Evaluatie van een betrouwbare biomarker in een cecale ligatie en punctie-geïnduceerd muismodel van sepsis
9 december 2022
Dit protocol presenteert de operationele details van cecal ligatie en punctie (CLP) in een muismodel van sepsis. CLP is een van de meest gebruikte technieken om een diermodel van sepsis te maken. Daarom is een gestandaardiseerd CLP-protocol vereist voor het verkrijgen van betrouwbare onderzoeksresultaten.
Het belangrijkste doel van deze studie is om het muismodel van cecale ligatie en punctie-geïnduceerde sepsis te gebruiken om een betrouwbare bloedbiomarker van sepsis te evalueren. Cecale ligatie en punctie, of kortweg CLP, is een klinisch relevant model van sepsis. CLP is een veelgebruikt model in sepsisonderzoek.
Citrullinated histon H3, of CitH3, is afkomstig van sepsis-geïnduceerde NETosis. Onze eerdere studie toont aan dat CitH3 een betrouwbare diagnostische biomarker van sepsis is. Selecteer mannelijke C57BL/6-muizen.
Weeg de muis en verdoof de muis door inademing van 1,5% isofluraan. Bevestig de muis op een verwarmingskussen. Breng ontharingscrème aan op de buik en laat het niet langer dan een minuut staan voordat je de crème en het haar verwijdert.
Bereid steriele chirurgische instrumenten voor die geschikt zijn voor knaagdierchirurgie. Desinfecteer de buikhuid minstens drie keer met jodium. Bedek het operatieve operatiegebied met de juiste steriele chirurgische gordijnen.
Gebruik een steriele chirurgische schaar om een incisie van ongeveer twee centimeter in de buikwand te maken, langs de linea alba. Identificeer en isoleer de blindedarm uit de peritoneale holte met een steriel pincet. Ligate 75 volume van de blindedarm met 4-0 zijdenaad.
Ligate de mesenteriale bloedvaten niet. Opgemerkt moet worden, verschillend percentage van cecum ligated bepaalt de ernst van sepsis. 25% leidt tot een laaggradige sepsis, 50% leidt tot de mid-grade sepsis en 75% leidt tot een hooggradige sepsis.
Doorprik de blindedarm door één door-en-door perforatie met een naald van 21 gauge in het middenpunt tussen het staarteinde en de ligatie. Knijp de uitwerpselen voorzichtig uit de blindedarm door penetratiegaten. Opgemerkt moet worden dat de hoeveelheid uitwerpselen die in de peritoneale holte wordt geperst consistent moet zijn, omdat uitwerpselen ook de ernst van sepsis bepalen.
Vervang de blindedarm en uitwerpselen voorzichtig in de buikholte. Sluit de buikspierlaag en de huidlaag met 6-0 zijdenaad. Desinfecteer de incisie met jodium.
Injectie van ketoprofen, vijf milligram per kilogram, moet worden uitgevoerd op het kwadrant linksonder in de buik om de blindedarm te vermijden. Plaats de muis op een verwarmingskussen tot volledig herstel. De muis is gehuisvest in een temperatuurgecontroleerde ruimte en krijgt gratis toegang tot voedsel en water.
Dieren zullen worden geëuthanaseerd door een overdosis koolstofdioxide met symptomen van sepsis, relevant voor onze vooraf gedefinieerde eindpunten op basis van onze gepresenteerde studie. Muizen worden willekeurig verdeeld in de schijngroep, CLP-groep en de CLP plus Cl-amidine of YW3-56-behandelingsgroep. Muizen in de schijngroep ontvangen alle CLP-procedures, behalve ligatie van de blindedarm en punctie.
Oogst perifeer bloed 24 uur na de operatie en bereid serum door middel van centrifugatie. De CitH3-concentratie werd bepaald door western blotting en een zelf ontwikkelde ELISA-kit. Zoals te zien is in figuur twee, werd er geen CitH3 gedetecteerd in de schijngroep.
CitH3-niveaus waren verhoogd na CLP-insert, die aanzienlijk werd verzwakt door PAD-remming. Op basis van onze gegevens concluderen we dat circulerende CitH3 een betrouwbare diagnostische biomarker van sepsis is.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de operatieve details van cecale ligatie en punctie (CLP) in een muismodel voor sepsis. CLP is een van de meest gebruikte technieken om een diermodel voor sepsis te creëren, wat een gestandaardiseerd protocol vereist voor betrouwbare onderzoeksresultaten.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Sepsisonderzoek
Achtergrond
- Cecumligatie en punctie (CLP) is een klinisch relevant model voor sepsis.
- CLP wordt veelvuldig gebruikt in sepsisonderzoek.
- Betrouwbare biomarkers zijn essentieel voor het diagnosticeren van sepsis.
- Gecitrullineerd histon H3 (CitH3) is gekoppeld aan sepsis-geïnduceerde NETose.
Doel van de studie
- Om betrouwbare bloedbiomarkers voor sepsis te evalueren met behulp van een muismodel.
- Om een gestandaardiseerd CLP-protocol vast te stellen voor consistentie in het onderzoek.
- Om het diagnostische potentieel van CitH3 bij sepsis te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Selectie van mannelijke C57BL/6-muizen voor de studie.
- Inductie van sepsis via cecale ligatie en punctie.
- Beoordeling van bloedbiomarkers na inductie.
- Vergelijking van CitH3-niveaus om de diagnostische betrouwbaarheid te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Demonstratie van CitH3 als een betrouwbare diagnostische biomarker.
- Gestandaardiseerd CLP-protocol dat consistente resultaten oplevert.
- Identificatie van sepsis-geïnduceerde NETosis in het model.
- Validatie van het muismodel voor toekomstig sepsisonderzoek.
Conclusies
- Het CLP-model is effectief voor het bestuderen van sepsis.
- CitH3 dient als een veelbelovende biomarker voor de diagnose van sepsis.
- Gestandaardiseerde protocollen verhogen de betrouwbaarheid van het onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Betrouwbare vroege biomarkers zijn cruciaal voor het verminderen van risico's bij de ontwikkeling van medicijnen tegen sepsis en het mogelijk maken van translationele continuïteit van preklinische modellen naar klinisch onderzoek. Het CLP-geïnduceerde muismodel, in combinatie met kwantitatieve CitH3-meting, biedt een gestandaardiseerd platform voor targetvalidatie en mechanische analyse bij sepsis. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen en de triage van de portfolio op cruciale beslismomenten in de discovery-pipeline.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt rigoureuze hypothesetoetsing van de pathofysiologie van sepsis mogelijk met gebruik van een klinisch relevant diermodel.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door CitH3 te kwantificeren als een mechanistische biomarker van NETosis.
- Faciliteert biologische risicoreductie en prioritering van kandidaat-targets voor verdere ontwikkeling.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een reproduceerbaar systeem voor het evalueren van kandidaat-therapeutica die zich richten op sepsis-mechanismen.
- Standaardiseert de kwantificering van biomarkers via gevalideerde ELISA- en western blot-assays voor CitH3.
- Maakt een betrouwbare vergelijking van interventie-effecten tussen experimentele groepen mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische biomarker-uitlezingen af met klinische diagnostische behoeften voor sepsis.
- Ondersteunt de continuïteit van bevindingen uit diermodellen naar humane translationele biomarkerstrategieën.
- Vermindert het translationele risico door het vaststellen van robuuste, ziekte-relevante eindpunten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze workflow voor modellen en biomarkers slaat een brug tussen vroege ontdekking, lead-identificatie en preklinische validatie in sepsis-onderzoek.
- Discovery Biology: Maakt het testen van mechanistische hypothesen en de verduidelijking van signaalpaden voor sepsis-geïnduceerde NETose mogelijk.
- Screening: Biedt kwantitatieve CitH3-read-outs voor de ontwikkeling van gestandaardiseerde assays en de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert reproduceerbare biomarkermetingen om de effectiviteit van interventies en de ernst van de ziekte te vergelijken.
- Translational Research: Faciliteert de afstemming van preklinische biomarkergegevens met klinische diagnostische strategieën.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar, gestandaardiseerd platform voor lopend sepsisonderzoek en therapeutische evaluatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van sepsis-targets.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen onderzoeksteams en studies.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door vroege, op biomarkers gebaseerde triage mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van sepsis-programma's.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in dierchirurgie, de ontwikkeling van biomarker-assays en kwantitatieve analyse.
- Vereist toegang tot gevalideerde ELISA-kits, infrastructuur voor western blotting en gestandaardiseerde dierfaciliteiten.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams van de CLP-procedurevariabelen en de protocollen voor biomarkermetingen.
- Aanpassing aan andere ziektemodellen of soorten kan protocoloptimalisatie en validatie vereisen.
- Beperkingen omvatten modelvariabiliteit op basis van de chirurgische techniek en de noodzaak van consistente eindpuntcriteria.
