Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia

Scheiding van extracellulaire blaasjes van vloeistoffen zoals conditiecelkweekmedia kan onderzoekers in staat stellen vesticulaire lading te karakteriseren en hun intracellulaire communicatiemechanismen te verkennen. Deze techniek zorgt voor voldoende scheiding van EV's en extracellulaire eiwitten van geconditioneerde celkweekmedia die eenvoudig en gebruiksvriendelijk is. Om te beginnen plaats PBS in een waterbad van 37 graden Celsius.

Observeer de controle en tunicamycine behandelde celkweekkolven onder een samengestelde microscoop met een 10 x en 100 x objectieflens. Noteer eventuele verschillen tussen de kolven. Haal het medium uit de kolf en plaats het in een buisje van 50 milliliter.

Centrifugeer vervolgens de buis op 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden celsius en breng de super natant over naar een nieuwe buis. Centrifugeer de buis bij 2000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Breng de super natant over in een nieuwe buis en plaats de buis op ijs.

Neem vier 15 milliliter drie kilodalton cutoff ultrafiltratie-eenheden en voeg vijf milliliter PBS toe aan elke buis. Bereid de filters voor door de units gedurende 10 minuten op vier graden Celsius op 4.000 G te centrifugeren. Nadat u PBS uit de eenheden hebt verwijderd, verdeelt u het supernatant van de controle- en behandelingsomstandigheden in twee ultrafiltratie-eenheden met elk ongeveer 12,5 milliliter media in elk.

Centrifugeer de buizen bij 4.000 G gedurende één uur en 45 minuten bij vier graden Celsius of totdat het geconcentreerde medium of retentaat in elke eenheid is geconcentreerd tot 250 microliter of minder. Breng het retentaat van beide regeleenheden over in een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en van behandelde eenheden in een andere buis. Meet het totale volume van het retentaat in elke microcentrifugebuis.

Als het volume kleiner is dan 500 microliter, voegt u 0,22 micron gefilterd PBS toe totdat het uiteindelijke volume 500 microliter is. Plaats buisjes in een vriezer van min 80 graden Celsius. Schakel de automatische breukcollector of AFC in.

Verwijder de kolom van vier graden celsius en laat de kolom opwarmen tot kamertemperatuur. Verwijder retentatemonsters uit de min 80 graden Celsius vriezer en leg ze op ijs om te ontdooien, terwijl je wacht, zet acht gelabelde 1,5 milliliter buizen in de AFC-carrousel met deksels naar binnen gericht. Plaats de kolom in de AFC met de streepjescode naar de lezer gericht en pas de instellingen aan om acht fracties van elk 500 microliter te verzamelen en het buffervolume naar standaard.

Controleer vervolgens de instructies op het scherm om de verzameling te starten. Nadat de opslagbuffer volledig is opgenomen in het bovenste gedeelte van de kolommatrix. Begin met het spoelen van de kolom door 15 milliliter PBS aan de kolom toe te voegen.

Voeg PBS niet te vroeg toe, omdat dit de opslagbuffer verdunt en voldoende spoeling voorkomt. Net voordat alle 15 milliliter PBS door de matrix wordt geabsorbeerd, klikt u op oke om het spoelen te stoppen en eventuele resterende PBS van de bovenkant van de kolommatrix te verwijderen met een micropipet. Raak de matrix niet aan.

Voeg 500 microliter monster toe aan het midden van de kolom en klik op OK om de run te starten. Nadat het monster volledig in de matrix is opgenomen, voegt u onmiddellijk acht milliliter PBS toe aan de kolom. AFC disstoot automatisch het lege volume in het midden van de carrousel voordat alle acht fracties van elk 500 microliter worden verzameld.

Verwijder na de run fracties uit de carrousel en plaats ze op ijs. Verwijder vervolgens het lege volume uit het midden van de carrousel. Voeg vervolgens 10 milliliter PBS toe aan de kolom om het resterende monster uit de kolom te wassen.

En zodra het berouwvolle monster volledig is gespoeld, voegt u 15 milliliter PBS toe aan de kolom. Terwijl de uiteindelijke PBS door de matrix wordt geabsorbeerd, voegt u 500 microliter 0,5 molair natriumhydroxide toe aan het midden van de matrix van de kolom. Voeg vervolgens, terwijl het natriumhydroxide wordt geabsorbeerd, 30 milliliter PBS toe aan de kolom en laat het doorspoelen.

Eenmaal klaar met alle monsters behoudt u de kolom voor later gebruik door 15 milliliter 0,05% natriumazide aan de kolom toe te voegen. Laat ongeveer vijf milliliter natriumazide achter op de bovenkant van de kolommatrix. Verwijder de kolom uit de AFC en bevestig de boven- en onderkappen voordat u de kolom op vier graden Celsius plaatst voor opslag.

Bouw de ultrafiltratie-eenheid. Verkrijg twee milliliter, drie kilodalton cutoff ultrafiltratie-eenheden per monster. Elke eenheid bestaat uit drie delen, kegel, filter en doorstroomcilinder.

Label elk onderdeel goed. Voeg een milliliter PBS toe aan het filtergedeelte en sluit af met het kegelstuk. Centrifugeer de kegel van de ultrafiltratie-eenheid op 3.500 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en verwijder de gefilterde PBS uit de stroom door de cilinder.

Draai de ultrafiltratie-eenheid ondersteboven en centrifugeer gedurende twee minuten bij 1000 G bij vier graden Celsius om eventuele resterende PBS te verwijderen. Combineer vier 500 microliter van elke fractie en voeg ze toe aan de ultrafiltratie-eenheid. Vervolgens vallen de centrifugekolommen een uur samen, 45 minuten bij 3.500 G bij vier graden Celsius of totdat het retentaatniveau op 100 microliter ligt.

Verwijder de stroom door de cilinder en gooi de stroom weg. Draai de ultrafiltratie-eenheid ondersteboven en centrifugeer twee minuten op 1000 XG bij vier graden Celsius. Breng het retentaat in de kegel over in een buis van 1,5 milliliter en maak het monstervolume tot 150 microliter met 0,22 micron gefilterd PBS voordat u de buizen in de vriezer van min 80 graden Celsius plaatst.

Een representatief westelijk blok van individuele fracties vertoonde een sterke expressie van CD9, CD63 en CD81. Overtredingen één tot vier met weinig of geen expressie overtredingen vijf tot acht. In geen enkele fractie werd een expressie van GM130 of calnexin waargenomen.

Albumine was alleen aanwezig in de fracties zes tot en met acht. De effectiviteit van het concentreren van de EV- en eiwitfracties werd ook geëvalueerd. Expressie van CD9 en CD63 werd waargenomen in de cellysaten.

Alle drie de CD-eiwitten waren aanwezig in EV-fracties van controle- en tunicamycine behandelde monsters, maar niet in de eiwitfracties. Het tumorgevoeligheidsgen 101 was aanwezig in cellysaten, maar niet in EV- of eiwitfracties. De GM130 en calnexin werden alleen waargenomen in de cellysaten.

In de western blot van exosoom uitgeputte celkweekmedia waren de EV-markers aanwezig in de cellysaten, maar niet in de mediamonsters. Albumine-expressie werd waargenomen in de eiwitfracties en minimale expressie in de cellysaten. TEM-waarnemingen toonden bolvormige structuren aan in de EV-fracties van met controle en tunicamycine behandelde monsters.

Deze structuren werden niet waargenomen in beide eiwitfracties van het monstertype. Nanodeeltjes tracking analyse onthult verschillen in deeltjesconcentraties van controle en behandelde fracties in EV fracties in vergelijking met de controle, iets meer deeltjes waren aanwezig in de tunicamycine behandeling. In de eiwitfracties werden echter minder deeltjes gedetecteerd ten opzichte van EV's.

Het is belangrijk om hetzelfde monstervolume te hebben voor de controle- en behandelde omstandigheden, waardoor EV's van de verschillende behandelingen eenvoudig kunnen worden vergeleken. Na het scheiden van EV's van de condition cell culture media kunnen we het eiwit-, RNA- en lipidegehalte van de blaasjes karakteriseren met proteomics RNA sequencing en lipidomics.