Name: Beeldvorming van neutrofielenmigratie in de huid van muizen om subcellulaire membraanremodellering onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Ontdek intravitale subcellulaire microscopie om membraanremodellering bij neutrofielenmigratie in muizen te bestuderen. Deze methode visualiseert dynamische celmembraanprocessen in levend weefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

<ol><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
<li>Oudin, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+gradients+in+the+tumor+microenvironment+regulate+tumor+cell+invasion%2C+migration%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical gradients in the tumor microenvironment regulate tumor cell invasion, migration, and metastasis.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 81, 189-205 (2016).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+networks+that+regulate+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling networks that regulate cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 005959(2015).</li>
<li>Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+in+mesenchymal-to-amoeboid+transition+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Wagner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWagner%2C+R+%22Explanatory+panels+on+physiology+and+development+history+1839%22">Explanatory panels on physiology and development history 1839</a>. , Leopold Voss. Leipzig, Germany. (1839).</li>
<li>Yaniv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+lymphatic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Live imaging of lymphatic development in the zebrafish.</a> Nature Medicine. 12 (6), 711-716 (2006).</li>
<li>Vinegoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), e1510(2009).</li>
<li>Sack, F. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+pulmonary+microcirculation+after+single+lung+transplantation+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs.</a> Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).</li>
<li>Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+3D+visualization+of+cellular+and+tissue+structures+in+intact+muscle+with+second+and+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy.</a> PloS One. 6 (11), 28237(2011).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+third+harmonic+generation+microscopy+of+collective+melanoma+cell+invasion%3A+Principles+of+interface+guidance+and+microvesicle+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics.</a> Intravital. 1, 32-43 (2012).</li>
<li>Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microscopy+and+the+extracellular+matrix+structure%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review.</a> Cells. 10 (7), 1760(2021).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third+harmonic+generation+microscopy+of+cells+and+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization.</a> Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).</li>
<li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+polyhedral+actomyosin+lattices+remodel+micron-scale+curved+membranes+during+exocytosis+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).</li>
<li>Shitara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+negatively+regulates+endocytosis+during+apical+membrane+maintenance+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
<li>Subramanian, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LTB4-BLT1+axis+regulates+actomyosin+and+%CE%B22-integrin+dynamics+during+neutrophil+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215(2020).</li>
<li>Yan, S. L. S., Hwang, I. -Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+F-Actin+filament+organization+during+lymphocyte+transendothelial+and+interstitial+migration+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy.</a> iScience. 16, 283-297 (2019).</li>
<li>Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-wide+synchronization+of+mitochondrial+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations.</a> Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).</li>
<li>Takihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Calvo-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mitochondrial+calcium+levels+associated+with+neuronal+death+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 11, 2146(2020).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Li, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+immune+responses+in+the+mouse+ear+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin.</a> Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ly6C%2FLy6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li>
<li>Lakschevitz, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neutrophil+surface+marker+changes+in+health+and+inflammation+using+high-throughput+screening+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry.</a> Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (17), e745(2008).</li>
<li>MATLAB - Bio-Formats 6.1.0 documentation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html">https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html</a> (2022).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).</li>
<li>Xu, C., Prince, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakes%2C+shapes%2C+and+gradient+vector+flow%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%3A+A+Publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">Snakes, shapes, and gradient vector flow.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).</li>
<li>Driscoll, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+nuclear+shape%3A+what+can+we+learn+from+a+prematurely+aged+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell.</a> Aging. 4 (2), 119-132 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigating+phototoxicity+during+multiphoton+microscopy+of+live+Drosophila+embryos+in+the+1.0-1.2+%C2%B5m+wavelength+range%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range.</a> PloS One. 9 (8), 104250(2014).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoregulin+regulates+a+shedding+mechanism+that+drives+melanosome+transfer+from+melanocytes+to+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Ondanks tientallen jaren van vooruitgang op het gebied van celmigratie en membraanremodellering, hebben zeer weinig studies IVM gebruikt om subcellulaire kenmerken bij levende dieren te visualiseren. De procedures die in dit protocol worden beschreven, bieden een krachtig hulpmiddel om nieuwe inzichten te verkrijgen in de migratie van neutrofielen bij levende dieren en meer specifiek in de remodellering van plasmamembranen tijdens dit proces. Deze benadering maakt het mogelijk om de migratie van neutrofielen onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken, rekening houdend met de inherente complexiteit van de micro-omgeving van het weefsel. Het gebruik van MPM maakt inderdaad de visualisatie van meerdere kenmerken in het gastheerweefsel mogelijk door gebruik te maken van een combinatie van muizenstammen die geselecteerde fluorescerende markers tot expressie brengen, exogene weefsellabeling, excitatie van endogene fluorescentie en signalen gegenereerd door SHG of THG12,13.
Een mogelijk probleem waarmee u bij deze procedure rekening moet houden, is fotoschade. Hoewel MPM over het algemeen veiliger is dan confocale microscopie met betrekking tot fotobleken en fototoxiciteit, moet voorzichtigheid worden betracht bij het afbeelden van levende weefsels34. Fototoxiciteit kan de resultaten drastisch belemmeren door ofwel beeldvormingsartefacten te creëren, variërend van kleine heldere spikkels tot grotere delen van beschadigd weefsel, of door een verscheidenheid aan intracellulaire routes te remmen/stimuleren. Om fototoxiciteit te voorkomen, moet het laservermogen tot een minimum worden beperkt en moeten de juiste controles worden ontworpen om te controleren of de fysiologische omstandigheden worden gehandhaafd (bijv. het meten van de bloedstroom, sondes voor oxidatieve stress)35,36. Bovendien worden bij deze specifieke procedure, waarbij de huid betrokken is, albinostammen ten zeerste aanbevolen, aangezien de melanine die aanwezig is in donkerharige dieren gevoeliger is voor fototoxiciteit 36,37,38.
Een van de belangrijkste beperkingen van de procedure zijn het gebruikte microscoopsysteem en de aard van neutrofielen. Hoewel het gebruik van MPM de diepte van weefselbeeldvorming aanzienlijk vergroot in vergelijking met andere lichtmicroscopietechnieken (bijv. confocaal, draaiende schijf), is het vermogen om subcellulaire dynamiek in het oor te visualiseren beperkt tot de buitenste lagen van het weefsel (80-100 μm). Dit komt door de intense lichtverstrooiing die wordt geproduceerd door de dikke ECM-laag, waardoor het moeilijk is om migratie in de diepere lagen te onderzoeken. Een andere beperking is het feit dat neutrofielen zeer kortlevend zijn en niet lang genoeg in cultuur kunnen worden gehouden om genbewerkingstechnieken uit te voeren. Dit kan worden overwonnen door muizen te manipuleren om neutrofielen te produceren die specifieke genen missen of geselecteerde mutaties herbergen, wat natuurlijk de onderzoekskosten en duur verhoogt.
De hier beschreven procedures, hoewel ontworpen om de membraandynamiek te onderzoeken, kunnen worden aangepast om elke celbiologische vraag te beantwoorden, niet alleen in neutrofielen, maar ook in andere immuunceltypen en migrerende cellen. De informatie die wordt verzameld door IVM met lage vergroting over cellulair gedrag (bijv. migratiefenotype, celsnelheid en directionaliteit22) kan worden aangevuld en gecorreleerd met mechanistische informatie die is verkregen via ISMic over herpositionering van organellen, eiwitsecretie, endocytose, nucleaire dynamiek, calciumdynamiek, cytoskeletorganisatie en netose. Het gebruik van farmacologische en/of genetische manipulaties kan de rol van specifieke moleculaire routes in het proces van interesse benadrukken, waardoor dit een unieke en zeer krachtige benadering is.

Gerichte celmigratie is een kritieke gebeurtenis die optreedt tijdens verschillende fysiologische en pathologische processen, waaronder ontwikkeling, immuunrespons, weefselherstel en het initiëren, progressie en verspreiden van tumoren 1,2. Dit proces is gebaseerd op specifieke extracellulaire chemotactische signalen die worden gedetecteerd door hun verwante receptoren op het plasmamembraan en vervolgens worden omgezet in ingewikkelde intracellulaire signalen. Deze routes activeren op hun beurt celmigratie door middel van een reeks reacties, waaronder lokale activering van het cytoskelet, membraantransport en -hermodellering, en celpolarisatie3. Twee verschillende soorten celmigratie zijn goed gekarakteriseerd: mesenchymaal en amoeboïde4. Mesenchymale migratie is relatief traag (<1 μm/min), berust op sterke hechting tussen cellen en de extracellulaire matrix (ECM) en is afhankelijk van door metalloproteasen geïnduceerde matrixdegradatie. Daarentegen is ameboïde migratie, een kenmerk van immuuncellen die snel reageren op ontstekingssignalen, sneller (>10 μm/min) en maakt gebruik van zwakke verklevingen om door de ECM te navigeren. Ongeacht de modaliteit vereist celmigratie een constante hermodellering van het plasmamembraan, wat resulteert in het genereren van uitstekende structuren aan de voorrand van de cellen, die nauw worden gecoördineerd met de terugtrekking van het membraan aan de achterkant1.
Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze subcellulaire processen te ontrafelen, is het van fundamenteel belang om de dynamiek van de membranen in migrerende cellen te visualiseren met een passende temporele en ruimtelijke resolutie. Aangezien membraanremodellering sterk wordt beïnvloed door de eigenschappen van de weefselmicro-omgeving die de migrerende cellen omringt, is het bovendien van cruciaal belang om dit proces rechtstreeks in beeld te brengen in het natuurlijke weefsel, bij levende dieren. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van intravitale microscopie (IVM)5. De allereerste IVM-beeldvorming werd ~200 jaar geleden uitgevoerd, toen de extravasatie van leukocyten werd gevisualiseerd met behulp van een eenvoudige transilluminatiemicroscoop6 en daarna werd IVM voornamelijk gebruikt op semi-transparante modelorganismen, zoals zebravissen en Drosophila 7,8. In de afgelopen twee decennia is IVM met succes gebruikt om cellulaire processen bij muizen, ratten en grotere zoogdieren zoals varkens te onderzoeken 5,9. Dit werd mogelijk gemaakt door 1) belangrijke ontwikkelingen in confocale en multi-foton (MP) microscopie en 2) de opkomst van genbewerkingstechnologie zoals CRISPR-Cas9, die de snelle engineering van een verscheidenheid aan diermodellen mogelijk heeft gemaakt om fluorescerend gelabelde eiwitten en reporters tot expressie te brengen. Bovendien is de visualisatie van individuele cellen en hun micro-omgeving tijdens processen zoals tumorinitiatie, celmigratie en immuunrespons mogelijk gemaakt door zowel andere vormen van exogene etikettering, zoals de systemische introductie van kleurstoffen om het vaatstelsel te labelen 10,11, als de excitatie van endogene moleculen, zoals collageen door Second Harmonic Generation (SHG)10, 12 en zenuwvezels door Derde Harmonische Generatie (THG)11,13. Ten slotte heeft een verbetering in de technieken om de bewegingsartefacten als gevolg van hartslag en ademhaling te minimaliseren geleid tot de ontwikkeling van intravitale subcellulaire microscopie (ISMic), waardoor onderzoekers verschillende subcellulaire gebeurtenissen rechtstreeks bij levende dieren kunnen afbeelden en onderzoeken met een resolutieniveau dat vergelijkbaar is met die welke in vitro zijn waargenomen 14,15,16,17 . Voorbeelden van ISMic zijn onder meer het onderzoeken van de dynamiek van het cytoskelet tijdens exocytose 14,15,16,17 en endocytose 15, dynamische remodellering van het cytoskelet tijdens celmigratie17,18, mitochondriale lokalisatie en metabolisme19,20 en calciumsignalering in de hersenen 21.
Dit protocol beschrijft de verschillende stappen en procedures om de remodellering van het celmembraan met een subcellulaire resolutie te onderzoeken tijdens de migratie van neutrofielen in de oorhuid van een levende muis met behulp van ISMic. Deze aanpak is gebaseerd op eerder beschreven protocollen22,23 en aangepast om een hogere ruimtelijke en temporele resolutie te bereiken.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>27 G needle</td><td>Kendall</td><td>827112</td><td></td></tr><tr><td>27 G winged infusion set</td><td>Terumo</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>30x objective</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1.05 NA, silicon oil immersion</td></tr><tr><td>40x objective</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO40XS</td><td>1.23 NA, silicon oil immersion</td></tr><tr><td>60 mm dishes</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 mL syringe</td><td>Kendall</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine (10 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>AND</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 40 &micro;m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td>Beeldvisualisatie/analysesoftware</td></tr><tr><td>Fluoview Software</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Acquisitiesoftware</td></tr><tr><td>FVB muisstam</td><td>Jackson</td><td>N/A</td><td>FVB achtergrond</td></tr><tr><td>Gasanesthesiesysteem</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-8915712</td><td>Link 7 model</td></tr><tr><td>Green Cell tracker</td><td>Thermo</td><td>C2925</td><td>Oplosbaar in celkweekkwaliteit DMSO om een concentratie van 1 mM te bereiken (1000x)</td></tr><tr><td>Haarverwijderingscrème</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (zonder Ca2+, Mg2+)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M pH 7.3</td><td>Quality Biological</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Beeldvisualisatie/analysesoftware</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Vet one</td><td>13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>gegenereerd in het lab</td><td>N/A</td><td>C57BL/6J achtergrond</td></tr><tr><td>Handmatige micromanipulator</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MatWorks</td><td>N/A</td><td>Analysesoftware</td></tr><tr><td>mtomato muisstam</td><td>gegenereerd in het lab</td><td>N/A</td><td>mT/mG, FVB achtergrond</td></tr><tr><td>Multifoton laser</td><td>Spectra Physics</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>Multifoton microscoop</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 10 &micro;L-sering</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33 G-naald</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Objectievenheater</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Objectievenheatercontroller</td><td>Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>Oftalmische zalf</td><td>Major</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>Zuurstofconcentrator</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS (zonder Ca2+, Mg2+)</td><td>Quality Biological</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Quality Biological</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>Stageheater</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stageheatercontroller</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische tape</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td>Hypoallergeen</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingspads</td><td>Parkland Scientific</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingspomp</td><td>Parkland Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

beeldvorming van neutrofielenmigratie in de huid van muizen om subcellulaire membraanremodellering onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

De studie van de rekrutering en functie van immuuncellen in weefsels is de afgelopen twee decennia een zeer actief gebied geweest. Neutrofielen behoren tot de eerste immuuncellen die de plaats van ontsteking bereiken en deelnemen aan de aangeboren immuunrespons tijdens infectie of weefselbeschadiging. Tot nu toe is de migratie van neutrofielen met succes gevisualiseerd met behulp van verschillende in vitro experimentele systemen op basis van uniforme stimulatie, of beperkte migratie onder agarose of microfluïdische kanalen. Deze modellen geven echter geen samenvatting van de complexe micro-omgeving waarmee neutrofielen in vivo te maken krijgen. De ontwikkeling van op multifotonenmicroscopie (MPM) gebaseerde technieken, zoals intravitale subcellulaire microscopie (ISMic), biedt een uniek hulpmiddel om de dynamiek van neutrofielen bij subcellulaire resoluties onder fysiologische omstandigheden te visualiseren en te onderzoeken. Met name het oor van een levend verdoofde muis biedt een experimenteel voordeel om neutrofiele interstitiële migratie in realtime te volgen vanwege de gemakkelijke toegankelijkheid en het ontbreken van chirurgische blootstelling. ISMic biedt de optische resolutie, snelheid en diepte van acquisitie die nodig zijn om zowel cellulaire als, nog belangrijker, subcellulaire processen in 3D in de loop van de tijd (4D) te volgen. Bovendien kan multimodale beeldvorming van de interstitiële micro-omgeving (d.w.z. bloedvaten, residente cellen, extracellulaire matrix) gemakkelijk worden bereikt met behulp van een combinatie van transgene muizen die geselecteerde fluorescerende markers tot expressie brengen, exogene labeling via fluorescerende sondes, intrinsieke fluorescentie van weefsel en tweede/derde harmonische gegenereerde signalen. Dit protocol beschrijft 1) de voorbereiding van neutrofielen voor adoptieve overdracht in het oor van de muis, 2) verschillende instellingen voor optimale subcellulaire beeldvorming, 3) strategieën om bewegingsartefacten te minimaliseren met behoud van een fysiologische respons, 4) voorbeelden van membraanremodellering waargenomen bij neutrofielen met behulp van ISMic, en 5) een workflow voor de kwantitatieve analyse van membraanremodellering bij migrerende neutrofielen in vivo.

Hier worden twee verschillende reeksen resultaten gepresenteerd om klassieke IVM en ISMic te illustreren die respectievelijk cellulaire en subcellulaire resolutie bieden. In het eerste voorbeeld werden neutrofielen gezuiverd uit een wildtype (WT) muis, gelabeld met Cell Tracker Green om het cytoplasma te kleuren, en geïnjecteerd in een transgene muis die een fluorescerend eiwit tot expressie bracht dat gericht was op het plasmamembraan (mTomato-muis, ook bekend als mT/mG33, Figuur 1 en Movie 1 en Movie 2). Deze ontvangende muis maakte de visualisatie mogelijk van structurele kenmerken in het oorweefsel, zoals bloedvaten, residente cellen en haarzakjes (Figuur 1C en Movie 1) via een op IVM gebaseerde benadering (stap 6.8.1). Collageenvezels, onthuld via SHG (gedetecteerd op de helft van de golflengte van de excitatie), werden gerangschikt in een ingewikkeld netwerk in de dermis, waar neutrofielen werden geïnjecteerd. Langs de rand van de haarzakjes (HF) werd een laag epitheelcellen (d.w.z. keratinocyten) waargenomen. Af en toe werden artefacten van resterende haren die resulteerden in een lokale depressie van de huid gevisualiseerd (H). De door laser geïnduceerde verwondingen waren gemakkelijk te visualiseren dankzij hun sterke autofluorescentie die in alle kanalen werd gedetecteerd en door de veranderingen in de collageenrangschikking (Figuur 1D). Een completer beeld van de 3D-architectuur van de huid en de lokalisatie van de geïnjecteerde neutrofielen is te zien in film 1, die een Z-stapel van de huid van de buitenste naar de binnenste lagen en een 3D-volumeweergave weergeeft. Time-lapse-beeldvorming toonde de neutrofielen die de oorhuid bemonsterden en interageerden met de ECM en het gastheerweefsel (film 2). Beeldvorming met deze resolutie en het verkrijgen van een Z-stack om de 30 s maakt het mogelijk om celtracking uit te voeren en motiliteitsparameters (d.w.z. snelheid en richting) te meten, maar een nauwkeurige en gedetailleerde analyse van membraanremodellering is een uitdaging bij deze resolutie.
In het tweede voorbeeld werd membraanremodellering beoordeeld via de ISMic-benadering (stap 6.8.2) met behulp van mGFP-expressieve neutrofielen gezuiverd uit LyzM-cre mT/mG-muizen en geïnjecteerd in WT-dieren (Figuur 2A, experimenteel stroomschema). Met behulp van het ISMic-protocol (Movie 3 en stilstaande beelden in Figuur 2B) en bij laserletsel wordt dynamische remodellering van het plasmamembraan waargenomen tijdens de migratie en wordt de vorming van membraanuitsteeksels aan de voorrand en de terugtrekking van de achterkant van de cellen duidelijk gevisualiseerd (Figuur 2 en Movie 3). De time-lapse-sequenties die in film 3 worden belicht, onthullen de complexiteit van de interacties met de ECM. Inderdaad, neutrofielen migreerden door de interstitiële ruimte en bewogen zich langs de vezels of in de ruimtes ertussen. Ten slotte werden kwantitatieve aspecten zoals de veranderingen in kromming en de oppervlakteveranderingen aan de voor- en achterkant van de cellen voor elk tijdstip gekwantificeerd. Aan de hand van de in figuur 2B beschreven cel werd de lokale dynamiek van het plasmamembraan geanalyseerd met behulp van een algoritmepijplijn (zie stap 7) op basis van de identificatie van 100 grenspunten onder het celoppervlak (figuur 3A). De veranderingen in de lokale kromming (Figuur 3B) en in het gebied dat wordt onderstreept door plasmamembraanuitsteeksels (Figuur 3C) werden voor elk grenspunt berekend en voor elk tijdsbestek gerapporteerd als kymografen (Figuur 3D,E). Zowel de voor- als de achterkant van de cellen behouden een hogere kromming dan de zijkant van de cellen (Figuur 3D); negatieve gebiedsveranderingen (intrekkingen, blauwe gebieden) zijn duidelijker aan de achterkant van de cellen dan aan de voorrand, waar de positieve gebiedsveranderingen prominenter zijn (uitsteeksels, rode gebieden) (Figuur 3E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg"> Figuur 1: IVM van neutrofielen in de huid van het oor van de muis. (A) Schematische tekening van de opstelling van het oor op de microscooptafel. (B) Experimenteel stroomschema. (C) Representatief beeld van de oorhuid van een mTomato-muis geïnjecteerd met fluorescerend gelabelde neutrofielen, met verschillende projecties. Haarfollikel (HF), Bloedvat (BV), Epidermis (E), Dermis (D), Basaalcellaag (BCL) en Haarartefact (als gevolg van een resthaar aan het huidoppervlak, H). (D) Representatief beeld van de huid van muizen na een steriel laserletsel: blauw kanaal (rechts), groen en rood kanaal (midden), samengevoegd beeld (links). Aan de linkerkant van het beeld is schade zichtbaar door een sterke autofluorescentie-emissie in zowel groene als rode kanalen, evenals een verstoring van de ECM waargenomen door de vorming van een gat in de collageen-I-vezels. In C en D, Groen: neutrofielen; Rood: gastheerweefsel van muizen; Cyaan: Collageen-I SHG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg"> Figuur 2: Time-lapse van mGFP-neutrofielen die migreren in een WT-muisoor. (A) Experimenteel stroomschema. (B) Representatieve stilstaande beelden uit film 3. (C) Volumeweergave van dezelfde cel om de 3D-organisatie van het membraan te visualiseren. Het gebied van hoge membraandynamica wordt geïllustreerd door een pijl (rood voor retractie en blauw voor uitsteeksel). (D) Close-up en gekantelde visualisatie van het weergegeven celvolume. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg"> Figuur 3: Analysepijplijn voor kwantificering van membraandynamica verzameld met behulp van ISMic. (A) Bepaling van de celcontour en herverdeling van grenspunten (100 grenspunten) tussen twee opeenvolgende frames voor mGFP-neutrofielen beschreven in figuur 2B. (B) Gekleurde grenzen vertegenwoordigen de lokale membraankromming die voor elk grenspunt is bepaald. (C) Het lokale gebied verandert tussen twee opeenvolgende frames (huidig: blauw en volgende: rood). De groene gebieden vertegenwoordigen de volgresultaten van de lokale membraanbeweging. Gele pijlen geven de algemene richting van de membraanverplaatsing aan. (D) Grenskromming kymograaf van de cel in de tijd. De verticale as stelt de grenspuntenindices voor, waarbij 1 en 100 de achterkant van de cel vertegenwoordigen, afhankelijk van de migratierichting. (E) Kymograaf die het membraanuitsteeksel (rood) en de membraanretractie (blauw) van de cel in de loop van de tijd weerspiegelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Filmpje 1: Groen gelabelde neutrofielen gevisualiseerd in een mTomato muisoor met behulp van IVM. Rood: mTomato gastheer muizenweefsel. Cyaan: Collageen-I SHG; Groen: neutrofiel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">Klik hier om deze film te downloaden.</a>
Film 2: IVM van neutrofielen die migreren in een mTomato muizenoorhuid. Video's zijn projecties met maximale intensiteit van een beeldstapel die gedurende ͂27 minuten zijn verkregen met een framesnelheid van 5 frames/s. Rood: mTomato gastheer muizenweefsel. Cyaan: Collageen-I SHG; Groen: neutrofiel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">Klik hier om deze film te downloaden.</a>
Filmpje 3: ISMic van membraanremodellering tijdens neutrofielenmigratie in een WT-muizenoor. Video's zijn projecties met maximale intensiteit van een beeldstapel die gedurende ͂8 minuten zijn verkregen met een framesnelheid van 10 frames/s. Rood: mTomato gastheer muizenweefsel. Cyaan: Collageen-I SHG; Groen: mGFP neutrofiel; Lichtgroen: gerenderde neutrofiel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">Klik hier om deze film te downloaden.</a>

De migratie van neutrofielen is gebaseerd op de snelle en continue hermodellering van het plasmamembraan als reactie op chemoattractant en zijn interacties met de extracellulaire micro-omgeving. Hierin wordt een procedure beschreven op basis van intravitale subcellulaire microscopie om de dynamiek van membraanremodellering te onderzoeken bij neutrofielen die in het oor van verdoofde muizen worden geïnjecteerd.

Beeldvorming van neutrofielenmigratie in de huid van muizen om subcellulaire membraanremodellering onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Deze methode beschrijft een techniek om membraanremodellering tijdens neutrofielenmigratie in het levende dier te bestuderen met behulp van intravitale subcellulaire microscopie. Dit protocol biedt een unieke benadering om de membraandynamiek te bestuderen tijdens de migratie van dieren onder fysieke omstandigheden, en om de micro-omgeving van het weefsel te onttrekken. Deze techniek kan op maat worden gemaakt om membraanremodellering en dynamische orgaanherpositionering van het cytoskelet en membraanhandel in verschillende celtypen en migrerende cellen aan te pakken.Voeg om te beginnen de groene fluorescerende kleurstof toe aan de neutrofielensuspensie, gezuiverd van de wildtype muis in 1,5 milliliter BSA-gecoate buis. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zachte agitatie in een buisrotator. Geef drie wasbeurten met HBSS, gevolgd door centrifugeren bij 400 keer G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, en resuspenderen van de pellet in één milliliter Hanks'Balanced Salt Solution.Plaats deze suspensie in de BSA-gecoate buis in een buisrotator onder zachte beweging tot de injectieprocedure. Resuspendeer de celpellet vóór de injectie in een zoutoplossing om een dichtheid van 2 miljoen tot 5 miljoen cellen per 20 microliter te bereiken. Breng het verdoofde dier over naar een verwarmingskussen met 37 graden Celsius om zijn lichaamstemperatuur op peil te houden.Verwijder na het testen van de pootterugtrekkingsreflex de haren uit het oor met een fijne trimmer om de beeldkwaliteit te optimaliseren. Leg het dier op zijn zij, houd de rand van het oor vast en druk het plat langs het verwarmingskussen met behulp van de chirurgische tape, vul vervolgens een spuit uitgerust met een naald van 33 gauge met de neutrofielensuspensie en monteer het op een micromanipulator. Beweeg de naald voorzichtig naar het oor en prik langzaam in de huid.Zodra de naald in de huid zit, duwt u langzaam op de zuiger en levert u twee tot drie microliter celsuspensie. Nadat u de injectie zorgvuldig hebt herhaald voor twee tot drie verschillende delen van het oor, verwijdert u voorzichtig de chirurgische tape en laat u het dier onder toezicht weer bij bewustzijn komen. Laat het dier een uur rusten voordat u beeldvorming maakt, zodat het weefsel en de cellen kunnen herstellen van de injectieprocedure.Zorg ervoor dat de microscoop is ingeschakeld en dat de tafel en lenzen zijn voorverwarmd tot 37 graden Celsius voordat u het verdoofde dier op de microscooptafel plaatst. Dek het gat in het podium af met een glazen dekglaasje. Verplaats het verdoofde dier voorzichtig naar het podium.Als de beeldvorming langer dan een uur duurt, breng dan de oogzalf aan en zet het op gevleugelde infusie gebaseerde perfusiesysteem vast. Plaats een druppel zoutoplossing op het midden van het dekglaasje en plaats het met neutrofielen geïnjecteerde oor erop. Druk het oor voorzichtig plat met een steriel wattenstaafje over het midden van het dekglaasje om luchtbellen te verwijderen.Zet het oor vast door voorzichtig een houten stok tegen de zijkant van het oor dichter bij de kop van het dier te drukken en deze met tape vast te zetten. Zoek vervolgens een interessegebied met behulp van het microscoopoculair en schakel over naar de modus voor het verzamelen van meerdere fotonen. Stel de golflengte van de laserexcitatie in op 900 tot 930 nanometer om gelijktijdige verwerving van groene fluorescerende kleurstof, mTomato en collageen-I mogelijk te maken.Stel vervolgens de juiste set spiegels en filtercombinaties in op de detectoren om het uitgestraalde licht op te vangen. Bepaal de instelling die het meest geschikt is voor de hardwareconfiguratie. Zelfs als migrerende cellen kunnen worden gevolgd met intervallen van 30 seconden tot één minuut, kunnen subcellulaire gebeurtenissen met een hogere snelheid van ten minste minder dan tien seconden worden afgebeeld.Gebruik in de klassieke intravitale microscopiebenadering een 30X-lens en een Galvo-scanner met een beeldgrootte van 512 bij 512 pixels om de celmigratie te volgen en het gastheermuisweefsel te onderzoeken, en stel de verplaatsing van de Z-as in met behulp van de gemotoriseerde tafel met een stapgrootte van twee micrometer om de beeldvorming van een 30 micrometer diep volume elke 30 seconden mogelijk te maken. Gebruik bij de intravitale subcellulaire microscopiebenadering een 40X-lens en een resonantiescanner met driemaal gemiddelde om de zeer dynamische membraanremodellering bij een hogere vergroting en resolutie in beeld te brengen. Stel ook de verplaatsing van de Z-as in met behulp van een piëzo met een stapgrootte van één micrometer, waardoor elke vier tot vijf seconden een beeldvorming van 20 micrometer diep volume mogelijk is.Induceer een steriel laserletsel om de neutrofielenmigratie op gang te brengen door een excitatielaser met hoog vermogen gedurende 10 seconden op een smal gebied van 20 bij 20 micrometer te richten. Identificeer laserletsel door de sterke autofluorescerende signalen die in alle kanalen verschijnen en door de resulterende wijziging van de collageenrangschikking. Bewaar de gegevens aan het einde van het experiment voor verdere analyses.De ontvangende muis maakte het mogelijk om structurele kenmerken in het oorweefsel, zoals bloedvaten, residente cellen en haarzakjes, te visualiseren via een op intravitale microscopie gebaseerde benadering. De door laser geïnduceerde verwondingen waren gemakkelijk te visualiseren vanwege hun sterke autofluorescentie die in alle kanalen werd gedetecteerd en door de veranderingen in de collageenrangschikking. Een volledig beeld van de driedimensionale architectuur van de huid en de lokalisatie van de geïnjecteerde neutrofielen geeft een Z-stapel van de huid weer van de buitenste naar de binnenste lagen IN een driedimensionale volumeweergave.Time-lapse-beeldvorming toonde de neutrofielen die de oorhuid bemonsterden en interageerden met de intracellulaire matrix en het gastheerweefsel. Met behulp van de intravitale subcellulaire microscopie worden dynamische remodellering van het plasmamembraan tijdens de migratie, vorming van membraanuitsteeksels aan de voorrand en het terugtrekken van de achterkant van de cellen duidelijk gevisualiseerd. De time-lapse-sequenties onthullen de complexiteit van de interacties met de intracellulaire matrix.De lokale dynamiek van het plasmamembraan werd geanalyseerd met behulp van een algoritmepijplijn op basis van de identificatie van 100 grenspunten onder het celoppervlak. De veranderingen in de lokale kromming en het gebied dat wordt onderstreept door uitsteeksels van plasmamembranen werden voor elk grenspunt berekend en voor elk tijdsbestek gerapporteerd als kymografen. Zowel de voor- als de achterkant van de cellen behouden een hogere kromming dan de zijkant van de cellen.Veranderingen in het negatieve gebied zijn duidelijker aan de achterkant van de cellen dan aan de voorrand, waar de veranderingen in het positieve gebied prominenter zijn. Na beeldvorming kan weefsel worden verzameld, gefixeerd en verwerkt voor kleuring om het doelwit van interesse verder te evalueren en mechanismen op te helderen. Deze procedure, die is ontworpen om de membraandynamiek in beeld te brengen, kan worden aangepast om een bredere celbiologische vraag te beantwoorden in verschillende celtypen en migrerende cellen in hun respectievelijke omgevingen.

imaging-neutrophil-migration-mouse-skin-to-investigate-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven hier een niet-invasieve twee-foton (2P) microscopie aanpak om te studeren leukocyten homing in de muis voetzool. We bespreken de technische aspecten van onze weefsels beeldvorming voorbereiding en loopt de lezer door een typisch experiment van de eerste set tot en met uitvoering en het verzamelen van gegevens.

Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

This video demonstrates in vivo imaging to study the neutrophil recruitment dynamics at an infection site in an immunocompromised, transgenic mouse with GFP-expressing neutrophils. It involves injecting luminescent bacteria to cause an infection. This leads to neutrophil recruitment to the infection site, whose tracking is done by imaging.

Monitoring Neutrophil Recruitment Dynamics and Bacterial Burden at the Infection Site in a Murine Model

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

Dit huidige protocol maakt gebruik van fluorescente reporters, in vivo labeling en intravitale beeldvormingstechnieken om het dynamische proces van neutrofiel priming in levende dieren te kunnen monitoren.

Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen

Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

Hier presenteren we drie methoden om neutrofiele migratie en infiltratie zowel in vivo als in vitro te beoordelen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.

Detecteren van migratie en infiltratie van neutrofielen bij muizen

Hier beschrijven we protocollen voor het uitvoeren van live beeldvorming en kwantitatieve analyse van chemoattractante receptordynamiek bij...

Live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties

In vivo beeldvorming van de gewrichten is een waardevolle techniek om het migratiegedrag van leukocyten en moleculaire dynamiek binnen de ontstoken gewrichten te ontdekken. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor in vivo beeldvorming van de gewrichten met behulp van een muismodel van type II collageen-geïnduceerde artritis (CIA).

In Vivo Beeldvorming onthult het migratiegedrag van leukocyten binnen de gewrichten

Ontdek intravitale subcellulaire microscopie om membraanremodellering bij neutrofielenmigratie in muizen te bestuderen. Deze methode visualiseert dynamische celmembraanprocessen in levend weefsel.

Beeldvorming van neutrofielenmigratie in de huid van muizen om subcellulaire membraanremodellering onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken (Video) | JoVE Journal

Beeldvorming van neutrofielenmigratie in de huid van muizen om subcellulaire membraanremodellering onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken

Meer video's verkennen