline / Streptomycine-antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.</li>
	<li>Sluit het raamgat opnieuw met doorzichtige tape en keer terug naar de broedmachine, waarbij het ei horizontaal blijft. Laat het embryo zich ontwikkelen en de hoornvlieswond gedurende een gewenste periode genezen (bijv. 0,5-11 dagen) en euthanaseer het embryo vervolgens op humane wijze door onthoofding.</li>
	<li>Gebruik gebogen iristangen om het oog te oogsten van een geëuthanaseerd embryo dat in een petrischaaltje van Ringer's zoutoplossing zweeft door het oog voorzichtig aan de achterste kant te grijpen, waar het oog en gezichtsweefsel elkaar ontmoeten, en voorzichtig het hele oog weg te tillen en vrij van het gezichtsweefsel.<ol>
<li>Gebruik een fijne tang om een klein gaatje (3-5 cm) in de achterkant van het hele oog te prikken en fixeer het hele oog in 4% paraformaldehyde bij 4 °C 's nachts met milde agitatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wilson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+blindness%3A+a+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Corneal blindness: a global perspective.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).</li>
<li>Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+cornea+as+a+model+of+wound+healing+and+neuronal+re-innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation.</a> Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).</li>
<li>Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sutures+and+dendritic+polymer+adhesives+for+corneal+laceration+repair+in+an+in+vivo+chicken+model%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model.</a> Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).</li>
<li>Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+paradigm+for+corneal+wound+healing+research%3A+the+white+leghorn+chicken+%28Gallus+gallus+domesticus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus).</a> Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).</li>
<li>Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+TGF-%CE%B2+isoforms+and+signaling+intermediates+in+corneal+fibrotic+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).</li>
<li>Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounded+embryonic+corneas+exhibit+nonfibrotic+regeneration+and+complete+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).</li>
<li>Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+normal+collagen+architecture+in+embryonic+wounded+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13815(2020).</li>
<li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).</li>
<li>Spurlin, J., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+increase+accessibility+to+late-stage+chick+embryos+for+in+ovo+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations.</a> Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+pressure+dependent+and+independent+growth+phases+of+the+embryonic+chick+eye+and+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).</li>
<li>Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+wound+healing+in+tenascin+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal wound healing in tenascin knockout mouse.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).</li>
<li>Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+enhancement+of+corneal+epithelial+wound+healing+of+rabbits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo.</a> Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).</li>
<li>Sumioka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+cornea+wound+healing+in+a+tenascin+C-deficient+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model.</a> Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).</li>
<li>Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+tenascin+and+cellular+fibronectin+in+the+rabbit+cornea+after+anterior+keratectomy.+Immunohistochemical+study+of+wound+healing+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).</li>
<li>Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens-derived+Semaphorin3A+regulates+sensory+innervation+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea.</a> Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).</li>
<li>Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+corneal+innervation%3A+interactions+between+nerves+and+specialized+apical+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).</li>
<li>Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+sulfated+glycosaminoglycans+and+their+effects+on+trigeminal+nerve+growth+cone+behavior+in+vitro%3A+roles+for+ECM+in+cornea+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).</li>
<li>Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+and+posttranslational+modification+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+isotype+during+chick+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).</li>
<li>Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generation+microscopy+for+quantitative+analysis+of+collagen+fibrillar+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure.</a> Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).</li>
<li>Waldvogel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bird%27s+eye+view%5BTitle%5D)+AND+%22American+Scientist%22%5BJournal%5D)">The bird's eye view.</a> American Scientist. 78, 342-353 (1990).</li>
<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).</li>
<li>Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+wound+healing+response%3A+cytokine-mediated+interaction+of+the+epithelium%2C+stroma%2C+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen met betrekking tot de informatie die in dit manuscript wordt gepresenteerd.

Het kuiken is een ideaal modelsysteem voor het bestuderen van foetaal, littekenloos hoornvlieswondherstel. In tegenstelling tot zoogdieren is het kuiken gemakkelijk toegankelijk tijdens de ontwikkeling met behulp van ovo8 of ex ovo strategieën24. Het embryonale hoornvlies van het kuiken is veel groter dan hoornvliezen van knaagdieren, met bijna 50% van het schedelvolume gewijd aan het oog25, waardoor het zeer vatbaar is voor fysieke...

Het hoornvlies is het transparante, buitenste weefsel van het oog dat licht doorgeeft en breekt dat bevorderlijk is voor de gezichtsscherpte. In het volwassen hoornvlies leidt schade of infectie aan het corneastroma tot een snelle en robuuste wondgenezingsreactie die wordt gekenmerkt door keratocytenproliferatie, fibrose, verhoogde ontsteking die leidt tot cytokine-geïnduceerde apoptose, generatie van reparatiemyofibroblasten en algehele remodellering van de extracellulaire matrix (ECM)1,2 . Na letsel resulteert een dergelijk herstel van hoornvliesweefsel in ondoorzichtig littekenweefsel dat de transparantie van het hoornvlies vermindert en de doorgang van licht afsluit, waardoor het gezichtsvermogen wordt vervormd en, in de meest ernstige gevallen, leidt tot hoornvliesblindheid3. Er is dus een duidelijke behoefte om betrouwbare diermodellen te ontwikkelen om de complexiteit van wondgenezing aan te pakken en om de cellulaire en moleculaire factoren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor wondsluiting en weefselregeneratie.
Tot op heden hebben de meeste onderzoeken naar de genezing van hoornvlieswonden postnatale4- of volwassen diermodellengebruikt 1,2,5,6,7. Hoewel deze studies hebben geleid tot een aanzienlijke vooruitgang in het begrip van de cornea wondgenezingsrespons en de mechanismen die ten grondslag liggen aan littekenvorming, slagen de beschadigde corneaweefsels in deze genezingsmodellen er niet in om volledig te regenereren, waardoor hun nut voor het identificeren van de moleculaire factoren en cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het volledig recapituleren van corneamorfologie en structuur na letsel wordt beperkt. Foetale wonden die met een mes in het embryonale hoornvlies van het kuiken worden gegenereerd, bezitten daarentegen een intrinsiek vermogen om volledig te genezen op een littekenloze manier8. In het bijzonder vertoont het embryonale hoornvlies van het kuiken nonfibrotische regeneratie met de volledige recapitulatie van de extracellulaire matrixstructuur en innervatiepatronen 8,9.
Het huidige protocol beschrijft een opeenvolging van stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. Ten eerste worden eieren op vroege embryonale leeftijden bekeken om de toegang tot het embryo te vergemakkelijken. Ten tweede wordt een reeks in ovo fysieke manipulaties van de extra-embryonale membranen uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de toegang tot het oog wordt gehandhaafd in latere stadia van ontwikkeling, wat overeenkomt met wanneer de drie cellulaire lagen van het hoornvlies worden gevormd en verwonding gewenst is. Ten derde worden lineaire centrale hoornvliesincisies die door het cornea-epitheel en in het voorste stroma doordringen, gemaakt met behulp van een microchirurgisch mes. Het regeneratieproces of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.

```html
<table>
 <tbody>
 <tr>
 <td>18 G hypodermic needle</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>14-826-5D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30 degree angled microdissecting knife</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>10056-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>D1306</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 mL syringe</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>14-829-45</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alexa Fluor labelled secondary antibodies</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chicken egg trays</td>
 <td>GQF</td>
 <td>O246</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-408</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting scissors, sharp tip</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-578</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100494-908</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kimwipes</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z188956</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microdissecting Scissors</td>
 <td>VWR</td>
 <td>470315-228</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse anti-fibronectin (IgG1)</td>
 <td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
 <td>B3/D6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse anti-laminin (IgG1)</td>
 <td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
 <td>3H11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse antineuron-specific &beta;-tubulin (Tuj1, IgG2a)</td>
 <td>Biolegend</td>
 <td>801213</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse anti-tenascin (IgG1)</td>
 <td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
 <td>M1-B4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>158127</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/Streptomycin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P4333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride (KCl)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P5405</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride (NaCl)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP358</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sportsman 1502 egg incubator</td>
 <td>GQF</td>
 <td>1502</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tear by hand packaging (1.88 inch width)</td>
 <td>Scotch</td>
 <td>n/a</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
```

onderzoek naar littekenloze weefselregeneratie bij embryonale gewonde kikkererwtenhoorns

Investigating Scarless Tissue Regeneration in Embryonic Wounded Chick Corneas

Kuiken embryonale hoornvlieswonden vertonen een opmerkelijk vermogen om volledig en snel te regenereren, terwijl volwassen gewonde hoornvliezen een verlies van transparantie ervaren als gevolg van fibrotische littekens. De weefselintegriteit van gewonde embryonale hoornvliezen is intrinsiek hersteld zonder detecteerbare littekenvorming. Gezien de toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, is het kuikenembryo een ideaal model voor het bestuderen van littekenloos hoornvlieswondherstel. Dit protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. Ten eerste worden eieren op vroege embryonale leeftijden bekeken om toegang te krijgen tot het oog. Ten tweede wordt een reeks in ovo fysieke manipulaties naar de extra-embryonale membranen uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de toegang tot het oog wordt gehandhaafd in latere stadia van ontwikkeling, wat overeenkomt met wanneer de drie cellulaire lagen van het hoornvlies worden gevormd. Ten derde worden lineaire hoornvlieswonden die de buitenste epitheellaag en het voorste stroma binnendringen, gemaakt met behulp van een microchirurgisch mes. Het regeneratieproces of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure. Studies tot nu toe met behulp van dit model hebben aangetoond dat gewonde embryonale hoornvliezen activering van keratocytendifferentiatie vertonen, gecoördineerde remodellering van ECM-eiwitten ondergaan naar hun oorspronkelijke driedimensionale macrostructuur en adequaat opnieuw worden geïnnerveerd door cornea-sensorische zenuwen. In de toekomst kan de potentiële impact van endogene of exogene factoren op het regeneratieve proces worden geanalyseerd bij het genezen van hoornvliezen met behulp van ontwikkelingsbiologische technieken, zoals weefseltransplantatie, elektroporatie, retrovirale infectie of kraalimplantatie. De huidige strategie identificeert het embryonale kuiken als een cruciaal experimenteel paradigma voor het ophelderen van de moleculaire en cellulaire factoren die de genezing van littekenloze hoornvlieswonden coördineren.

Na de eerdere dissectie van de ACM en CAM op E5.5 om het schedelgebied van het zich ontwikkelende embryo bloot te leggen, werd een reeks scheuren gemaakt die het centrale hoornvlies van E7 overspanden in ovo (figuur 1). Een ideale wond om de regeneratie van het hoornvlies te bestuderen, vindt plaats na drie scheuren, elk gemaakt op dezelfde locatie van het hoornvlies. De eerste scheur doorkruist het cornea-epitheel, terwijl de tweede en derde scheuren respectievelijk het onderliggen...

Het huidige protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. De regenererende of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.

Onderzoek naar littekenloze weefselregeneratie bij embryonale gewonde kikkererwtenhoorns

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of ...

Schade aan het volwassen corneastroma leidt tot een snelle wondgenezingsreactie die iemands zicht in gevaar brengt als gevolg van ondoorzichtige littekenweefselvorming. Dit protocol genereert wonden in embryonale kikkererwten die, in tegenstelling tot volwassenen, kunnen genezen zonder een litteken. Gezien het intrinsieke vermogen van het gewonde embryonale hoornvlies om een volledige recapitulatie van de inheemse hoornvliesstructuur te ondergaan zonder detecteerbare littekens, dient het embryonale kuiken een belangrijk diermodel voor het ophelderen van de moleculaire en cellulaire factoren voor littekenloze hoornvlieswondgenezing.Het meest uitdagende aspect van deze techniek is het genereren van een consistente wond die zowel het buitenste epitheel als het diepere corneastroma binnendringt. Zoals men leert, kan het nuttig zijn om de gewonde hoornvliezen in een dwarsdoorsnede te bekijken, zodat de diepte van de wondpenetratie in het hoornvliesstroma kan worden beoordeeld. Om te beginnen, rangschik de eieren horizontaal op een schaal en markeer ze aan de bovenkant van het ei om de verwachte positie van het embryo aan te geven.Incubeer deze eieren in een bevochtigde incubator van 38 graden Celsius met de schommelfunctie geactiveerd. Verwijder het ei uit de couveuse op de derde dag van de embryonale ontwikkeling en plaats het horizontaal in een veilige eihouder. Maak een klein gaatje in de bovenkant van de eierschaal in de buurt van het puntige uiteinde van het ei met behulp van het scherpe uiteinde van de ontleedschaar.Steek een afgeschuinde injectienaald van 18 gauge door het gat. Met de naald naar de bodem van het binnenoppervlak van het ei geduwd en de schuine kant van de naald naar het puntige uiteinde van het ei gericht, verwijdert u twee tot drie milliliter van het albumine uit het kippenei en gooit u het weg. Reinig het eierschaaloppervlak rond het gat met pluisvrije doekjes, licht bevochtigd met 70% ethanol en veeg droog.Dicht het gat dat is gemaakt voor het verwijderen van albumine af met doorzichtige tape. Maak met het scherpe uiteinde van de ontleedschaar een tweede raamgat in de bovenkant van de eierschaal. Zorg ervoor dat de schaar zich niet te ver in de eischaal uitstrekt om te voorkomen dat het embryo of de embryonale vasculatuur direct onder de zijkant van het tweede gat wordt aangetast en beschadigd.Gebruik een gebogen tang om het raamgat te verbreden tot een diameter van ongeveer twee tot drie centimeter om het zich ontwikkelende embryo onder de schaal te onthullen en toegang te krijgen tot het zich ontwikkelende embryo. Steek nu een uiteinde van de tang in het gat en houd het parallel aan en dicht bij de eierschaal. Met het uiteinde van de andere tang buiten de eierschaal, knijp je de twee tanguiteinden voorzichtig samen, zodat ze kunnen breken en kleine stukjes van de eierschaal kunnen verwijderen.Ga door met het breken en verwijderen van eierschaalfragmenten totdat er een venster van twee tot drie centimeter overblijft dat het embryo direct bedekt. Om bacteriële besmetting te beperken, voegt u 100 tot 200 microliter ringeroplossing toe met 50 eenheden per milliliter penicilline en 50 microgram per milliliter streptomycine door het venstergat. Dicht het raamgat af met doorzichtig plakband.Voer deze eierafdichting uit door een hoek van de tape op de lange as van het gat uit te lijnen en de tape op één tot twee centimeter afstand van de rand van het gat op de schaal te drukken. Blijf rond de opening afdichten totdat een hangende klep van tape aan één kant is achtergelaten. Druk de twee stukjes tape tegen elkaar, creëer een koepelvormige vorm over het gat en druk de flap van overhangende tape op de schaal om het ei af te sluiten.Breng de venstereieren terug naar de broedmachine voor verdere ontwikkeling. Zorg ervoor dat u deze eieren horizontaal houdt en schakel de schommelfunctie van de incubators uit. Gebruik een ontleedmicroscoop om ervoor te zorgen dat het embryo zich in het juiste ontwikkelingsstadium bevindt en lokaliseer de posities van het vruchtwatervlies en het chorioallantoïsche membraan.Gebruik vervolgens een gesteriliseerde micro-ontleedschaar om een gat in het vruchtwatervlies direct boven de voorpoot te snijden dat zich uitstrekt van het membraan, boven de voorpoot naar het membraan boven het hoofd. Gebruik twee paar fijne steriele tangen en pak het amnion voorzichtig in twee aangrenzende posities tussen het vruchtwatermembraan ACM en het chorioallantoïsche membraan. Beweeg voorzichtig elk paar tangen, beide stevig het vruchtwatermembraan vastpakkend, van elkaar af, waarbij het ene paar dorsaal naar het embryo beweegt en het andere ventraal.Gebruik gesteriliseerde fijne tangen om het resterende amnionmembraan dat het embryo bedekt te ontleden en te verwijderen. Pak met behulp van een gesteriliseerde tang het amnion in de buurt van het middelste schedelgebied van het embryo en trek het amnion voorzichtig in een vertroetelrichting met betrekking tot het embryo naar het eerder verplaatste chorioallantoïsche membraan. Sluit het raamgat opnieuw met behulp van doorzichtige tape zoals beschreven in het manuscript en breng het ei terug naar de incubator voor verdere ontwikkeling.De extra embryonale membranen moeten mogelijk worden verplaatst om ervoor te zorgen dat het rechteroog toegankelijk is. Als het rechteroog niet toegankelijk is voor verwonding vanwege de positie van het embryo in het ei, kan het dienen als een niet-gewonde controle. Gebruik een micro-ontleedmes om een incisie te maken die de omvang van het hoornvlies van het rechteroog overspant, die evenwijdig is aan en in lijn is met het vaatvliesweefsel.Gebruik het micro-ontleedmes om het hoornvlies opnieuw te scheuren op dezelfde plek als de eerste incisie, twee keer meer op zo'n manier dat de snede twee en snij drie voorkomt, samen met dezelfde positie in het hoornvlies als gesneden één. Om te helpen bij de levensvatbaarheid, gebruikt u de gebogen iristang om het embryo na de operatie terug onder het chorioallantoïsche membraan te stoppen om een goede groei van het chorioallantoïsche membraan te bevorderen. Voeg vervolgens drie tot vier druppels ringeroplossing toe die antibiotica bevatten om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.Sluit het raamgat opnieuw met doorzichtige tape en keer terug naar de broedmachine, waarbij het ei horizontaal blijft. Laat het embryo zich ontwikkelen en de hoornvlieswond gedurende een gewenste periode genezen. Na de incubatie, euthanaseer het embryo en gebruik gebogen iristang om het oog te oogsten in een petrischaal van Ringer's zoutoplossing door het oog voorzichtig vast te pakken aan de achterste kant waar het oog en gezichtsweefsel elkaar ontmoeten en voorzichtig het hele oog weg te tillen en vrij van het gezichtsweefsel.Gebruik een fijne tang om een klein gaatje van drie tot vijf centimeter in de achterkant van het hele oog te prikken en fixeer het hele oog 's nachts in 4% paraformaldehyde op vier graden Celsius met milde agitatie. Om een ideale wond te bereiken, is het cruciaal om een scherp microdissectiemes te gebruiken en de juiste hoeveelheid druk uit te oefenen tijdens de scheur. Te weinig druk uitoefenen zal resulteren in een ondiepe wond die het hoornvliesepitheel scheurt zonder voldoende door het voorste stroma te dringen.Het toepassen van te veel druk resulteert in een volledige wond die het hele stroma binnendringt en de waterige humor blootstelt aan de externe omgeving. Het uitvoeren van de juiste scheurincisies produceert een ideale wond die in eerste instantie nul tot drie dagen na het verwonden vergroot. Daarna vindt re-epithelisatie en nieuwe weefselvorming plaats om de wond uiteindelijk op een littekenvrije manier te sluiten met 11 dagen, na het verwonden.Spatiotemporale lokalisatie van de extracellulaire matrixeiwitten, fibronectine en tenascine in de genezende wond bleek verhoogd te zijn op tijdstippen die overeenkomen met cornea-re-epithelisatie, wat hun betrokkenheid bij wondsluiting, epitheelcelmigratie en overleving suggereert. Whole mount immunohistochemie onthulde dat de zenuwen die het gewonde centrale hoornvlies direct naast elkaar plaatsten, tijdelijk worden geremd uit het genezende hoornvliesweefsel. Ondanks eerdere remming innerveren hoornvlieszenuwen uiteindelijk het volledig genezen hoornvliesweefsel 11 dagen na het verwonden tot vergelijkbare dichtheidsniveaus en in vergelijkbare patronen als stadiumgematchte niet-gewonde controles embryonale dag 18.Zoals blijkt uit harmonische beeldvorming van de tweede generatie, worden bundels collageenvezels op verschillende diepten van de centrale hoornvlieswond orthogonaal gerangschikt gezien, overeenkomend met de inheemse macrostructuur van niet-gewond centraal hoornvliesweefsel. In combinatie met klassieke ontwikkelingsbiologische benaderingen, zoals weefseltransplantatie en kraalimplantatie, evenals moderne benaderingen voor genmanipulatie zoals retrovirale infectie en DNA-elektroporatie, belooft dit diermodel moleculaire factoren en cellulaire mechanismen te onthullen die nodig zijn om littekenloze wondgenezing van hoornvlies te bevorderen. Het bepalen van belangrijke moleculaire factoren in matrixeiwitten die foetale littekenloze wondgenezing reguleren, zal de weg vrijmaken voor therapieën die een meer herstellend genezingsproces bevorderen met minder littekens en een betere recapitulatie van de normale weefselarchitectuur.

investigating-scarless-tissue-regeneration-embryonic-wounded-chick

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Wij rapporteren een methode voor de fabricage van micropockets binnen electrospun membranen waarin celgedrag te bestuderen. Specifiek beschrijven we een combinatie van microstereolithography en elektrospinnen voor de productie van PLGA (poly (lactide-co-glycolide)) corneale biomateriaal inrichtingen voorzien microfeatures.

Combinatie van Microstereolithography en Electrospinning naar Membranen Uitgerust met Niches voor cornearegeneratie Produce

Hier wordt de oprichting beschreven van een klinisch relevant ex vivo model voor een nabootste cataractoperatie dat kan worden gebruikt om mechanismen van het letselrespons van epitheelweefsels binnen hun oorspronkelijke micro-omgeving te onderzoeken.

Oprichting van een klinisch relevante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery model voor het onderzoeken van Epithelial Wound Repair in een Inheems Microenvironment

In dit artikel beschrijven we de principes voor het ontwerpen en uitvoeren van een multi-kleurig lijn-traceringsexperiment met behulp van R26R-Confetti muizen. We bieden een specifiek protocol voor het volgen van hoornvliesepitheelcellen die kunnen worden aangepast voor andere weefsels van belang.

Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Dit protocol beschrijft een methode om een slijtage aan de oculaire oppervlakte van de muis toebrengen, en volgen de wond genezingsproces daarna. Het protocol maakt gebruik van een oogbeschadigingen en/of burr gedeeltelijk verwijderen van de oppervlakte-epitheel van het oog bij verdoofde muizen.

Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

Een protocol voor een ex vivo hoornvlies orgel cultuur model nuttig voor wond genezing studies wordt beschreven. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van de drug toxiciteit in een georganiseerde 3D meercellige omgeving of agenten om regeneratieve genezing te bevorderen.

Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekten te evalueren.

Een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing

Dit artikel beschrijft een nieuw diermodel dat is ontwikkeld om de anatomie en histologie van het hoornvlies en zijn genezingsprocessen te bestuderen. Dit nieuwe diermodel maakt gebruik van de Mongoolse gerbil, die een hoornvlies heeft met veel overeenkomsten met het menselijk hoornvlies.

Mongoolse Gerbils als een diermodel voor wondgenezing

Descemet's Stripping Only is een experimentele procedure waarbij patiënten met centrale cornea guttae als gevolg van Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy het membraan van Descemet laten strippen voor perifere cellen om de endotheellaag te regenereren. We presenteren een nieuwe methodologie die DSO simuleert in dystrofische menselijke hoornvliezen ex vivo met versnelde genezing gestimuleerd door eFGF1 (NM141).

Een menselijk hoornvliesorgaancultuurmodel van Descemet's strippen alleen met versnelde genezing gestimuleerd door gemanipuleerde fibroblastgroeifactor 1

Hier stellen we drie verschillende methoden voor om de sensorische vezels die het hoornvlies innerveren te beschadigen. Deze methoden vergemakkelijken de studie van axonregeneratie bij muizen. Deze drie methoden, die kunnen worden aangepast aan andere diermodellen, zijn ideaal voor de studie van de fysiologie en regeneratie van de innervatie van het hoornvlies.

Drie strategieën om neurotrofe keratitis en zenuwregeneratie in het hoornvlies van muizen te induceren

Ex vivo orgaancultuur van het hoornvlies van varkens en epitheliale wondgenezing bieden een economisch, ethisch, reproduceerbaar en kwantitatief middel voor het testen van de oculaire toxiciteit van chemicaliën. Ze helpen ook bij het ophelderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van epithelisatie en weefselherstel, en bij het evalueren van therapieën voor de behandeling van diabetische keratopathie en vertraagde wondgenezing.

Evaluatie van therapeutische en chemische toxiciteit met behulp van orgaangekweekte varkenshoornvliezen en epitheliale wondgenezing

Er wordt een reproduceerbaar protocol gepresenteerd voor de bereiding, verrijking en toepassing van een in situ blauwlicht-crosslinkable gelatine-riboflavine hydrogel voor het herstel van corneale stromale wonden bij konijnen, inclusief procedurele stappen voor chirurgische behandeling, gedeeltelijke tarsorrofie en postoperatieve zorg.

Fabricage en chirurgische toepassing van verrijkte, foto-gekruiste gelatine–riboflavine hydrogels voor herstel van hoornvlieswonden bij konijnen

Leer een wondprotocol voor embryonale kikkervogelhoornen om littekenloze weefselregeneratie te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers de moleculaire en cellulaire mechanismen van regeneratieve genezing te ontrafelen.

Onderzoek naar littekenloze weefselregeneratie bij embryonale gewonde kikkererwtenhoorns

Meer video's verkennen