Snelle genotypering van Mouse weefsel met behulp van Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Hallo, mijn naam is Linda en ik werk in het laboratorium van Dr. Edwin Niki aan de University of California Irvine. Vandaag laat ik u zien hoe ik de Sigma Cyber Green FastPCR kit gebruik om transgene muizen snel te genotyperen. Meestal gebruik ik deze kit om onze embryonale muizen te genotyperen wanneer ik acute dissociatieve celculturen maak en snel het genotype van onze muis moet bepalen.

Maar voor de huidige doeleinden hebben we staarten van volwassen muizen waarop we kunnen laten zien hoe ik deze kit gebruik. Dit protocol omvat een snelle digestie met alke en DNA-extractie, gevolgd door een snelle neutralisatiestap. Vervolgens gebruiken we het geëxtraheerde DNA in een real-time PCR, waarbij we onze PCR-amplicons kunnen monitoren.

Als u klaar bent, kunnen we beginnen. Voordat we starten, moeten we ervoor zorgen dat ons warmteblok is ingesteld op 95 °C, dat onze SYBR Green is ontdooid en op ijs wordt bewaard tot het nodig is, en dat onze overige reagentia ontdooien tot kamertemperatuur. In mijn ijsbakje heb ik de twee primers die we voor het genotyperen zullen gebruiken; deze zijn specifiek ontworpen voor ons gen van belang en gevalideerd voor qPCR.

Ik heb daarnaast mijn positieve controle voor het gen van belang, mijn negatieve controle en een weefselmonster dat ik al heb verzameld van een volwassen muis. Wanneer u uw weefselmonster verzamelt, is het zeer belangrijk om u extreem strikt aan de regels te houden. Bij het verzamelen van embryonale muizenstaarten spoelen we onze pincetten altijd met 70%ethanol voorafgaand aan en vóór elke weefselverzameling.

En we spoelen de staartmonsters altijd eerst in TBS. Vervolgens moet u een mastermix maken van de weefselpreparatie en DNA-extractie voor elke staart; hiervoor zijn 100 µL van de extractie-oplossing en 25 µL van de weefselpreparatie-oplossing nodig. Ik gebruik mijn P200 en filterpipetpunten om 100 µL van de extractie-oplossingen en 25 µL van de weefselpreparatie-oplossing in een nieuwe Eppendorf-buis te pipetteren. Meng de mastermix-oplossing door herhaaldelijk op en neer te pipetteren.

Voeg vervolgens 125 µL van uw mastermix toe aan het monster van belang. Zorg erbij een volwassen muizenstaart dat het afgesneden uiteinde volledig is ondergedompeld in de mastermix-oplossing. U kunt het mengsel kort met de vinger vortexen en vervolgens 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Tijdens deze incubatietijd van 10 minuten bereid ik mijn favoriete groene mastermix, bestaande uit de cider green mastermix die bij de kit is geleverd, Milli-Q of PCR-waardig water, en onze primers; een beetje PCR-waardig water samen met onze forward- en reverse-primers. Dat is alles.

Nu de incubatietijd van 10 minuten is verstreken, moeten we de reactie verhitten en activeren bij 95 °C gedurende drie minuten. De inactivering van drie minuten is voltooid en nu voegen we de neutralisatieoplossing toe die in de kit is meegeleverd; we voegen 100 µL per reactie toe en mengt dit door te vortexen. Nadat u de neutralisatiebuffer heeft toegevoegd, kunnen de DNA-monsters worden bewaard bij 4 °C tot u klaar bent om ze te gebruiken.

We willen ons genotype direct weten. Daarom gaan we meteen over tot de qPCR; mijn monsters zijn geneutraliseerd en gereed. Mijn SYBR Green PCR-mastermix staat klaar en ik heb mijn PCR-buisjes op een koelblok geplaatst.

Ik ga nu 16 µL van mijn mastermix aan elke well toevoegen en vervolgens vier µL van het geneutraliseerde extract of vier µL van de positieve of negatieve controle aan elke well toevoegen. Wat ik doe, is 16 µL van een mastermix aan elke well toevoegen. Daarna voeg ik vier µL van het geneutraliseerde extract toe aan de 16 µL mastermix in de well, voor een totaal reactievolume van 20 µL.

Hetzelfde doe ik voor de positieve en negatieve controle. Voeg 4 µL toe aan 16 µL van een qPCR-mastermix. Wanneer alles is toegevoegd, kunnen ze worden afgesloten met een optisch transparante strip van acht doppen.

Wees voorzichtig dat u het optisch transparante gedeelte van de dopjes boven uw monsters niet aanraakt. Daarom gebruik ik een Kimwipe om op de dopjes te drukken en zo te controleren of ze goed zijn afgesloten. Ik heb ons PCR- en DNA-mengsel voorzichtig gevortext en gecentrifugeerd, dus we zijn nu klaar om ze in de qPCR-machine te plaatsen.

Wat we gaan doen is eerst onze monsters in de Opticon PCR-machine laden; ik ga een nieuwe plaatconfiguratie maken, waarbij de eerste put ons monster is, de tweede put onze positieve controle en de derde put onze negatieve controle. Stel vast dat ons totale reactievolume 20 µL is. Vervolgens ga ik een protocol laden dat is ontworpen voor rapid genotyping.

Dit protocol omvat een denaturatiestap van drie minuten, een cyclus van 15 seconden denaturatie, 15 seconden primaire annealing en vervolgens 20 seconden primaire extensie. De primaire extensietijd kan in feite worden teruggebracht naar ongeveer 10 seconden, waardoor de totale duur slechts 40 seconden bedraagt. Voor elke cyclus doorlopen we deze drie stappen ongeveer 40 keer, zoals bij een normale PCR, waarna we aan het einde een smeltcurve bepalen.

Nu de plaat is klaargezet en het protocol is geladen, kunnen we de qPCR starten, beginnend bij de denaturatiestap van drie minuten. Op basis van mijn ervaring met de gebruikte primers, de staartmonsters en de gezochte genen, weet ik dat mijn positieve resultaten rond cyclus 25 zullen verschijnen, waarbij ze een significante drempelwaarde (cycle threshold) overschrijden.

Nu is het moment waarop dat kruispunt wordt bereikt sterk afhankelijk van uw weefselmonster, waar u naar op zoek bent en hoeveel DNA er aanvankelijk aanwezig is. We kunnen nu al zien dat onze positieve controle al is verschenen en het lijkt erop dat ons monster ook positief is. Zoals u ziet, begint dit kort na onze positieve controle te verschijnen.

We moeten het nog afwachten omdat we pas bij 27 cycli zijn, maar hopelijk kunnen we over een paar cycli zeker weten of ons monster positief is, zodat ik kan doorgaan met mijn experiment. Op dit moment is te zien dat de negatieve controle net begint op te komen; dit komt doordat ik een overmaat aan staartmateriaal heb gebruikt. Dat helpt om er zeker van te zijn dat alles wat vóór deze overmatige negatieve staart verschijnt, positief zal zijn.

Op dit punt zou ik alles wat vóór de negatieve controle verschijnt als positief beschouwen en zou ik verdergaan met mijn experiment. Nadat de PCR-cycli zijn voltooid, voert het apparaat een smeltcurve-analyse uit. Dit helpt u bij het bepalen van de samenstelling en zuiverheid van uw product.

Hiermee kunt u vaststellen of de positieve en negatieve monsters correct zijn gekozen. Zo zal het positieve monster een specifieke, scherpe piek in de smelttemperatuur vertonen, die overeenkomt met een specifiek geamplificeerd PCR-product. Eventuele negatieve monsters zullen een aspecifieke, brede piek in de smelttemperatuur vertonen die overeenkomt met aspecifiek DNA dat tijdens de PCR is geamplificeerd.

Ik heb zojuist laten zien hoe we de Cyber Green-extractiekit van Sigma gebruiken voor het snel genotyperen van staarten van volwassen muizen. Deze kit kan echter worden gebruikt voor diverse dierlijke weefsels, haar, speeksel, en ik gebruik hem ook voor het genotyperen van embryonale muizenstaarten. Wij maken graag gebruik van deze kit omdat hij snel werkt.

Ik kan mijn genotype binnen een uur terugkrijgen, en het is zeer handig en eenvoudig. Bedankt voor het kijken en veel succes.