Massagevoelige deeltjestracking om membraangeassocieerde macromolecuuldynamica te karakteriseren

Met massagevoelige deeltjestracking kunnen we individuele biomoleculen observeren die zich verspreiden op lipidemembranen en hun dynamiek in realtime kwantificeren, allemaal volledig labelvrij. Omdat er geen labels nodig zijn, is er geen gevaar voor verstoring van het dynamische gedrag van de biomoleculen. Een ander voordeel van deze methode is de massagevoeligheid, waarmee we membraangebonden oligomere toestanden kunnen bepalen.

Vanwege de veelzijdigheid kunnen we deze methode toepassen op elk membraangeassocieerd systeem. In het bijzonder kan het worden gebruikt om de vorming van ligand-geïnduceerde receptorcomplexen te bestuderen. Begin met het verdelen van een gelijk aantal microscoopglaasjes in PTFE-houders.

Breng de PTFE-houders over in de bekers. Voeg ultrapuur water toe en laat ze 15 minuten bij kamertemperatuur ultradunnen. Gebruik een pincet om de houders over te brengen naar schone bekers en voeg ultrapuur isopropanol toe.

Soniceer opnieuw gedurende 15 minuten, vervang dan opnieuw de isopropanol door ultrapuur water en soniceer het bekerglas met de houders gedurende 15 minuten. Verwijder de houders uit de bekers en föhn de microscoopg in de houder onder een gestage stroom stikstofgas of perslucht. Plaats de gedroogde houder met de grote microscoopglijden in de plasmareiniger en schakel deze in.

Wikkel het platte karton in met aluminiumfolie. Spreid de gereinigde 24 millimeter bij 24 millimeter microscoopglaasjes uit over de aluminiumfolie met voldoende afstand tussen elkaar. Bevestig vervolgens dubbelzijdige tapestroken aan de boven- en onderranden van de dia's.

Snijd elk microscoopglaasje met een scalpel zodat het uit de aluminiumfolie kan worden verwijderd. Elke dia moet strepen dubbelzijdige tape hebben die aan de boven- en onderrand van de dia zijn bevestigd. Bevestig vervolgens de dia met de twee dubbelzijdige tapestrips aan de gehydrofiliseerde dia.

Dit vormt een stromingspad tussen de kleinere en grotere microscoopglaasjes. Verdun de vers geëxtrudeerde kleine unilamellaire blaasjes of SUV's tot een eindconcentratie van 0,4 milligram per milliliter in de vereiste reactiebuffer. Voeg eventueel, om de scheuring van het blaasje te bevorderen, twee millimolair calciumchloride toe aan de suspensie van het blaasje.

Monteer een stroomkamer op de massafotometertrap. Spoel 25 microliter van de blaassuspensie in de stroomkamer en incubeer de kamer gedurende twee minuten en verwijder vervolgens de niet-toegediende blaasjes door de stroomkamer herhaaldelijk te wassen met telkens 200 microliter van de reactiebuffer. Zodra het lipidemembraan vrij is van niet-toegediende blaasjes, voegt u 50 microliter van het betreffende eiwit toe aan de monsterkamer.

Stel vervolgens de beeldvormende voorwaarden in, zoals de grootte van het gezichtsveld, belichtingstijd, framesnelheid en acquisitietijd in de acquisitiesoftware. Pas de scherpstelling automatisch aan. Gebruik indien nodig de zijdelingse controle om het gezichtsveld te verplaatsen naar een positie met een homogeen membraan.

Maak een projectmap en begin met het opnemen van de film. Geef na voltooiing van de opname een bestandsnaam op in het dialoogvenster dat door de acquisitiesoftware wordt gevraagd. De film wordt automatisch opgeslagen in de projectmap als een MP-bestand voor latere analyse.

Als u de opgenomen video's wilt analyseren, start u de Jupyter-notebook-app. Navigeer in de lijst met weergegeven mappen naar de locatie waar de MSPT-analyse plaatsvindt. ipy notebook bestand wordt opgeslagen en klik op het bestand.

In Jupyter-notitieblokken is code georganiseerd in cellen en kan deze stap voor stap worden uitgevoerd. Klik op de kleine afspeelknop naast de cel of selecteer een cel en druk op Shift Enter om de cel uit te voeren. Begin met het importeren van alle vereiste pakketten voor de analyse.

Voer de volgende cel uit om een bestandsprompt te starten. Kies een map met een of meerdere MP-videobestanden die moeten worden geanalyseerd en druk op Map selecteren. Onder de cel wordt een lijst met de gekozen bestanden afgedrukt.

Als u de dominante statische verstrooiing van licht wilt verwijderen met het pixelgewijze achtergrondschattingsalgoritme, kiest u de optie continue mediaan voor de parametermodus en stelt u een geschikte lengte in voor het glijdende mediaanvenster. U kunt de films desgewenst opslaan na verwijdering op de achtergrond door save_processed_movies True in te stellen om ze te gebruiken voor deeltjesdetectie en trajectkoppeling. Zorg ervoor dat u parallelle True en GPU False instelt voor verwerking op de CPU of omgekeerd voor verwerking op een GPU.

Deeltjes en hun respectievelijke positie worden gedurende de film geïdentificeerd en gelokaliseerd. Stem de gevoeligheid van de deeltjesdetectie af met een drempelparameter die wordt gebruikt om de kandidaatvlekken te markeren door middel van afbeeldings binarisatie. Onderzoek het effect van verschillende drempelwaarden op de gevoeligheid van de spotdetectie in een afzonderlijk notitieblok met de naam Filmvisualisatie.

ipy notebook. Nadat u de film in de frameviewer hebt geladen, gebruikt u de drempelschuifregelaar om de deeltjesdetectiedrempel aan te passen en een geschikte instelling te vinden. Terug naar het andere notitieblok, kies drie parameters voor het koppelen van deeltjes in opeenvolgende frames in trajecten met behulp van het Python-pakket trackpy.

Stel de maximale verplaatsing van deeltjes van het ene frame naar het andere in op basis van de maximale verwachte diffusiesnelheid. Selecteer het maximale aantal frames dat een deeltje mag verdwijnen en opnieuw kan verschijnen, maar nog steeds als hetzelfde deeltje wordt beschouwd. Trajecten met te weinig punten kunnen worden verwijderd met behulp van de parameter minimum_trajectory_length voor een robuustere bepaling van de diffusiecoëfficiënten.

Corrigeer alle parameters in de cel door deze uit te voeren. Voer de volgende cel uit om alle geselecteerde video's met de gekozen parameters te analyseren. Voortgangsbalken voor elke verwerkingsstap worden onder de cel weergegeven.

Dit kan even duren, afhankelijk van de videolengte, parameterinstellingen en hardware. In de volgende stap bepaalt de software de diffusiecoëfficiënten voor de trajecten in de vorige sectie, op basis van zowel de sprongafstandverdeling als de gemiddelde vierkante verplaatsingsanalyse. Begin met het opgeven van de film frame_rate en pixel_size.

Los ze op door de cel uit te voeren, voer vervolgens de volgende cel uit en selecteer de bovenliggende map met alle CSV-bestanden die door trackpy zijn gegenereerd. Een lijst met de gevonden CSV-bestanden wordt onder de cel afgedrukt. Kies in de volgende cel een naam voor de HDF5-container waar de resultaten worden opgeslagen en voer deze uit.

Voer ten slotte cel C.4 uit om de diffusieanalyse uit te voeren. Voer in cel C.5 het contrast in met massakalibratielijnparameters, wat betekent dat de helling en offset worden bepaald met behulp van monsters van bekende massa en deze uitvoeren om alle deeltjescontrasten om te zetten in de molecuulmassa. Evalueer de schijnbare deeltjesdichtheid op het membraan door cel C.6 uit te voeren, die de mediane dichtheidswaarde retourneert in termen van gedetecteerde deeltjes en presenteertrajecten tijdens elk frame als extra kolommen in het gegevensframe.

Om de uiteindelijke plot voor de correlatie van massa en diffusiecoëfficiënt te genereren, voert u cel D.1 uit om een bestandsprompt te laden en het HDF5-bestand met de MSPT-resultaten op te geven, selecteert u vervolgens de gegevensset uit een enkele video om in cel D.2 te plotten of combineert u de gegevens uit meerdere video's in één gegevensframe door de cel D.3 uit te voeren. Aangezien in dit voorbeeld alle video's replica's van identieke voorbeelden zijn, wordt de gegevensset samengevoegd. Plot ten slotte de 2D-kerneldichtheid door de cel D.4 uit te voeren.

Als u tevreden bent, geeft u een locatie op om de plot op te slaan in een PDF-bestand in cel D.5 en voert u deze uit. Representatieve afbeeldingen van de oppervlakteruwheid van een glazen afdekplaat tijdens de vorming van een ondersteunde lipide bilayer, met een intacte ondersteunde lipide bilayer, en van voorbeeldige eiwitten gereconstitueerd op een SLB worden hier getoond. Alle vier de voorbeelden worden weergegeven in de native modus, die toegankelijk is tijdens de meting zelf, en als verwerkte ratiometrische afbeeldingen na mediane achtergrondverwijdering.

Een kalibratie die contrast vertaalt in moleculaire massa kan worden bereikt door biomoleculen van bekende massa aan een SLB te hechten via een biotine-streptavidin-biotinecomplex. Als voorbeeldige strategie kan men gebiotinyleerde varianten van runderserumalbumine, eiwit A, alkalische fosfatase en fibronectine gebruiken die binden aan streptavidin dat zelf gebonden is aan biotinebevattende lipiden in het membraan. Het steeds duidelijker contrast van deze voorbeeldige macromoleculen weerspiegelt het toenemende molecuulgewicht van de respectieve gebiotinyleerde normen.

Door elke piek van de contrasthistogrammen toe te wijzen aan de overeenkomstige massa van de oligomeertoestand van het standaardeiwit, wordt een lineair verband tussen contrast en massa onthuld en kan vervolgens worden gebruikt voor de analyse van onbekende macromolecuulsystemen. 2D-kerneldichtheidsschattingen van zowel massa- als diffusiecoëfficiënt van tetravalent streptavidin in complex met gebiotinyleerd aldolase of met een biotine-gemodificeerd geiten-anti-Konijn IgG-antilichaam worden hier getoond. De representatieve afbeeldingen tonen een vergelijking van bepaalde oligomeermassa's voor het complex van tetravalent streptavidin met biotine-gemodificeerd aldolase of IgG en verwachte molecuulgewichten.

Met MSPT kunnen we biomoleculen rechtstreeks op lipidemembranen volgen, bepalen welke massa ze hebben, hoe ze bewegen en hoe ze op elkaar inwerken. Ik ben ervan overtuigd dat deze techniek ons begrip van biologische processen op en met membranen zal transformeren.