Name: Driedimensionaal, serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer een serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen om acinaire en ductale cellen te differentiëren. Deze methode ondersteunt regeneratief onderzoek naar traanklierherstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (nr. 31871413) en twee programma's van Guangdong Science and Technology (2017B020230002 en 2016B030231001). We zijn de onderzoekers die ons hebben geholpen tijdens het onderzoek en de medewerkers die in het dierencentrum werken echt dankbaar voor hun steun in de dierverzorging.

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
<li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+repair+using+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland repair using progenitor cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).</li>
<li>Buzhor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+approaches%3A+the+hope+for+incurable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.</a> Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PLoS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).</li>
<li>Ackermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+investigation+of+presumptive+murine+lacrimal+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lugli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+1+and+noggin+facilitate+expansion+of+resident+stem+cells+from+non-damaged+gallbladders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders.</a> EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Er zijn gevestigde methoden voor de isolatie en in vitro kweek van traanstamcellen voor traanstamcelkweek en LG-letselherstel. Shatos et al.17 en Ackermannet al. 6 succesvol gekweekte en subculturele traanstamcellen van ratten en muizen door respectievelijk 2D-kweekmethoden, waardoor het mogelijk is om traanstamcellen te transplanteren voor de behandeling van ADDED. Studies op stamcellen18 en mesenchymale stamcellen<sup class="xref"...

Traanklier stamcellen (LGSCs) onderhouden traanklier (LG) celvernieuwing en zijn de bron van acinaire en ductale cellen. Daarom wordt LGSC-transplantatie beschouwd als een alternatieve benadering voor de behandeling van ernstige ontstekingsschade en waterig-deficiënte droge ogenziekte (ADDED)1,2,3. Verschillende kweekmethoden zijn toegepast om LGSC's te verrijken. Tiwari et al. scheidden en kweekten primaire LG-cellen met behulp van collageen I en matrixgel aangevuld met verschillende groeifactoren; de LG-cellen konden echter niet continu worden gekweekt4. Met behulp van tweedimensionale (2D) cultuur werden van LG afgeleide stamcellen van muizen geïsoleerd door You et al.5 en Ackermann et al. 6, gevonden om de stam / voorlopercelmarkergenen, Oct4, Sox2, Nanog en nestin, tot expressie te brengen en kan worden gesubcultureerd. Er zijn echter geen duidelijke aanwijzingen dat deze cellen kunnen differentiëren in acinaire of ductale cellen, en er is geen transplantatie-experiment om het differentiatiepotentieel in vivo te verifiëren.
Onlangs werden c-kit + dim / EpCAM + / Sca1-/ CD34-/CD45-cellen geïsoleerd uit muis-PG's door flowcytometrie, bleken LG-voorlopercelmarkers tot expressie te brengen, zoals Pax6 en Runx1, en gedifferentieerd in kanalen en acini in vitro. Bij muizen met ADDED kan orthotopische injectie met deze cellen beschadigde PG's herstellen en de secretoire functie van PG's2 herstellen. Het aantal stamcellen dat door deze methode werd geïsoleerd, was echter klein en er zijn geen geschikte kweekomstandigheden voor het uitbreiden van de geïsoleerde LGSC's. Samenvattend moet een passend kweeksysteem worden opgezet om volwassen LGSC's effectief te isoleren en te kweken met stabiele en continue uitbreiding voor de studie van LGSC's bij de behandeling van ADDED.
Organoïden afgeleid van stamcellen of pluripotente stamcellen zijn een groep cellen die histologisch vergelijkbaar zijn met de verwante organen en hun eigen vernieuwing kunnen behouden. Nadat de darmorganoïde van de muis in 2009 met succes werd gekweekt door Sato et al.7, werden organoïden uit andere organen achtereenvolgens gekweekt, op basis van het kweeksysteem van Sato, zoals galblaas8, lever9, pancreas10, maag11, borst12, long13, prostaat14 en speekselklier15 . Vanwege het hoge aandeel volwassen stamcellen vóór celdifferentiatie in organoïde cultuur, wordt de driedimensionale (3D) organoïde kweekmethode als optimaal beschouwd voor de isolatie en kweek van volwassen stamcellen van LG.
Een LGSC-kweeksysteem voor volwassen muizen werd in deze studie opgezet door de 3D, serumvrije kweekmethode te optimaliseren. Het is bewezen dat de LGSC's gekweekt uit zowel normale als TOEGEVOEGDE muizen een stabiel vermogen tot zelfvernieuwing en proliferatie vertoonden. Na transplantatie in de ADD-muis-PG's koloniseerden LGSCs de aangetaste PG's en verbeterden ze de traanproductie. Bovendien werden rode fluorescerende LGSC's geïsoleerd uit ROSA26mT/mG-muizen en gekweekt. Dit werk biedt een betrouwbare referentie voor LGSC-verrijking in vitro en LGSC-autograft in klinische toepassing voor TOEGEVOEGDE therapie.

<table><tbody><tr><td>Dier(Muis)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal B/C</td><td>Model Animal Research Center of Nanjing University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>Model Animal Research Center of Nanjing University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>Model Animal Research Center of Nanjing University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytische weegschaal</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatische ontwateraar</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tellkamer voor bloedtelling</td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator met constante temperatuur</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL Gel imaging systeem</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrisch bad voor waterbad</td><td>Yiheng Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforese apparaat</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie kwantitatieve PCR-instrument</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingevroren weefselsnijder</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horizontale centrifuge</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde fluorescentiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser lamellaire scannen micrograaf</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof container</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lage temperatuur hoge snelheid centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ultraviolet spectrofotometer</td><td>Thermo</td><td>meet RNA concentratie</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine snijmachine</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Versterker</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH waarde tester</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C Koelkast</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermostaat cultuur oscillator</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weefsel paraffine inbedding instrument</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-80&deg;C Ultra-lage temperatuur koelkast</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-20&deg;C Ultra-lage temperatuur koelkast</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra zuiver water zuiveringssysteem</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dierexperiment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Natrium</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>Foetale Rundeserum</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Matrix gel)</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Murine Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine Inhibitor (TI)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>Afkomstig van Glycine max; kan trypsine, chymotrypsine en plasminase in mindere mate remmen. Een mg zal 1,0-3,0 mg trypsine remmen.</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>HE kleuring &amp; Immunokleuring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-Muis IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21202</td><td>Gebruikte verdunning: IHC) 2 &mu;g/mL, (IF) 0,2 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-Konijn IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21206</td><td>Gebruikte verdunning: (IHC) 2 &mu;g/mL, (IF) 2 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 donkey anti-Muis IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10037</td><td>Gebruikte verdunning: (IHC) 2 &mu;g/mL, (IF) 2 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 donkey anti-Konijn IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10042</td><td>Gebruikte verdunning: (IHC) 2 &mu;g/mL, (IF) 4 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-AQP5 konijn antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>Gebruikte verdunning: (IHC) 1 &mu;g/mL, (IF) 0,1 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-E-cadherine Rat antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>Gebruikte verdunning: (IF)&nbsp; 5 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Keratin14 konijn antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>Gebruikte verdunning: (IHC) 1 &mu;g/mL, (IF) 2 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 konijn antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Gebruikte verdunning: (IHC) 1 &mu;g/mL, (IF) 1 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-mCherry muis antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>Gebruikte verdunning: (IHC) 2 &mu;g/mL, (IF) 2 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>

driedimensionaal, serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Traanklier (LG) stamcel-gebaseerde therapie is een veelbelovende strategie voor traanklieraandoeningen. Het ontbreken van een betrouwbare, serumvrije kweekmethode om een voldoende aantal LG-stamcellen (LGSC's) te verkrijgen, is echter een obstakel voor verder onderzoek en toepassing. De driedimensionale (3D), serumvrije kweekmethode voor LGSC's voor volwassen muizen is goed ingeburgerd en wordt hier getoond. De LGSC's kunnen continu worden gepasseerd en geïnduceerd om te differentiëren tot acinaire of ductaalachtige cellen.
Voor de LGSC primaire cultuur werden de PG's van 6-8 weken oude muizen verteerd met dispase, collagenase I en trypsine-EDTA. Een totaal van 1 × 104 enkele cellen werden gezaaid in 80 μL matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in elke put van een 24-well plaat, vooraf gecoat met 20 μL matrix gel-LGSCM matrix. Het mengsel werd gestold na incubatie gedurende 20 minuten bij 37 °C en 600 μL LGSCM toegevoegd.
Voor LGSC-onderhoud werden LGSC's die gedurende 7 dagen werden gekweekt, uitgesplitst in afzonderlijke cellen door dispase en trypsine-EDTA. De afzonderlijke cellen werden geïmplanteerd en gekweekt volgens de methode die werd gebruikt in de primaire cultuur van LGSC. LGSC's kunnen meer dan 40 keer worden gepasseerd en continu stam/ voorlopercelmarkers Krt14, Krt5, P63 en nestin uitdrukken. LGSC's gekweekt in LGSCM hebben zelfvernieuwingscapaciteit en kunnen in vitro en in vivo differentiëren in acinaire of ductaalachtige cellen.

3D, serumvrij kweeksysteem opzetten In deze studie werd LGSCM met EGF, Wnt3A, FGF10 en Y-27632 voor muis LGSC's ontwikkeld en werden LGSC's met succes geïsoleerd en gekweekt door een 3D-kweekmethode (figuur 1A). Een succesvol 3D, serumvrij kweeksysteem van LGSC's van C57BL/6 muizen, NOD/ShiLtJ muizen, BALB/c muizen en ROSA26mT/mG muizen is vastgesteld met behulp van deze methode16. Voor een mannelijke muis werden 1,5-2 × 106 c...

De driedimensionale, serumvrije kweekmethode voor volwassen traanklier (LG) stamcellen is goed ingeburgerd voor de inductie van LG organoïde vorming en differentiatie in acinaire of ductaal-achtige cellen.

Driedimensionaal, serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Dit protocol biedt een voordelige strategie voor het verrijken van traanklierstamcellen voor de regeneratie en reconstructie van de traanklier. Traanklierstamcellen vertonen een expansievermogen op lange termijn en het potentieel van differentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kweekmedium voor traanklierstamcellen serumvrij is, wat de enorme waarde voor traanklierherstel aantoont Begin met het verkrijgen van een geëuthanaseerde zes tot acht weken oude BALB / c mannelijke muis en snijd de huid achter het oor om de traanklier en het bindweefsel eromheen bloot te leggen.Pel het bindweefsel af door stompe dissectie met behulp van een pincet en verwijder de traanklier. Dompel de traanklieren gedurende 10 seconden onder in een schaal van zes centimeter met vier milliliter 75% ethanol en spoel onmiddellijk tweemaal met 10-millilar PBS-oplossing. Snijd de traanklieren in kleine fragmenten van ongeveer een millimeter in blokjes.Breng ze over naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter en behandel de weefsels met 500 microliter van 25 eenheden per milliliter dispase en 500 microliter 0,1% collagenase I gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Behandel de tr

three-dimensional-serum-free-culture-system-for-lacrimal-gland-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

De traanklier (LG) is een vertakking orgaan dat de waterige componenten van tranen nodig produceert voor het behoud van de visie en de gezondheid van het oog. Hier beschrijven we muizen LG dissectie en ex vivo cultuur technieken te ontcijferen signaalwegen betrokken bij LG ontwikkeling.

Het manipuleren van de muizen traanklier

Hier rapporteren we een protocol voor het ontwikkelen van een driedimensionaal (3-D) systeem van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), het serumvrije embryoïde lichaam (SFEB) genoemd. Dit 3-D model kan gebruikt worden als een organotypische plakcultuur om menselijke corticale ontwikkeling te modelleren en voor de fysiologische ondervraging van neurale ontwikkelingen.

Ontwikkeling van HiPSC-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-D stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses

Dit protocol introduceert een eenvoudige twee stappen methode voor het differentiëren van hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen xeno- en voorwaarden feeder cel-vrije cultuur. De cel kweekmethoden gepresenteerde inschakelen kostenefficiënte en grootschalige productie van klinische kwaliteit cellen toepassing op hoornvlies cel therapie gebruik.

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft een benadering voor de productie van hepatosferen van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd cultuur systeem en cel zelf montage. Dit protocol is reproduceerbaar in een aantal cellijnen, kostenbesparend en maakt de productie mogelijk van stabiele menselijke hepatosferen voor biomedische toepassing.

Serum vrije productie van driedimensionale menselijke Hepatosferen uit pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft hoe traanklierorganoïden afgeleid van primair muis- en menselijk weefsel kunnen worden vastgesteld, onderhouden, genetisch gemodificeerd, gedifferentieerd, functioneel karakteriseren en transplanteren.

Vestiging, onderhoud, differentiatie, genetische manipulatie en transplantatie van muis en menselijke traanklier organoïden

Hier presenteren we een protocol dat het gebruik van hydrogel demonstreert als een driedimensionaal (3D) celkweekraamwerk voor vet-afgeleide stamcelkweek (ADSC) en de introductie van fotobiomodulatie (PBM) om de proliferatie van ADSC's binnen de 3D-kweekomgeving te verbeteren.

Driedimensionale celkweek van van vet afgeleide stamcellen in een hydrogel met fotobiomodulatie-augmentatie

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om verouderde muistraanklieren te dissociëren om levensvatbare individuele cellen te verkrijgen voor single-cell RNA-sequencing. Sequentiële enzymatische vertering en voorzichtige behandeling behouden de celintegriteit, wat hoogwaardige suspenties oplevert die geschikt zijn voor celtype-specifieke isolatie en transcriptomische analyse van verouderingsgerelateerde veranderingen in traanklierpopulaties.

Protocol voor single-cel dissociatie, RNA-sequencing en isolatie van myoepitheelcellen en fibroblasten uit de verouderde klieren van het klieren van het lakcrimale en speeksel.

Beschrijven we een chip-gebaseerde platform voor de drie-dimensionale kweken van cellen in micro-bioreactoren. Een chip kan maximaal huis tot 10 miljoen. cellen die kunnen worden geteeld onder nauwkeurig omschreven voorwaarden met betrekking tot stroming, zuurstofspanning enz. in een steriele, gesloten circulatie lus.

Chip-op basis van drie-dimensionale Cultuur van de Cel in doorbloed Micro-bioreactoren

Menselijke bloedplaatjes lysaat is een rijke bron van groeifactoren en een krachtig supplement in celcultuur. Dit protocol bevat het proces van het opstellen van een grote pool van de menselijke bloedplaatjes lysaat door uit te gaan van de bloedplaatjes rijk plasma, het uitvoeren van een aantal vries-dooi cycli en uitputting van de bloedplaatjes fragmenten.

Voorbereiding van de gepoolde humane bloedplaatjes Lysate (pHPL) als een efficiënte Supplement voor Animal Serum-Free menselijke stamcellen culturen

Leer een serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen om acinaire en ductale cellen te differentiëren. Deze methode ondersteunt regeneratief onderzoek naar traanklierherstel.

Driedimensionaal, serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen

Meer video's verkennen