Cel-Lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo

Deze afstammingsgeleide benadering maakt proteomische analyse van belangrijke ontwikkelingsgebeurtenissen met ruimtelijke en temporele resolutie binnen het gewervelde embryo mogelijk, waardoor informatie wordt verstrekt die niet toegankelijk zou zijn via metingen van het hele embryo. Deze aanpak kan gemakkelijk worden uitgebreid om eiwitten, metabolieten en transcripties van verschillende embryonale cellen te bestuderen terwijl ze differentiëren tijdens de ontwikkeling. Deze methode kan ons begrip van moleculaire mechanismen die de normale en ziekteontwikkeling beheersen, bevorderen, inclusief mechanismen van weefselinductie en cellotbetrokkenheid tijdens de vroege ontwikkeling.

Gebruik een haarlus om elk embryo in een put te leiden en plaats ze voorzichtig zo dat de beoogde cel van belang zich in de juiste hoek ten opzichte van de micronaald bevindt. Volg de xenopus laevis weefsel lot kaarten om de voorlopercel van de afstamming van belang te identificeren. Gebruik twee slijptangen om voorzichtig het vitellinemembraan rond het embryo te verwijderen.

Isoleer de afzonderlijke cellen uit het embryo door handmatige dissectie met behulp van een tang. Begin met het instellen van de injectienaald met de lineage tracer-oplossing. Monteer de micro-injectienaald in een micropipethouder die wordt bestuurd door een meerassige micromanipulator.

Sluit de micropipethouder aan op een micro-injector en vul de naald met de lineage tracer door negatieve druk uit te oefenen. Kalibreer de naald en pas de grootte van de naaldpunt en de injectietijd aan om ongeveer één nanoliter van de afstammingstraceroplossing te leveren, gemeten in minerale olie. Zorg ervoor dat de druppelgrootte die wordt geïnjecteerd nauwkeurig is en pas indien nodig de instellingen van de injector aan.

Overspoel de micro-injectie kleischaal met een 3%fCAL oplossing en breng ongeveer 10 embryo's over naar de kleischaal met behulp van een transferpipet. Injecteer de cellen van belang met ongeveer een nanoliter van het fluorescerende dextran of 200 picogram GFP-mRNA. Bevestig met behulp van een stereomicroscoop het succes van cellabeling.

Zorg ervoor dat alleen de beoogde cel wordt geïnjecteerd. Gooi embryo's weg die gewonde of onjuist gelabelde cellen bevatten volgens institutioneel beleid. Breng de geïnjecteerde embryo's over in een petrischaaltje met 0,5x Steinberg-oplossing.

Kweek ze tussen 14 en 25 graden Celsius totdat ze het gewenste ontwikkelingsstadium bereiken. Breng drie tot vijf embryo's over in een agarschaal met 0,2x Steinberg-oplossing voor microdissecties. Gebruik een tang om de gelabelde kloon van het embryo te ontleden.

Verzamel het ontleedde weefsel met een pipet van 0,5 tot 10 microliter en deponeer ze in een microcentrifugevijl. Zuig met behulp van een pipet de media rond het verzamelde weefsel op om zouten in het monster te beperken om interferentie met HRMS-analyse te voorkomen. Bevries de geïsoleerde cellen onmiddellijk door de injectieflacon met het monster op droogijs of vloeibare stikstof te plaatsen.

Bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius tot massaspectrometrie-analyse. Voor eencellige monsterverwerking door CE, denatureer de eiwitten door het monster gedurende ongeveer 15 minuten te verwarmen tot 60 graden Celsius. Breng het monster vervolgens gedurende vijf minuten in evenwicht met kamertemperatuur en voeg trypsine toe aan de monsters voor vertering.

Voor analyse door NanoLC, lyse tot vijf ontlede weefsels in 50 microliter lysisbuffer. Faciliteer het proces door het monster op en neer te pipetteren. Om de ontleedde weefsels te verwerken, incubeer je het lysaat gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Pellet vervolgens de celresten en dooierplaatjes bij vier graden Celsius door centrificatie bij 4.500 RCF. Breng het supernatant over in een schone injectieflacon met microcentrifuges en voeg 10% SDS toe om een eindconcentratie van 1% SDS in het lysaat te verkrijgen. Voeg voor weefsels 0,5 molair dithiothreitol toe aan het lysaat om een eindconcentratie van ongeveer 25 millimolair te verkrijgen.

Incubeer het lysaat vervolgens gedurende 30 minuten bij 60 graden Celsius om disulfidebindingen in eiwitten chemisch te verminderen. Voeg 0,5 molair jodoacetamide toe om de uiteindelijke concentratie van ongeveer 75 millimolair in het lysaat te verkrijgen en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg 0,5 molaire dithiothreitol toe hetzelfde als het oorspronkelijke volume om de reactanten die overblijven van de alkyleringsreactie te doven.

Precipiteer eiwitten in aceton 's nachts zoals beschreven in het tekstprotocol en reconstitueer in 0,5 molair ammoniumbicarbonaat. Voeg trypsine toe voor monstervertering en incubeer de injectieflacons bij 37 graden Celsius. Om de peptiden te scheiden met behulp van CE, reconstitueert u het eiwit dat is verteerd in één tot twee microliter van het monsteroplosmiddel.

Vortex het gemengde monster en centrifusie bij 10.000 RCF gedurende twee minuten bij vier graden Celsius tot pelletcelresten. Initialiseer het CE-ESI-instrument door het CE-capillair te spoelen met de BGE. Plaats één microliter monster in de injectieflacon van het monster en injecteer één tot 10 nanoliter van het monster in het CE-scheidingscapillair door hydrodynamische injectie.

Breng het inlaatuiteinde van het CE-scheidingscapillair over in de BGE. Start elektroforetische scheiding door de CE-scheidingsspanning geleidelijk op te voeren vanaf de aarde. Potentialen van 20 tot 28 kilovolt met een stroom van minder dan 10 microampère zorgen voor stabiele en reproduceerbare instrumentele prestaties voor analyse.

Om te scheiden met behulp van Nano LC, suspensie van het peptidemonster opnieuw in mobiele fase A.De concentratie en het injectievolume van het monster zijn afhankelijk van het beschikbare LC-systeem en de beschikbare kolom. Breng het monster over in een LC-injectieflacon. Laad ongeveer 200 nanogram tot twee microgram peptidemonster in de C18-analytische kolom en scheid de peptiden met een stroomsnelheid van 300 nanoliter per minuut met behulp van gradiënge-elutie zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Controleer met behulp van een camera de vloeistofstroom door de elektrospray-emitter en inspecteer de opstelling visueel op mogelijke lekken. Verkrijg massaspectrometriegebeurtenissen en sequentieer de peptiden zoals beschreven in het tekstmanuscript. Gentranslationele verschillen werden gedetecteerd tussen D11-cellen ontleed uit verschillende embryo's met behulp van CE-ESI-HRMS.

Lineage-gelabelde ontlede celklonen werden geanalyseerd door LC-HRMS. Pathway-analyse van eiwitten toonde upregulated eiwittranslatie en energiemetabolisme in de Spemann's organizer met het neuro-ectoderm. Het neuro-ectoderm prodeum was verrijkt met eiwitten geassocieerd met nucleair transport van eiwitlading in de cel, wat waarschijnlijk wijst op stroomafwaartse gebeurtenissen na signalering.

De verrijkingsanalyse van moleculaire functies wees op upregulatie in translatie-initiatie, RNA-binding en binding van het proteasoomcomplex, wat een rol suggereert voor dynamische eiwitvernieuwing die de organisator van Spemann ontwikkelt. Selecteer alleen stereotiepe embryo's voor dit protocol om de reproduceerbaarheid en resultaatinterpretatie te verbeteren. Ontleed weefsel moet worden overgebracht in een injectieflacon en onmiddellijk worden ingevroren met zo min mogelijk mediabuffer om besmetting door bufferzouten te minimaliseren.

Deze benadering heeft ons in staat gesteld om eiwitdynamica te bestuderen in geïdentificeerde cellen en cellijnen in levende embryo's. De nieuwe informatie die we hebben verkregen over de ruimtelijke temporele productie van belangrijke eiwitten in ontwikkelende weefsels heeft ons in staat gesteld om gerichte experimenten te ontwerpen om hun biologische functie te beoordelen.