Name: Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen. Dit protocol behoudt de ubiquitine-koppelingsmodus en faciliteert onderzoek naar eiwitfunctieregulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (81972624) aan D.L.

OPMERKING: H1299-cellen werden vriendelijk verstrekt door de Stamcelbank, Chinese Academie van Wetenschappen en bleken negatief te zijn voor mycoplasmabesmetting.
1. Celkweek
<ol><li>Plaats voor de initiële cultuur 1 x 106 cellen van menselijke longadenocarcinoomcellijn, H1299 in een petrischaaltje van 10 cm met 10-12 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% glutamineadditief, 1% natriumpyruvaat en antibiotica (100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine). Houd de cellen op 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Splits de cellen elke 2-3 dagen, afhankelijk van wanneer ze 80% -90% samenvloeiing bereiken.</li>
	<li>Bereid een dag voor de transfectie 6-9 x 106 cellen voor drie petrischalen en plaat 2-3 x 106 cellen in een enkele petrischaal van 10 cm met 10-12 ml medium om een samenvloeiing van 70% -90% tijdens transfectie te bereiken. OPMERKING: HEK293T-cellen kunnen ook worden gebruikt om ubiquitinated eiwitten te zuiveren vanwege hun hoge transfectie-efficiëntie en eiwitexpressieniveau.</li>
</ol>2. Plasmide transfectie
<ol><li>Voeg 1,5 ml gereduceerd serummedium toe in drie centrifugebuizen van 15 ml.</li>
	<li>Voeg plasmide-DNA toe dat klaar is voor transfectie aan elke buis om als volgt verdunningen te maken. Buis 1: 1 μg Flag-p53 plasmide, 12 μg lege vector; Buis 2: 1 μg Flag-p53 plasmide, 3 μg His-HA-Ub (HH-Ub) plasmide en 9 μg lege vector; Buis 3: 1 μg Flag-p53 plasmide, 3 μg HH-Ub plasmide en 9 μg Mdm2 plasmide. Voeg in totaal 0,2 μg groen fluorescerend eiwit (GFP) plasmide toe aan elke buis om de transfectie-efficiëntie te controleren. OPMERKING: Een proefexperiment moet worden uitgevoerd om de optimale hoeveelheden plasmiden te bepalen die nodig zijn om een efficiënte doeleiwitexpressie in cellen te bereiken.</li>
	<li>Voeg 78 μL liposoom transfectiereagens toe aan 4,5 ml gereduceerd serummedium in een andere centrifugebuis om liposomen te verdunnen. Meng grondig door de buis te vegen en laat 5 minuten op kamertemperatuur (RT) staan.</li>
	<li>Voeg 1,5 ml van de verdunde liposoomoplossing toe aan elke buis uit stap 2.2 die 1,5 ml van de verdunde DNA-oplossing bevat. Meng grondig en verknoop de plasmiden met de liposomen gedurende ten minste 20 minuten bij RT. Gebruik een plasmide DNA: liposoomverhouding van 1:2 (μg:μL) voor elke transfectie.</li>
	<li>Gooi het originele medium uit de petrischalen weg en voeg 9 ml gereduceerd serummedium toe aan elk gerecht. Voeg 3 ml van het liposoom-DNA-mengsel toe aan elk gerecht en meng de oplossing door de plaat 3x voorzichtig heen en weer te schudden en vervolgens 3x links en rechts voor een gelijkmatige verdeling van het mengsel in de plaat.</li>
	<li>Kweek de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2. Vervang het medium na 4-6 uur en blijf de cellen gedurende 24-36 uur kweken.</li>
</ol>3. Celverzameling
<ol><li>Behandel de cellen na 24-36 uur met MG132 in een eindconcentratie van 10 μM gedurende 4-6 uur. OPMERKING: MG132 is een peptidealdehyde dat efficiënt de proteolytische activiteit van het 26S-proteasoomcomplex blokkeert. De hoeveelheden eiwitten die zijn geëubiquitineerd met lysine-48 (K48)-gebonden polyubiquitineketens kunnen worden verhoogd nadat cellen zijn behandeld met MG132 of andere proteasoomremmers.</li>
	<li>Gooi het medium weg, was de cellen 2x (zorg ervoor dat de cellen niet worden weggespoeld) met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en aspirateer de cellen met serologische pipetten.</li>
	<li>Voeg 1 ml PBS toe aan de schaal, verwijder de cellen door te schrapen met een schone schraper en breng de celsuspensie over in microcentrifugebuizen. Centrifugeer bij 700 x g gedurende 5 minuten om celpellets te verzamelen.</li>
</ol>4. Zuivering van ubiquitinated eiwitten onder niet-aturerende omstandigheden
<ol><li>Bereid Flag lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosyl en 10% glycerol) vers aangevuld met proteaseremmer cocktail voor gebruik.</li>
	<li>Voeg 800 μL ijskoude Flag-lysisbuffer toe aan de cellen in elke buis, meng de cellen met behulp van een vortexoscillator of pipetpistool en incubeer het mengsel vervolgens op een rotator bij 4 °C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Onderwerp het mengsel aan 5-10 korte pulsen van ultrasone trillingen. Voer de ultrasoon op het ijs uit met een ultrasoonapparaatfrequentie van 20 kHZ en 80% amplitude waarbij elke puls 1 s duurt. Incubeer het mengsel op een rotator met 40 omwentelingen per minuut (rpm) bij 4 °C gedurende 30 min.</li>
	<li>Centrifugeer de ultrasone monsters bij 8.000 x g gedurende 20-30 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis.</li>
	<li>Aliquot 80 μL (1/10) van het celextract en meng met 20 μL 5x natriumdodecylsulfaat (SDS) laadbuffer. Kook de monsters op 98 °C gedurende 5 min, koel af op ijs gedurende 2 min en bewaar bij -20 °C tot gebruik. Gebruik deze monsters als invoergroep om de eiwitexpressie te controleren.</li>
	<li>Voeg 30 μL antivlag M2 antilichaam-geconjugeerde (Flag/M2) kralen toe aan de resterende celextracten en incubeer op een rotator bij 4 °C gedurende ten minste 4 uur of een nacht.</li>
	<li>Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 min bij 4 °C om de kralen op te vangen. Voeg 1 ml ijskoude Flag lysis buffer toe aan de kralen en meng door de buis meerdere keren om te keren.</li>
	<li>Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 min bij 4 °C om de kralen op te vangen. Herhaal stap 4.7 gedurende 4-6 keer.</li>
	<li>Voeg 40 μL Flag-peptiden in een eindconcentratie van 200 ng/μL toe aan de kralen en incubeer op een rotator bij 4 °C gedurende 2 uur om de gebonden eiwitten te elueren.</li>
	<li>Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis.</li>
	<li>Voeg 10 μL 5x SDS-laadbuffer toe, kook het mengsel op 98 °C gedurende 5 min, koel af op ijs gedurende 2 minuten en bewaar bij -20 °C voor Western blotting. U kunt het eluaat uit stap 4.10 ook direct bij -80 °C bewaren voor andere downstream-experimenten. OPMERKING: De hoeveelheid gezuiverde ubiquitinated eiwitten kan worden opgeschaald door het aantal cellen en hoeveelheden getransfecteerde plasmiden te verhogen. Een epitoop tagging strategie kan worden aangepast om cellulaire complexen te zuiveren die specifiek binden aan ubiquitinated p53 onder inheemse zuiveringsomstandigheden. Door Flag-p53, mdm2 en HA-ubiquitine co-expressie te geven, kan het ubiquitinated p53-eiwitcomplex immunoprecipiteerd worden door sequentiële Flag en HA-antilichaam-geconjugeerde agarose uit zoogdiercellen. Om partners van ubiquitinated p53-eiwitten te binden, moet de minder strenge BC100-lysisbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glycerol, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 en 1x proteaseremmer) worden gebruikt tijdens het zuiveringsproces. Het eluaat uit HA-peptide wordt onderworpen aan massaspectrometrie om alle partners te identificeren die specifiek binden aan ubiquitinated p53.</li>
</ol>5. Zuivering van ubiquitinated eiwitten onder denatureringsomstandigheden
<ol><li>Voeg 1 ml ijskoude PBS toe aan de celpellets die in stap 3.3 zijn verkregen en meng gelijkmatig. Aliquot 100 μL (1/10 volume) van de celsuspensie in een microcentrifugebuis als invoermonster.</li>
	<li>Centrifugeer bij 700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de celpellets te verzamelen. Voeg 80 μL Flag-lysisbuffer toe aan het invoermonster, meng de cellen met behulp van een vortexoscillator of pipetpistool en laat de cellen gedurende 1 uur op ijs vallen.</li>
	<li>Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 20-30 min bij 4 °C. Aliquot 80 μL van het supernatant in een nieuwe microcentrifugebuis.</li>
	<li>Voeg 20 μL 5x SDS-laadbuffer toe aan het bovennatuurlijke middel, kook bij 98 °C gedurende 5-10 minuten, koel op ijs gedurende 2 minuten en bewaar bij -20 °C tot gebruik.</li>
	<li>Centrifugeer de resterende 900 μL van de celsuspensie bij 700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de celpellet te verzamelen. Voeg 1 ml ubiquitinebuffer 1 (UB-buffer 1; 6 M guanidine-HCI, 0,1 M Na2HPO4, 6,8 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) en 0,2% Triton X-100, vers aangevuld met 10 mM β-mercaptoethanol en 5 mM imidazool) toe aan de celpellets en meng verschillende keren door op en neer te pipetteren om de cellen gelijkmatig te verdelen. OPMERKING: De concentratie van imidazool kan variëren van 5 mM tot 20 mM om de niet-specifieke eiwitbinding op de nikkel-geladen hars te verminderen. Ubiquitinebuffer bevat guanidinehydrochloride, dat zowel ligases als DUB's inactiveert. β-mercaptoethanol is een heldere, kleurloze vloeistof met een sterke, onaangename geur vergelijkbaar met rotte eieren. Een oplossing met hoge concentratie veroorzaakt ernstige schade aan het slijmvlies, de bovenste luchtwegen, de huid en de ogen. Draag handschoenen en een bril en opereer in de zuurkast.</li>
	<li>Onderwerp de cellysaten aan 10-20 rondes ultrasoon totdat de oplossing niet langer stroperig is. Voer de ultrasoon op het ijs uit met een ultrasoonapparaatfrequentie van 20 kHZ en 80% amplitude waarbij elke puls 1 s duurt. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 20-30 minuten bij RT en breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis.</li>
	<li>Voeg 30 μL nikkel-geladen hars toe aan het supernatant en incubeer op een rotator die gedurende 4 uur of een nacht bij RT op 15 tpm is ingesteld. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 minuten bij RT om de kralen te verzamelen.</li>
	<li>Voeg 1 ml UB-buffer 1 toe, incubeer met rotatie in een shaker gedurende 10 minuten bij RT en centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 minuten bij RT om de kralen te verzamelen.</li>
	<li>Voeg 1 ml ubiquitinebuffer 2 (UB-buffer 2; 8 M ureum, 0,1 M Na2HPO4, 6,8 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) en 0,2% Triton X-100) toe aan de kralen, incubeer met rotatie in een shaker gedurende 10 minuten bij RT en centrifugeer op 1.500 x g gedurende 2 minuten om de kralen te verzamelen. Herhaal dit nogmaals.</li>
	<li>Voeg aan de kralen 1 ml PBS toe, incubeer met rotatie in een shaker gedurende 10 minuten bij RT en centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 minuten bij RT om de kralen te verzamelen. Herhaal dit nogmaals.</li>
	<li>Elute gebonden eiwitten door de kralen te incuberen met 40 μL imidazool in een eindconcentratie van 0,5 M gedurende 1 uur bij RT. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 2 min bij RT.</li>
	<li>Breng het supernatant over in een schone microcentrifugebuis, voeg 10 μL 5x SDS-laadbuffer toe, kook bij 98 °C gedurende 5 minuten, koel af op ijs gedurende 2 minuten en bewaar bij -20 °C voor Western blotting. U kunt het onbewerkte eluaat ook bewaren bij -80 °C voor andere downstream-experimenten.</li>
</ol>6. Detectie van gezuiverde ubiquitinated eiwitten door Western blotting
<ol><li>Los de monsters uit stap 4.11 en 5.12 op met natriumdodecylsulfaatpoacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en breng ze vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan door Western blotting om doeleiwitten te detecteren met behulp van de overeenkomstige antilichamen zoals beschreven18.</li>
	<li>Kortom, incubeer het membraan door onder te dompelen in 20 ml blokoplossing met 5% ontvet melkpoeder in TBST-buffer (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, vers aangevuld met 0,1% Tween-20 voor gebruik) bij RT gedurende 1 uur. Incubeer vervolgens het membraan met primaire antilichamen bij RT gedurende 2 uur of een nacht bij 4 °C. Gebruik de volgende antilichamen voor elke set. Alle primaire antilichamen werden gebruikt bij een verdunning van 1:1000.<ol><li>Detecteer totaal p53-eiwit, inclusief ubiquitinated p53, met een anti-p53 monoklonaal antilichaam na immunoprecipitatie met Flag/M2 agarose-kralen.</li>
		<li>Detecteer ubiquitinated p53-eiwitten met een anti-HA-antilichaam of anti-ubiquitine-antilichaam na immunoprecipitatie met Flag / M2 agarose-kralen.</li>
		<li>Detecteer alomtegenwoordige p53-eiwitten met een anti-p53 monoklonaal antilichaam na nikkel-geladen hars pulldown.</li>
		<li>Detecteer totaal ubiquitinated eiwit met een anti-HA-antilichaam of anti-ubiquitine-antilichaam na nikkel-geladen hars pulldown.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen bij RT gedurende 1 uur na 3x wassen met TBST-buffer gedurende 5 minuten elk. Alle secundaire antilichamen werden gebruikt bij een verdunning van 1:3000. Was vervolgens het membraan met TBST-buffer 3x gedurende 5 minuten elk met zachte roering.</li>
	<li>Start het chemiluminescentiebeeldvormingssysteem om signalen van Western blotting te detecteren. Bereid de substraatoplossing voor HRP door oplossingen A en B te mengen in een verhouding van 1:1.</li>
	<li>Plaats het nitrocellulosemembraan in de camera obscura met de voorkant naar boven en bekleed de substraatoplossing gelijkmatig op het membraan met behulp van een pipetteerpistool. Selecteer de automatische belichtingsprocedure om chemiluminescente signalen op te vangen en pas de belichtingstijd handmatig aan totdat een ideaal signaal is verkregen.</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+Structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li>
<li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li>
<li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li>
<li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery%3A+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li>
<li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+the+p53+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li>
<li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+and+Tumor+suppression%3A+It+takes+a+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li>
<li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li>
<li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+by+the+light%3A+The+growing+complexity+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li>
<li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+ubiquitination%3A+Mdm2+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+modifications%3A+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li>
<li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2%3A+Open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li>
<li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-+versus+polyubiquitination%3A+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li>
<li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+M+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual.+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition)</a>. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Ubiquitinatie speelt een cruciale rol in bijna alle fysiologische en pathologische cellulaire processen2. In de afgelopen jaren is grote vooruitgang geboekt bij het begrijpen van de moleculaire rol van ubiquitine in signaalroutes en hoe veranderingen in het ubiquitinesysteem leiden tot verschillende menselijke ziekten2. De zuivering van ubiquitinated eiwitten draagt bij aan het inzichtelijk maken van de exacte rollen van ubiquitinatie in deze processen. De mengsels van ubiq...

Ubiquitine is een evolutionair geconserveerd eiwit van 76 aminozuren 1,2,3. Ubiquitine bindt covalent lysineresiduen op doeleiwitten door middel van cascades met activerende (E1), conjugaterende (E2) en ligase (E3) enzymen. Ubiquitine wordt eerst geactiveerd door het E1-enzym en wordt vervolgens overgebracht naar de E2-conjugaterende enzymen. Vervolgens interageren E3-ubiquitine-ligases met zowel ubiquitine-geladen E2-enzymen als substraateiwitten en bemiddelen ze de vorming van een isopeptidebinding tussen de C-terminal van ubiquitine en een lysineresidu in het substraat 1,2,3,4,5. Ubiquitinatie omvat de aanhechting van ubiquitine moieties aan lysineresiduen op substraateiwitten of aan zichzelf, wat leidt tot eiwitmonoubiquitinatie of polyubiquitinatie. Dit ubiquitinatieproces vindt intracellulair plaats in eukaryoten en reguleert een grote verscheidenheid aan biologische processen. Ubiquitinatie resulteert in de afbraak van substraateiwitten via het ubiquitine-proteasoomsysteem 1,2,3,4,5. Bovendien moduleert ubiquitinatie eiwitsubcellulaire lokalisatie, eiwitcomplexvorming en eiwithandel in cellen 3,5. Ubiquitine moieties die aan substraateiwitten zijn toegevoegd, kunnen worden verwijderd door deubiquitinerende enzymen (DUB's)6,7. Met name de verschillende manieren waarop ubiquitineketens worden samengesteld, bieden een groot aantal middelen om verschillende biologische processen te reguleren 1,5. De exacte rol van ubiquitinatie bij het reguleren van de substraateiwitfunctie blijft tot nu toe onvolledig begrepen. De zuivering van ubiquitinated eiwitten draagt bij aan de opheldering van de effecten van eiwitubiquitinatie op een verscheidenheid aan cellulaire processen.
Het p53-eiwit is een van de belangrijkste tumorsuppressorgeiwitten en vertoont genetische mutaties of inactivatie bij bijna alle menselijke kankers 8,9,10,11. p53 stabiliteit en activiteit worden in vivo subtiel gereguleerd door posttranslationele modificaties, waaronder ubiquitinatie, fosforylering, acetylering en methylatie12,13. Het p53-eiwit heeft een korte halfwaardetijd variërend van 6 min tot 40 minuten in verschillende cellen, wat voornamelijk het gevolg is van de polyubiquitinatie en daaropvolgende proteasomale afbraak10,12. Muis dubbele minuut 2 (Mdm2) is een E3 ubiquitine ligase van p53 dat bindt aan de N-terminus van p53 om zijn transcriptionele activiteit te remmen 12,14,15. Mdm2 bevordert de polyubiquitinatie en proteasomale afbraak van p53 om de stabiliteit ervan te beheersen en induceert monoubiquitinatie van p53 om de nucleaire export te vergemakkelijken 12,14,15,16. Hier wordt Mdm2-gemedieerde p53-ubiquitinatie als voorbeeld gebruikt om een methode voor de zuivering van ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen in detail te introduceren. De regulatoren die de ubiquitinatiestatus van doeleiwitten beïnvloeden, kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze in vivo ubiquitinatietest wanneer ze overexpressie hebben of worden neergeslagen / uitgeschakeld in zoogdiercellen. Bovendien kunnen ubiquitinated eiwitten worden gebruikt als substraten voor in vitro deubiquitinatietest. Een high-throughput screening kan worden uitgevoerd om specifieke DUB's voor doeleiwitten te identificeren door ubiquitinated substraten te incuberen met individuele DUB's. Ubiquitinated eiwitten kunnen fungeren als een steiger om downstream signaaleiwitten in cellen te rekruteren. Een alomtegenwoordig doeleiwitcomplex kan worden gezuiverd door sequentiële immunoprecipitatie onder inheemse zuiveringsomstandigheden en worden geïdentificeerd door massaspectrometrie. Het huidige protocol kan uitgebreid worden gebruikt om de cellulaire eiwitten te onderzoeken die worden gereguleerd door ubiquitinatie.
Er zijn verschillende methoden vastgesteld om ubiquitinated eiwitten te zuiveren, waaronder het gebruik van affiniteit-tagged ubiquitine, ubiquitine-antilichamen, ubiquitine-bindende eiwitten en geïsoleerde ubiquitine-bindende domeinen (UBD's)17. Hier bieden we een protocol met behulp van affiniteit-gelabeld ubiquitine als een mediator om ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen te zuiveren. Het gebruik van poly-His-tagged ubiquitine biedt voordelen ten opzichte van de andere methoden. Ubiquitinated eiwitten worden gezuiverd in de aanwezigheid van sterke denaturanten, die niet-specifieke binding aan nikkel-geladen hars verminderen door cellulaire eiwitten te lineariseren en eiwit-eiwitinteracties te verstoren. Daarentegen kan het gebruik van ubiquitine-antilichamen, ubiquitine-bindende eiwitten en geïsoleerde URD's als mediatoren bindende partners niet effectief uitsluiten van doeleiwit omdat zuivering onder minder strenge voorwaarden moet worden uitgevoerd. Bovendien kan zuivering ook leiden tot een verhoogde binding van niet-gerelateerde eiwitten met behulp van deze mediatoren. Bovendien is er een bindende neiging voor verschillende ubiquitine-koppelingstypen en mono- en poly-ubiquitinatie door ubiquitine-bindende eiwitten of geïsoleerde UBD's17. Het gebruik van poly-His-tagged ubiquitine draagt bij aan het naar beneden halen van alle cellulaire ubiquitinated eiwitten. Als alternatief maakt het gebruik van in de handel verkrijgbare anti-Flag of anti-HA antilichaam-geconjugeerde agarose het gemakkelijker om grootschalige Flag- of HA-gelabelde doeleiwitten onder niet-condenserende omstandigheden te immunopreciperen. Een tweede zuiveringsstap, bijvoorbeeld door nikkel-geladen hars gericht op poly-His-tagged ubiquitine, kan worden gebruikt om ubiquitinated doeleiwitten met een hoge zuiverheid te verkrijgen voor downstream experimenten. Met name een epitoop tagging zuiveringsstrategie kan worden aangepast wanneer een specifiek antilichaam niet kan worden verkregen om doeleiwitten effectief te immunoprecipitaat. Ten slotte behoudt de zuivering van ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen, in vergelijking met zuivering in vitro, de ubiquitine-koppelingsmodus van doeleiwitten onder meer fysiologische omstandigheden.

<table><tbody><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sangon Biotech</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td><td>GE healthcare</td><td>NA931</td><td>Secondary antibdoy</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td><td>GE healthcare</td><td>NA935</td><td>Secondary antibdoy</td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>FLAG/M2 beads</td></tr><tr><td>Anti-GFP monocolonal antibody</td><td>Santa cruz</td><td>sc-9996</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Anti-HA High Affinity</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-965</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-126</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>solvent</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FLAG Peptide</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>Prepare elution buffer</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>supplement</td></tr><tr><td>Guanidine-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100287-0500</td><td>solvent</td></tr><tr><td>H1299</td><td>Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Immidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>solvent</td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagents</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>MG132</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13259</td><td>Proteasome inhibitor</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>solvent</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>solvent</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td>solvent</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501726-0500</td><td>solvent</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>QIAGEN</td><td>30230</td><td>nickel-charged resin</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Blotting membrane</td><td>GE healthcare</td><td>10600002</td><td>0.45 &micro;m pore size</td></tr><tr><td>Opti-MEM reduced serum medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Transfection medium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607011-0100</td><td>antibiotic</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biological Industries</td><td>01-100-1ACS</td><td>medium</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>solvent</td></tr><tr><td>SDS Loading Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>supplement</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501492-0005</td><td>solvent</td></tr><tr><td>Tris-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610103-0250</td><td>solvent</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A110694-0500</td><td>reagent</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100777-0500</td><td>supplement</td></tr><tr><td>Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>ChemiDoc XRS+</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sangon Biotech</td><td>A510907-0500</td><td>solvent</td></tr></tbody></table>

zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitinatie is een soort posttranslationele modificatie die niet alleen de stabiliteit reguleert, maar ook de lokalisatie en functie van een substraateiwit. Het ubiquitinatieproces vindt intracellulair plaats in eukaryoten en reguleert bijna alle basale cellulaire biologische processen. Zuivering van ubiquitinated eiwitten helpt bij het onderzoek naar de rol van ubiquitinatie bij het beheersen van de functie van substraateiwitten. Hier wordt een stapsgewijze procedure beschreven om ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen te zuiveren met het p53 tumorsuppressorgeiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd onder strenge niet-denaturerende en denaturerende omstandigheden. Totaal cellulair Flag-tagged p53-eiwit werd gezuiverd met anti-Flag antilichaam-geconjugeerde agarose onder niet-denaturerende omstandigheden. Als alternatief werd het totale cellulaire His-tagged ubiquitinated eiwit gezuiverd met behulp van nikkel-geladen hars onder denatureringsomstandigheden. Ubiquitinated p53-eiwitten in de eluaten werden met succes gedetecteerd met specifieke antilichamen. Met behulp van deze procedure kunnen de alomtegenwoordige vormen van een bepaald eiwit efficiënt worden gezuiverd uit zoogdiercellen, waardoor studies naar de rol van ubiquitinatie bij het reguleren van de eiwitfunctie worden vergemakkelijkt.

Het schematische diagram toont de Flag-tagged p53 (Flag-p53) en His/HA double-tagged ubiquitine (HH-Ub) eiwitten (Figuur 1A). De procedures die worden gebruikt om ubiquitinated eiwitten te zuiveren zijn samengevat in figuur 1B. Poly-His-tagged ubiquitine kan worden geligeerd om eiwitten in zoogdiercellen te targeten. Ubiquitinated proteins kunnen worden gezuiverd met Flag/M2-kralen onder niet-aturerende omstandigheden of door geïmmobiliseerde metaalionaffiniteit...

Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen te zuiveren met behulp van het p53 tumor suppressor-eiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd uit cellen onder strenge niet-condenserende en denaturerende omstandigheden.

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Met behulp van dit protocol kunnen de alomtegenwoordige vormen van een bepaald eiwit efficiënt worden gezuiverd uit zoogdiercellen, waardoor studies naar de rol van ubiquitinatie bij het reguleren van de eiwitfunctie worden vergemakkelijkt. Zuivering van alomtegenwoordige eiwitten in zoogdiercellen in vergelijking met de zuivering in vitro behoudt de ubiquitine-koppelingsmodus van doeleiwitten onder meer radiologische omstandigheden. Begin met het toevoegen van 1,5 milliliter gereduceerd serummedium in drie centrifugebuizen van 15 milliliter.Voeg plasmide-DNA toe dat klaar is voor transfectie aan elke buis en voeg 0,2 microgram groen fluorescerend eiwitplasmide toe om de transfectie-efficiëntie te controleren. Voeg 78 microliter liposoomtransfectiereagens toe aan 4,5 milliliter gereduceerd serummedium in een andere centrifugebuis om de liposomen te verdunnen. Meng grondig door met de buis te vegen en laat hem vervolgens vijf minuten op kamertemperatuur staan.Voeg 1,5 milliliter van de verdunde liposoomoplossing toe aan elke buis die 1,5 milliliter van de verdunde DNA-oplossing bevat. Meng grondig en kruis de plasmiden met de liposomen gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemper

purification-of-ubiquitinated-p53-proteins-from-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte...

Detectie van eiwit ubiquitinering

This video describes a method to extract and purify ubiquitinylated peptides containing remnant di-glycine peptides from a complex peptide mixture. The presented method may help in identifying original ubiquitination sites in the protein.

Immunoaffinity Based Extraction of Ubiquitinylated Peptides: A Technique to Selectively Extract Ubiquitin Tagged Peptides from Purified Peptide Fractions

De hier beschreven methode is een nieuwe vesikel isolatie-protocol, waarmee voor de zuivering van de cellulaire compartimenten waarin exogene antigenen worden verwerkt door endoplasmatisch reticulum-geassocieerde afbraak in cross-presentatie.

Zuivering van het membraan compartiment voor endoplasmatisch Reticulum-geassocieerde afbraak van exogene antigenen in Cross-presentatie

In tegenstelling tot ubiquitin ligases, zijn paar E3 SUMO ligases geïdentificeerd. Deze gewijzigde in vitro SUMOylation protocol vermag roman SUMO E3 ligases identificeren door een reconstructie in vitro assay.

In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen speelt in cellulaire processen en nauw gecoördineerd wordt door deubiquitination. Defecten in beide reacties ten grondslag liggen aan menselijke pathologieën. Wij bieden protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reactie in vitro met behulp van gezuiverde componenten.

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Deze methode beschrijft de beoordeling van wereldwijde veranderingen in de ubiquitin ketentopologie. De beoordeling wordt uitgevoerd door de toepassing van een op massaspectrometrie gebaseerde gerichte proteomics-benadering.

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

We bieden een gedetailleerd protocol voor een alomtegenwoordyleringstest van een specifiek substraat en een E3-ubiquitine-ligase in zoogdiercellen. HEK293T-cellijnen werden gebruikt voor eiwitoverexpressie, het polyubiquityleerde substraat werd gezuiverd uit cellysaten door immunoprecipitatie en opgelost in SDS-PAGE. Immunoblotting werd gebruikt om deze posttranslationele modificatie te visualiseren.

Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Ubiquitinatie is een cruciale regulator van de functies van intracellulaire eiwitten. Hier beschrijven we twee cellysemethoden om substraatproteïneniveaus te detecteren in zoogdiercellen en vergelijken we hun effectiviteit bij het analyseren van ubiquitinatieniveaus. Eiwitoverexpressie in HEK293T cellen werd geïnduceerd door tijdelijke transfectie, en ubiquitinatieve eiwitten werden gedetecteerd door western blot-analyse.

Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model

Dit protocol beschrijft een methode om Streptococcus pneumoniae te ubiquitineren met behulp van zoogdiercellysaat of puur ubiquitine-enzymcomplex, gevolgd door behandeling met gezuiverd VCP/p97-UFD1-NPLOC4 eiwitcomplex om de bacteriolytische activiteit te beoordelen, waardoor het bestuderen van ubiquitine-afhankelijke immuuneffectoren mogelijk wordt.

In-vitro Reconstitutie van bacteriële ubiquitinatie en VCP/p97-gemedieerde eliminatie

Leer een betrouwbare methode voor zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen. Dit protocol behoudt de ubiquitine-koppelingsmodus en faciliteert onderzoek naar eiwitfunctieregulatie.

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Meer video's verkennen