Dosisopname van op platina en ruthenium gebaseerde samengestelde blootstelling bij zebravissen door inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie met bredere toepassingen

Zebravissen zijn een aantrekkelijk model, maar wetenschappers weten niet hoeveel het organisme opneemt met watergedragen dosering. We ontwikkelden een techniek om weefsel na blootstelling te verteren en metalen te kwantificeren via ICPMS. Deze techniek stelt ons in staat om de dosisrespons nauwkeurig te kwantificeren en te valideren met behulp van ICPMS.

Deze methode heeft veel potentie. Farmacologische of milieutechnische metaalblootstellingen kunnen worden toegepast vanaf cellulair niveau tot aan hele orgaansystemen in diermodellen. Voeg ongeveer 0,25 milliliter zeer zuiver salpeterzuur toe aan de 15 milliliter polypropyleen centrifugebuizen voor maximaal 10 larven.

Ultrasoon gedurende een uur om de monsters voor te verteren. Voer voor ultrasone trillingen korte cycli van weefselvertering uit met intervallen van vijf minuten in een zuurveilige microgolfvergister totdat al het weefsel zichtbaar is geoxideerd, waardoor een uniforme, heldere gele oplossing ontstaat. Controleer de integriteit van de buizen zorgvuldig om breuk te voorkomen en voer korte spins uit in de centrifuge tussen cycli.

Zodra het weefsel zichtbaar is geoxideerd, verdunt u de monsters in een zuurkast tot 3,5% salpeterzuur met behulp van 6,75 milliliter zeer zuiver water en vortex om grondig te mengen. Vervolgens om een matrix-gematchte, 7-punts kalibratiecurve uit te voeren om rekening te houden met mogelijke isobare interferenties. Gebruik een voorraadconcentratie van de waterige gecertificeerde elementaire standaard en neem een aliquot van 0,1 milliliter en pipetteer in een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter.

Verdun met 3,5% salpeterzuur tot een eindvolume van 10 milliliter om 10 delen per miljard standaardoplossingen te produceren. Maak met behulp van de 10 delen per miljard voorraad de seriële verdunningen 0,1, 1,0 en 5,0 delen per miljard standaardoplossingen in 3,5% salpeterzuur. Maak met behulp van de 0,1-voorraad de seriële verdunningen 0,001, 0,005 en 0,01 delen per miljard standaardoplossingen in 3,5% salpeterzuur.

Voordat u het ICPMS-instrument voorbereidt voor monsteranalyse, moet u ervoor zorgen dat de argongasklep open is, dat alle slangen goed zijn aangesloten en schoon zijn, dat 5% salpeterzuur open is voor het spoelen van slangen en glaswerk tussen monsteranalyses. Controleer de staat van de zaklamp en kegels en zorg ervoor dat de zaklampdoos goed is vergrendeld. En de afvoerbuis van de sproeikamer is correct aangesloten op de peripomp.

Open de software, controleer de vacuümmetingen en zorg ervoor dat alle turbopompen op 100% werken Klik op START in het statusvenster van het Plasma Control-systeem om de startvolgorde te starten. Zet de plasmapomp en plasmakoeler aan, zet de vernevelaar neer en steek het plasma aan. Wacht tot het plasma brandt en stabiel is wanneer het statusvenster aangeeft dat de opstartvolgorde is voltooid.

Let op dit punt op de groene stippen in het systeemstatusvenster die aangeven dat alle voedingen zijn ingeschakeld. Klik in de menubalk op Control, Autosampler in het vervolgkeuzemenu. Voer de autosampler rack positie in voor de buis met 5% salpeterzuur, laat het zuur het plasma binnendringen.

Klik in de menubalk op Scans, Magnet in het vervolgkeuzemenu. Typ in het MagnetScan-venster 115 in de markermassapositie en klik op enter. Laat de magneet gedurende 30 minuten over het massabereik scannen terwijl het instrument opwarmt.

Gebruik na 30 minuten de autosampler-besturing om naar de positie van een één-delen per miljard multi-element tuning-oplossing te gaan. Adem de stemoplossing op en stem het instrument af om de signaalaflezing te optimaliseren. Pas de fakkelpositie aan voor X-, Y- en Z-coördinaten, zodat de zaklamp wordt uitgelijnd met het midden van de kegels en de stroomsnelheid van de vernevelaar in het plasmacontrolevenster.

Breng de nodige aanpassingen aan in het venster Ion Optics Tuning voor de bron, detector en analyzer. Zodra de signaalaflezing is geoptimaliseerd, klikt u op Stoppen in het venster Magneetscan, klikt u op Magneet kalibreren en selecteert u een lage resolutie in het pop-upvenster. Klik op OK En open het bestand Massakalibratie smc om de magneet te kalibreren.

Klik op Opslaan, gebruiken om de huidige magneetkalibratie toe te passen op de analyses. Bij het meten van onbekende monsters met een enorm bereik aan concentraties, voert u een detectorkalibratie uit om ionenpulstelsignalen bij lage concentraties te vergelijken met verzwakte ionsignalen die bij hogere concentraties worden geproduceerd. Start de voorbeeldanalyse door op Data-acquisitie te klikken en klik vervolgens op Method Setup in het vervolgkeuzemenu.

Gebruik een bestaande methode van de fabrikant of maak een methode op basis van de elementen van belang. Pas indien nodig de analysemodus, verblijftijd, schakelvertraging, aantal sweeps en cycli, resolutie, detectiemodus en de parkmassa aan voor deflectorinstellingen. Klik op Opslaan om de methode-instellingen vast te leggen.

Optimaliseer de parameters voor elk metaal en isotype. Klik in de menubalk op Data Acquisition. Klik op Batchrun in het vervolgkeuzemenu.

U kunt ook op het BATCH-pictogram onder de menubalk klikken, de batchparameters uit een spreadsheet importeren of een reeks maken in het venster Batchrun. Voer het voorbeeldtype, de positie van het autosampler-rek, de overdrachtstijd, de wastijd, de replicaties, de voorbeeld-id en het methodebestand in. Regel de batchrun voor standaardoplossingen voor kalibratiecurve, gevolgd door een kwaliteitscontrolestandaard en vervolgens onbekende monsters.

Bewaak de instrumentdrift en de reproduceerbaarheid van monsters door elke 5 tot 10 monsters een kwaliteitscontrolestandaard van 0,5 delen per miljard op te nemen. Weefselopnamestudies werden uitgevoerd met watergedragen blootstellingen van cisplatine en een nieuwe op ruthenium gebaseerde antikankerverbinding PMC79. Letaliteit en vertraagd uitkomen werden geëvalueerd op nominale concentraties cisplatine.

0, 3,75, 7,5 15, 30 en 60 milligram per liter cisplatine. Platina accumulatie in organisme weefsel werd bepaald door ICPMS-analyse en organisme weefsel bevatte respectievelijke doses van 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 en 461,9 nanogram per organisme. Vertraagd uitkomen werd waargenomen bij alle cisplatineconcentraties.

Na de dechorionatie werden koraalen afzonderlijk verzameld en geanalyseerd op platina. Niet-dodelijke doses cisplatine die werden gebruikt voor dechorionatiestudies bepaalden dat 93 tot 96% van de totale afgeleverde dosis cisplatine zich had opgehoopt in het chorion, met de resterende dosis in het larvale weefsel. Zebravislarven werden blootgesteld aan 0, 3,1, 6,2, 9,2 en 12,4 milligram per liter PMC79.

Deze concentraties werden analytisch bepaald om 0, 0,17, 0,44, 0,66 en 0,76 milligram per liter ruthenium te bevatten. In tegenstelling tot dit cisplatine werd vertraagd uitkomen niet waargenomen bij de aan PMC79 blootgestelde larven. Chorionen werden niet opgenomen in rutheniumanalyse omdat ze van nature werden afgebroken voorafgaand aan larvale verzameling.

Het massieve metaal in larvale weefsels geanalyseerd bij elke concentratie was 0,19, 0,41 en 0,68 nanogram ruthenium per larve. Elk van de reagentia die aan het blootstellingsprotocol worden toegevoegd, geeft de kans op isobare interferenties. Overweeg indien mogelijk alternatieven zoals snelle koeling in vergelijking met tricaïne.

Met deze methode kunnen metaaldosiskwantificering voor toxiciteit, werkzaamheid en experimenten worden vergeleken met hogere gewervelde dieren. We waren vooral enthousiast dat onze drempeldosis binnen een orde van grootte lag die aan patiënten werd gegeven.