Name: Cel-Lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer cel-lineage geleide massaspectrometrie proteomics voor ontwikkelingsbiologie met Xenopus laevis embryo's. Deze methode biedt ruimtelijke en temporele resolutie voor het bestuderen van weefselinductie en cel fate commitment.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Jie Li (University of Maryland, College Park) dankbaar voor waardevolle discussies over embryonale dissociatie en FACS. We danken Vi M. Quach en Camille Lombard-Banek voor hun hulp bij de voorbereiding van monsters en het verzamelen van gegevens in eerdere studies die een voorbeeld zijn van de proteomische toepassingen die in dit protocol worden benadrukt. Delen van dit werk werden ondersteund door de National Science Foundation onder toekenningsnummer IOS-1832968 CAREER (aan P.N.), de National Institutes of Health onder toekenningsnummer R35GM124755 (aan P.N.), de University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (aan P.N.), en COSMOS Club Foundation onderzoeksprijzen (aan A.B.B. en L.R.P.).

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dit protocol maakt de karakterisering van eiwitexpressie in geïdentificeerde cellijnen in embryo's van de Xenopus-soort mogelijk. Voortkomend uit HRMS, combineert de methodologie voortreffelijke specificiteit in moleculaire identificatie, vermogen voor multi-eiwitdetectie zonder moleculaire sondes (meestal honderden tot duizenden verschillende eiwitten) en een vermogen tot kwantificering. Aanpassingsvermogen aan klassieke hulpmiddelen en workflows in cel- en ontwikkelingsbiologie (neuro)biologie breiden HRMS-pro...

Ons begrip van celdifferentiatie en het ontstaan van weefsels en organen is het resultaat van tientallen jaren van uitgebreide gerichte screenings van genen en hun producten. Het vergroten van onze kennis van alle biomoleculen en hun hoeveelheden tijdens belangrijke cellulaire gebeurtenissen zou helpen bij het ontrafelen van moleculaire mechanismen die de ruimtelijke en temporele patronen van het gewervelde lichaamsplan beheersen. Technologieën die moleculaire amplificatie en sequencing mogelijk maken, zijn nu in staat om routinematig te rapporteren over grote aantallen genen en transcripten, ter ondersteuning van hypothesegestuurde studies in fundamenteel biologisch en translationeel onderzoek. Om ontwikkelende systemen te begrijpen, pleit een complexe relatie tussen transcriptie en translatie voor directe analyse van meerdere eiwitten en hun posttranslationele modificaties. Globale proteomics met behulp van in vitro biologische systemen, zoals geïnduceerde pluripotente stamcellen, begonnen mechanismen van weefselinductieaf te bakenen 1,2. In complexe organismen, zoals het gewervelde embryo, is de ontwikkeling afhankelijk van morfogene gradiënten in de context van ruimte en tijd3. Hieruit volgt dat het verkrijgen van kennis van proteomische veranderingen naarmate cellen differentiëren om gespecialiseerde weefsels te vormen, zoals neurale weefsels, een sleutel biedt om moleculaire programma's te ontgrendelen die de normale en defecte ontwikkeling beheersen en therapieën van de volgende generatie begeleiden.
De gewervelde Zuid-Afrikaanse klauwkikker (Xenopus laevis) is een beproefd model in de cel- en ontwikkelings-, neuro- en regeneratieve biologie. Sir John Gurdon's 2012 Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde 4,5 voor de ontdekking van pluripotentie van de somatische kern benadrukte het belang van dit model voor ontdekkingen in fundamentele en translationele studies. Xenopus-embryo's ontwikkelen zich extern voor de moeder, waardoor directe manipulatie van cellen, celklonen en genexpressie over verschillende stadia van ontwikkeling mogelijk wordt. Asymmetrische pigmentatie en stereotiepe celdelingen maakten het mogelijk om reproduceerbare lotkaarten van het 16-6 en 32-cel 7,8 stadium embryo in kaart te brengen. Voor op hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) gebaseerde proteomics zijn bijkomende voordelen van het model een relatief grote omvang (~ 1 mm in diameter), die een overvloedig eiwitgehalte oplevert voor analyse (~ 130 μg in embryo's in het vroege splitsingsstadium, ~ 10 μg eiwitgehalte in enkele cellen van het 16-celembryo)9,10.
Op dit moment is HRMS de toonaangevende technologie bij uitstek voor het detecteren van eiwitten. Deze technologie maakt directe, gevoelige en specifieke detectie en kwantificering van meerdere, meestal honderden tot duizenden verschillende eiwittenmogelijk 11. Bottom-up proteomics door HRMS omvat een reeks onderling verbonden stappen. Na extractie uit het cel/weefselmonster worden eiwitten verteerd met een proteolytisch enzym, zoals trypsine (bottom-up proteomics). De resulterende peptiden worden gescheiden op basis van hun verschillende fysisch-chemische eigenschappen, waaronder hydrofobiciteit (reversed-phase vloeistofchromatografie, LC), nettolading (ionenwisselingschromatografie), grootte (grootte-uitsluitingschromatografie) of elektroforetische mobiliteit (capillaire elektroforese, CE). Peptiden worden vervolgens geladen (geïoniseerd), meestal met behulp van elektrospray-ionisatie (ESI), en peptide-ionen worden gedetecteerd en gesequenced via gasfasefragmentatie door tandem HRMS. De resulterende peptidegegevens worden toegewezen aan het proteoom van het organisme dat wordt bestudeerd. Met eiwitspecifieke (proteotypische) peptide-ionsignaalintensiteit die correleert met concentratie, kan eiwitkwantificering labelvrij of labelgebaseerd (multiplexingkwantificering) worden uitgevoerd. HRMS-proteomics levert een rijke bron van informatie op over de moleculaire toestand van het bestudeerde systeem, waardoor hypothesen kunnen worden gegenereerd en functionele vervolgstudies kunnen worden uitgevoerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Figuur 1: Spatiotemporaal schaalbare proteomics die cel-afstamming geleide HRMS proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo mogelijk maken. (A) Visualisatie van het monster (1) met behulp van een stereomicroscoop (2) voor injectie van een geïdentificeerde cel (inzet), met behulp van een gefabriceerde micropipette (3) onder controle door een translatiestadium (4). B) Subcellulaire bemonstering van de geïdentificeerde linker D11-cel in een embryo met 16 cellen. (C) Dissectie van een hele D11-cel uit een embryo van 16 cellen. (D) Fluorescerende (groene) tracering van de linker en rechter D111 nakomelingen van een 32-celig embryo om dissectie van het neurale ectoderm (NE) in de gastrula (stadium 10) en isolatie van het afstammelingsweefsel van het kikkervisje met behulp van FACS te begeleiden. Schaalstaven: 200 μm voor embryo's, 1,25 mm voor de injectieflacon. De cijfers werden met toestemming aangepast van referenties 15,19,21,59. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het hier gepresenteerde protocol maakt hrms-gebaseerde kwantificering mogelijk van grote aantallen eiwitten in geïdentificeerde cellen / weefsels bij het ontwikkelen van X. laevis-embryo's. De aanpak bouwt voort op nauwkeurige celidentificatie, reproduceerbare cellotkaarten en gevestigde methodologieën om cellijnen te volgen in dit biologische model 6,7,8. Zoals te zien is in figuur 1, bestuderen we proteomen van afzonderlijke cellen door gebruik te maken van hele-celdissectie of capillaire microsampling om cellulaire inhoud te aspirateren. Het monitoren van de afstamming van een cel stelt ons in staat om de spatiotemporale evolutie van het proteoom te bestuderen als cellen weefsels vormen tijdens gastrulatie. Het celprogenaat wordt fluorescerend gemarkeerd door het injecteren van een fluorofoor geconjugeerd aan inert dextran of mRNA voor fluorescerend eiwit (bijv. Groen fluorescerend eiwit of GFP). Het gelabelde nageslacht wordt geïsoleerd op de gewenste ontwikkelingstijdstippen. Tijdens gastrulatie kunnen celklonen die strak geclusterd zijn, worden geïsoleerd door dissectie. Na gastrulatie kunnen celklonen in het embryo worden verspreid als gevolg van migratiebewegingen en kunnen ze worden geïsoleerd uit gedissocieerde weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Eiwitten in deze cellen en weefsels worden gemeten via bottom-up proteomics met HPLC of CE voor scheiding en ESI tandem HRMS voor identificatie. Cel-lineage-geleide HRMS proteomics is schaalbaar naar verschillende celgroottes en afstammingslijnen binnen het embryo en is specifiek, gevoelig en kwantitatief. Aan de hand van geselecteerde voorbeelden die hier worden getoond, laten we ook zien dat dit protocol schaalbaar en breed aanpasbaar is aan verschillende soorten cellen en cellijnen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Figuur 2: De bioanalytische workflow. Microdissectie en capillaire aspiratie, of FACS, vergemakkelijkten de bemonstering van cellulair en klonaal eiwitgehalte. Uitputting van overvloedige dooiereiwitten en scheiding door capillaire elektroforese (CE) of nano-flow vloeistofchromatografie (LC) verbeterde identificatie (ID) gevoeligheid met behulp van elektrospray ionisatie (ESI) hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS). Kwantificering onthulde ontregeling en leverde nieuwe informatie op voor hypothese-gedreven studies in combinatie met informatie die beschikbaar was via genontologie (GO). De cijfers zijn met toestemming aangepast aan referentie15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0492</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Column</td><td>Thermo Scientific</td><td>164941</td><td></td></tr><tr><td>Analytical microbalance</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XSE105DU</td><td></td></tr><tr><td>Automatic peptide fractionation platform</td><td>Agilent</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Capillaries</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Capillaries (for making Emmitters)</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>C18 spin columns (for desalting)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Camera ro monitor electrospray</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>EO-2018C</td><td></td></tr><tr><td>Combretastatin A4</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7744</td><td></td></tr><tr><td>Commercial CESI system</td><td>AB SCIEX</td><td>CESI</td><td></td></tr><tr><td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td><td>VWR</td><td>97061-492</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Millipore Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D22910</td><td></td></tr><tr><td>Diothiothreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62786AP</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence light source</td><td>Lumencore</td><td>AURA III</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBing microcentrifuge&nbsp; tubes: protein</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-20 &deg;C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>97-926-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-80 &deg;C)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSX40086A</td><td></td></tr><tr><td>Fused silica capillary</td><td>Molex</td><td>1088150596</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td>Benchmark</td><td>BSH300</td><td></td></tr><tr><td>High pressure liquid Chromatography System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem</td><td></td></tr><tr><td>High voltage power supply</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td></td></tr><tr><td>High-resolution Mass Spectrometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td><td></td></tr><tr><td>HPLC caps</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-40A</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Vials</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-11</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator e.g. Goosenecks</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC122275000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillary puller</td><td>Suttor Instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Micropippette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MS data analysis software, commercial</td><td>ProteomeDiscoverer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS data analysis software, opensource</td><td>MaxQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>non-idet 40 substitute</td><td>Millipore Sigma</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 10 &micro;L bed Zip-tips (for desalting)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>Pierce bicinchoninic acid protein assay kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce quantitative colorimetric peptide assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Trypsin Protease (MS Grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI90058</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind vials</td><td>Eppendorf</td><td>0030108434 , 0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>PR505755R/3721</td><td></td></tr><tr><td>sodium isethionate</td><td>Millipore Sigma</td><td>220078</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyrophosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221368-100G</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel BGE vial</td><td>Custom-Built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel sample vials</td><td>Custom-Built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope (objective 10x)</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1270, SZX18</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>97063-790</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pumps (2)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Syringes (gas-tight): 500&ndash;1000 &micro;L</td><td>Hamilton</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Trap Column</td><td>Thermo Scientific</td><td>164750</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M solution)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ22638AP</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&ndash;10 &deg;C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>XYZ translation stage</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZ translation stage</td><td>Custom-Built</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cel-lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Karakterisering van moleculaire gebeurtenissen als cellen aanleiding geven tot weefsels en organen verhoogt een potentieel om de normale ontwikkeling beter te begrijpen en efficiënte remedies voor ziekten te ontwerpen. Technologieën die een nauwkeurige identificatie en kwantificering van verschillende soorten en grote aantallen eiwitten mogelijk maken, zouden nog steeds ontbrekende informatie opleveren over moleculaire mechanismen die de ontwikkeling van weefsels en organismen in ruimte en tijd orkestreren. Hier presenteren we een op massaspectrometrie gebaseerd protocol dat de meting van duizenden eiwitten in geïdentificeerde cellijnen in Xenopus laevis (kikker) embryo's mogelijk maakt. De aanpak bouwt voort op reproduceerbare cel-lotkaarten en gevestigde methoden om cellen en hun nakomelingen (klonen) te identificeren, fluorescerend te labelen, te volgen en te bemonsteren vanuit dit model van gewervelde ontwikkeling. Na het verzamelen van cellulaire inhoud met behulp van microsampling of het isoleren van cellen door dissectie of fluorescentie-geactiveerde celsortering, worden eiwitten geëxtraheerd en verwerkt voor bottom-up proteomische analyse. Vloeistofchromatografie en capillaire elektroforese worden gebruikt om schaalbare scheiding te bieden voor eiwitdetectie en kwantificering met hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS). Representatieve voorbeelden worden gegeven voor de proteomische karakterisering van neurale weefselvette cellen. Cel-lineage-geleide HRMS proteomics is aanpasbaar aan verschillende weefsels en organismen. Het is voldoende gevoelig, specifiek en kwantitatief om in de spatio-temporele dynamiek van het proteoom te kijken tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren.

Dit protocol maakte de studie van eiwitten in afzonderlijke cellen en hun afstamming mogelijk terwijl ze weefsels in X. laevis-embryo's vaststellen. Figuur 1 illustreert een dergelijke toepassing van de benadering om eiwitten in neurale weefsel-vette cellen en het nieuw geïnduceerde neurale ectoderm in het embryo te bestuderen. Zoals te zien is in figuur 1A, integreerde de bioanalytische workflow traditionele hulpmiddelen van cel- en ontwikkelingsbiolog...

Hier beschrijven we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische karakterisering van cellijnen met bekende weefsellotgevallen in het gewervelde Xenopus laevis-embryo .

Cel-Lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Deze afstammingsgeleide benadering maakt proteomische analyse van belangrijke ontwikkelingsgebeurtenissen met ruimtelijke en temporele resolutie binnen het gewervelde embryo mogelijk, waardoor informatie wordt verstrekt die niet toegankelijk zou zijn via metingen van het hele embryo. Deze aanpak kan gemakkelijk worden uitgebreid om eiwitten, metabolieten en transcripties van verschillende embryonale cellen te bestuderen terwijl ze differentiëren tijdens de ontwikkeling. Deze methode kan ons begrip van moleculaire mechanismen die de normale en ziekteontwikkeling beheersen, bevorderen, inclusief mechanismen van weefselinductie en cellotbetrokkenheid tijdens de vroege ontwikkeling.Gebruik een haarlus om elk embryo in een put te leiden en plaats ze voorzichtig zo dat de beoogde cel van belang zich in de juiste hoek ten opzichte van de micronaald bevindt. Volg de xenopus laevis weefsel lot kaarten om de voorlopercel van de afstamming van belang te identificeren. Gebruik twee slijptangen om voorzichtig het vitellinemembraan rond het embryo te verwijderen.Isoleer de afzonderlijke cellen uit het embryo door handmatige dissectie met behulp van een tang. Begin met het instellen van de injectienaald met de lineage tracer-oplossing. Monteer de micro-injectienaald in een micropipethouder die wordt bestuurd door een meerassige micromanipulator.Sluit de micropipethouder aan op een micro-injector en vul de naald met de lineage tracer door negatieve druk uit te oefenen. Kalibreer de naald en pas de grootte van de naaldpunt en de injectietijd aan om ongeveer één nanoliter van de afstammingstraceroplossing te leveren, gemeten in minerale olie. Zorg ervoor dat de druppelgrootte die wordt geïnjecteerd nauwkeurig is en pas indien nodig de instellingen van de injector aan.Overspoel de micro-injectie kleischaal met een 3%fCAL oplossing en breng ongeveer 10 embryo's over naar de kleischaal met behulp van een transferpipet. Injecteer de cellen van belang met ongeveer een nanoliter van het fluorescerende dextran of 200 picogram GFP-mRNA. Bevestig met behulp van een stereomicroscoop het succes van cellabeling.Zorg ervoor dat alleen de beoogde cel wordt geïnjecteerd. Gooi embryo's weg die gewonde of onjuist gelabelde cellen bevatten volgens institutioneel beleid. Breng de geïnjecteerde embryo's over in een petrischaaltje met 0,5x Steinberg-oplossing.Kweek ze tussen 14 en 25 graden Celsius totdat ze het gewenste ontwikkelingsstadium bereiken. Breng drie tot vijf embryo's over in een agarschaal met 0,2x Steinberg-oplossing voor microdissecties. Gebruik een tang om de gelabelde kloon van het embryo te ontleden.Verzamel het ontleedde weefsel met een pipet van 0,5 tot 10 microliter en deponeer ze in een microcentrifugevijl. Zuig met behulp van een pipet de media rond het verzamelde weefsel op om zouten in het monster te beperken om interferentie met HRMS-analyse te voorkomen. Bevries de geïsoleerde cellen onmiddellijk door de injectieflacon met het monster op droogijs of vloeibare stikstof te plaatsen.Bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius tot massaspectrometrie-analyse. Voor eencellige monsterverwerking door CE, denatureer de eiwitten door het monster gedurende ongeveer 15 minuten te verwarmen tot 60 graden Celsius. Breng het monster vervolgens gedurende vijf minuten in evenwicht met kamertemperatuur en voeg trypsine toe aan de monsters voor vertering.Voor analyse door NanoLC, lyse tot vijf ontlede weefsels in 50 microliter lysisbuffer. Faciliteer het proces door het monster op en neer te pipetteren. Om de ontleedde weefsels te verwerken, incubeer je het lysaat gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Pellet vervolgens de celresten en dooierplaatjes bij vier graden Celsius door centrificatie bij 4.500 RCF. Breng het supernatant over in een schone injectieflacon met microcentrifuges en voeg 10% SDS toe om een eindconcentratie van 1% SDS in het lysaat te verkrijgen. Voeg voor weefsels 0,5 molair dithiothreitol toe aan het lysaat om een eindconcentratie van ongeveer 25 millimolair te verkrijgen.Incubeer het lysaat vervolgens gedurende 30 minuten bij 60 graden Celsius om disulfidebindingen in eiwitten chemisch te verminderen. Voeg 0,5 molair jodoacetamide toe om de uiteindelijke concentratie van ongeveer 75 millimolair in het lysaat te verkrijgen en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg 0,5 molaire dithiothreitol toe hetzelfde als het oorspronkelijke volume om de reactanten die overblijven van de alkyleringsreactie te doven.Precipiteer eiwitten in aceton 's nachts zoals beschreven in het tekstprotocol en reconstitueer in 0,5 molair ammoniumbicarbonaat. Voeg trypsine toe voor monstervertering en incubeer de injectieflacons bij 37 graden Celsius. Om de peptiden te scheiden met behulp van CE, reconstitueert u het eiwit dat is verteerd in één tot twee microliter van het monsteroplosmiddel.Vortex het gemengde monster en centrifusie bij 10.000 RCF gedurende twee minuten bij vier graden Celsius tot pelletcelresten. Initialiseer het CE-ESI-instrument door het CE-capillair te spoelen met de BGE. Plaats één microliter monster in de injectieflacon van het monster en injecteer één tot 10 nanoliter van het monster in het CE-scheidingscapillair door hydrodynamische injectie.Breng het inlaatuiteinde van het CE-scheidingscapillair over in de BGE. Start elektroforetische scheiding door de CE-scheidingsspanning geleidelijk op te voeren vanaf de aarde. Potentialen van 20 tot 28 kilovolt met een stroom van minder dan 10 microampère zorgen voor stabiele en reproduceerbare instrumentele prestaties voor analyse.Om te scheiden met behulp van Nano LC, suspensie van het peptidemonster opnieuw in mobiele fase A.De concentratie en het injectievolume van het monster zijn afhankelijk van het beschikbare LC-systeem en de beschikbare kolom. Breng het monster over in een LC-injectieflacon. Laad ongeveer 200 nanogram tot twee microgram peptidemonster in de C18-analytische kolom en scheid de peptiden met een stroomsnelheid van 300 nanoliter per minuut met behulp van gradiënge-elutie zoals beschreven in het tekstmanuscript.Controleer met behulp van een camera de vloeistofstroom door de elektrospray-emitter en inspecteer de opstelling visueel op mogelijke lekken. Verkrijg massaspectrometriegebeurtenissen en sequentieer de peptiden zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gentranslationele verschillen werden gedetecteerd tussen D11-cellen ontleed uit verschillende embryo's met behulp van CE-ESI-HRMS.Lineage-gelabelde ontlede celklonen werden geanalyseerd door LC-HRMS. Pathway-analyse van eiwitten toonde upregulated eiwittranslatie en energiemetabolisme in de Spemann's organizer met het neuro-ectoderm. Het neuro-ectoderm prodeum was verrijkt met eiwitten geassocieerd met nucleair transport van eiwitlading in de cel, wat waarschijnlijk wijst op stroomafwaartse gebeurtenissen na signalering.De verrijkingsanalyse van moleculaire functies wees op upregulatie in translatie-initiatie, RNA-binding en binding van het proteasoomcomplex, wat een rol suggereert voor dynamische eiwitvernieuwing die de organisator van Spemann ontwikkelt. Selecteer alleen stereotiepe embryo's voor dit protocol om de reproduceerbaarheid en resultaatinterpretatie te verbeteren. Ontleed weefsel moet worden overgebracht in een injectieflacon en onmiddellijk worden ingevroren met zo min mogelijk mediabuffer om besmetting door bufferzouten te minimaliseren.Deze benadering heeft ons in staat gesteld om eiwitdynamica te bestuderen in geïdentificeerde cellen en cellijnen in levende embryo's. De nieuwe informatie die we hebben verkregen over de ruimtelijke temporele productie van belangrijke eiwitten in ontwikkelende weefsels heeft ons in staat gesteld om gerichte experimenten te ontwerpen om hun biologische functie te beoordelen.

cell-lineage-guided-mass-spectrometry-proteomics-developing-frog

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Het lot van een individuele embryonale cel kan worden beïnvloed door erfelijke moleculen en / of signalen van naburige cellen. Gebruik te maken van het lot kaarten van de splitsing podium Xenopus embryo, kan enkel blastomeren worden geïdentificeerd voor cultuur in isolatie om de bijdragen van erfelijke moleculen te beoordelen ten opzichte van cel-cel interacties.

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

De vraag hoe chromatine toezichthouders en chromatine staten van invloed op het genoom in vivo is de sleutel tot ons begrip van hoe vroeg lot van de cel beslissingen worden genomen in het zich ontwikkelende embryo. ChIP-Seq-de meest populaire benadering van chromatine functies onderzoeken op mondiaal niveau wordt hier geschetst voor Xenopus embryo.

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

We worden stappen beschreven waarmee snel in situ bemonstering van een klein gedeelte van een afzonderlijke cel met hoge precisie en minimale invasie met behulp van capillaire gebaseerde micro-sampling, ter vergemakkelijking van chemische karakterisering van een momentopname van de metabole activiteit in levende embryo's met behulp van een custom-built eencellige capillaire elektroforese en massaspectrometrie platform.

Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Zebravis gericht op reactieve elektrofielen en oxidanten (Z-REX) is een op chemische biologie gebaseerde methode voor het onderzoek van reactieve signalering van kleine moleculen. Deze techniek kan worden toegepast op levende vissen van verschillende ontwikkelingsstadia. Hier koppelen we standaardtests in zebravissen aan Z-REX voor signaalrouteanalyse.

Monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - Z-REX ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten

Hier wordt een effectief protocol voor snelle bloedperfusie gepresenteerd om weefselmonsters van Afrikaanse klauwkikkers voor te bereiden voor transcriptomics- en proteomics-studies.

Effectieve snelle bloedperfusie bij xenopus

Leer cel-lineage geleide massaspectrometrie proteomics voor ontwikkelingsbiologie met Xenopus laevis embryo's. Deze methode biedt ruimtelijke en temporele resolutie voor het bestuderen van weefselinductie en cel fate commitment.

Cel-Lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo

Meer video's verkennen