Name: Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer grootte-uitsluitingschromatografie om extracellulaire blaasjes te scheiden van geconditioneerde celkweekmedia. Deze methode maakt analyse van vesiculair vracht en onderzoek naar intercellulaire communicatiemechanismen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Penn State Behrend en de Hamot Health Foundation bedanken voor financiering, evenals de Penn State Microscopy Facility in University Park, PA.

<ol><li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li>
<li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).</li>
<li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li>
<li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+functionality%2C+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).</li>
<li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li>
<li>Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+heterogeneity%3A+Subpopulations%2C+isolation+techniques%2C+and+diverse+functions+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).</li>
<li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples%3A+Considerations+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Gámez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles%27+characteristics+compared+to+precipitating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).</li>
<li>Williams, R. L., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).</li>
<li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications%2C+ultrafiltration%2C+and+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).</li>
<li>Onódi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

SEC is een gebruiksvriendelijke methode om EV's adequaat te scheiden van geconditioneerde CCM. Om specifiek van cellen afgeleide EV's te isoleren, moet zorgvuldig rekening worden gehouden met het type CCM en de supplementen ervan. Veel celkweekmedia moeten worden aangevuld met FBS, dat EV's bevat die zijn afgeleid van het dier waarin het serum is geoogst. Deze serum-EV's kunnen elk signaal dat wordt geproduceerd door EV's afkomstig van cellen in cultuur verzadigen en maskeren26. Daarom moet bij he...

De explosie van interesse in het bestuderen van extracellulaire blaasjes (EV's) is gepaard gegaan met grote vooruitgang in de technologieën en technieken die worden gebruikt om deze nanogrote, heterogene deeltjes te scheiden en te bestuderen. In de tijd sinds hun ontdekking bijna vier decennia geleden 1,2, zijn deze kleine vliezige structuren gevonden om bioactieve lipiden, nucleïnezuren en eiwitten te bevatten en een belangrijke rol te spelen in intercellulaire communicatie 3,4. EV's komen vrij uit alle celtypen en zijn daarom aanwezig in alle biologische vloeistoffen, inclusief bloedplasma en serum, speeksel en urine. EV's in deze vloeistoffen houden een grote belofte in om te dienen als niet-invasieve biomarkers voor verschillende ziekten, waaronder neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten, kankers en auto-immuunziekten 5,6,7. Verder kunnen in vitro mechanistische studies worden uitgevoerd door middel van celkweektechnieken door EV's te scheiden die vrijkomen in het kweekmedium 3,8,9.
Om de rol van EV's in de pathofysiologie van ziekten te begrijpen, is een adequate scheiding van de vloeistof waarin ze worden aangetroffen van het grootste belang. De gouden standaard voor EV-scheiding is al lang differentiële ultracentrifugatie (dUC)10, maar er zijn meer geavanceerde technieken ontstaan om een betere scheiding van EV's van andere extracellulaire componenten te bereiken. Sommige van deze technieken omvatten dichtheidsgradiënten, asymmetrische-flow veldstroomfractie (A4F), flowcytometrie, immunocapture, polyethyleenglycolprecipitatie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)11,12,13. Elke techniek heeft zijn eigen voor- en nadelen; van SEC in het bijzonder is echter aangetoond dat het EV's vrij effectief scheidt van zowel biologische vloeistoffen als supernatanten van celkweek 8,14,15. SEC heeft ook de toegevoegde bonus dat het relatief eenvoudig en gebruiksvriendelijk is.
SEC is een methode die componenten van een vloeistof scheidt op basis van grootte. Met deze techniek wordt een kolom hars (in eigen huis gemaakt of commercieel gekocht) gebruikt om een monster te fractioneren. Kleine deeltjes in het monster komen vast te zitten tussen de kralen in de hars, terwijl grotere deeltjes vrijer door de hars kunnen gaan en dus eerder in het proces kunnen elueren. Omdat EV's groter zijn dan veel extracellulaire eiwitten en eiwitaggregaten, passeren EV's sneller de kolom en elueren ze in eerdere fracties dan extracellulaire eiwitten14.
In dit methodepaper wordt het gebruik van SEC voor scheiding van EV's van celkweekmedia (CCM) van menselijke oligodendrocyten onder zowel controle- als endoplasmatisch reticulum (ER) stressomstandigheden geschetst. Met behulp van dit protocol wordt aangetoond dat EV's gescheiden met deze techniek worden gevonden in specifieke fracties die kunnen worden samengevoegd en geconcentreerd voor downstream karakterisatie, en dat de gescheiden EV's zijn afgeleid van cellen en niet van een exogene bron zoals foetaal runderserum (FBS) dat wordt gebruikt om de CCM aan te vullen. De aanwezigheid van de canonieke EV-markers, CD63, CD81 en CD9 16,17,18,19 in de EV-fracties, en hun afwezigheid in de eiwitfracties wordt aangetoond met western blotting. Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) worden EV's gevisualiseerd en geven ze de verwachte morfologie weer en worden ze alleen waargenomen in de EV-fractie. Deeltjes worden ook geteld in de EV- en eiwitfracties van zowel controle- als ER-stressomstandigheden, en een groot aantal deeltjes binnen het verwachte groottebereik van 50-200 nm in diameter wordt waargenomen in de EV-monsters. Samen ondersteunen deze gegevens het idee dat SEC een efficiënte en effectieve methode is voor het scheiden van EV's van celkweekmedia.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>97064-588</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC900308</td><td>3 kDa cutoff</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit met Ultracel-3 membraan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC200324</td><td>3 kDa cutoff</td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7074V</td><td>1:1000 Dilutie</td></tr><tr><td>Anti-Calnexin antilichaam</td><td>Abcam</td><td>&nbsp;ab22595</td><td>1:500 Dilutie</td></tr><tr><td>Anti-CD9 Muis Monoklonaal Antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>312102</td><td>1:500 Dilutie</td></tr><tr><td>Anti-GM130 antilichaam [EP892Y] - cis-Golgi Marker</td><td>Abcam</td><td>ab52649</td><td>1:500 Dilutie</td></tr><tr><td>Anti-muis IgG, HRP-gekoppeld Antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076V</td><td>1:1000 Dilutie</td></tr><tr><td>Automatische Fractie Collector</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA assay Kit</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Gatan Orius SC200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cd63 Muis anti Humaan</td><td>BD</td><td>556019</td><td>1:1000 Dilutie</td></tr><tr><td>CD81 Antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23962</td><td>1:1000 Dilutie</td></tr><tr><td>Cellstar Filter Cap Cell Cultuur Flacons</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imager</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substraat</td><td>BioRad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Hoge glucose met L-glutamine; zonder natrium</td><td>Cytiva</td><td>SH300022.FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum Premium kwaliteit</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum, exosome-vrij</td><td>Thermo Scientific</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Great Value Vetvrij Droge Melk</td><td>Amazon</td><td>B076NRD2TZ</td><td></td></tr><tr><td>HOG Humane Oligodendroglioma Cellijn</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC163</td><td></td></tr><tr><td>Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol >99.8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Glas platen</td><td>BioRad</td><td>1653310</td><td>met 0.75mm ruimtes</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Korte platen</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine, Oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP66150</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kits en Reagentia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Pierce PVDF Transfer Membranes</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Western Blotting Filter Papier</td><td>Thermo Scientific</td><td>84783</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethyleen-20 (TWEEN 20), 500mL</td><td>Bio Basic</td><td>TB0560</td><td></td></tr><tr><td>Protease/fosfatase Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5872S</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Anti-TSG101 antilichaam [EPR7130(B)]</td><td>ABCam</td><td>ab125011</td><td>1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Slodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SX0603</td><td></td></tr><tr><td>Natrium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natrium dodecylsulfaat,&ge;99.0% (GC), stofvrije korrels</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethyleendiamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%</td><td>BioRad</td><td>1610183</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie Elektronenmicroscoop</td><td>FEI Tecnai 12 Biotwin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 0.25% protease met varkens trypsine, HBSS, EDTA; zonder calcium, magnesium</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Tunicamycine</td><td>Tocris</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Zeta View software</td><td>Analytik</td><td></td><td>NTA software</td></tr></tbody></table>

grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn nano-sized lipide-membraan gebonden structuren die vrijkomen uit alle cellen, aanwezig zijn in alle biovloeistoffen en eiwitten, nucleïnezuren en lipiden bevatten die een weerspiegeling zijn van de moedercel waaruit ze zijn afgeleid. Een goede scheiding van EV's van andere componenten in een monster maakt karakterisering van hun bijbehorende lading mogelijk en geeft inzicht in hun potentieel als intercellulaire communicatoren en niet-invasieve biomarkers voor tal van ziekten. In de huidige studie werden van oligodendrocyten afgeleide EV's geïsoleerd uit celkweekmedia met behulp van een combinatie van state-of-the-art technieken, waaronder ultrafiltratie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) om EV's te scheiden van andere extracellulaire eiwitten en eiwitcomplexen. Met behulp van in de handel verkrijgbare SEC-kolommen werden EV's gescheiden van extracellulaire eiwitten die vrijkwamen uit menselijke oligodendroglioomcellen onder zowel controle- als endoplasmatisch reticulum (ER) stressomstandigheden. De canonieke EV-markers CD9, CD63 en CD81 werden waargenomen in fracties 1-4, maar niet in fracties 5-8. GM130, een eiwit van het Golgi-apparaat, en calnexin, een integraal eiwit van de ER, werden gebruikt als negatieve EV-markers en werden in geen enkele fractie waargenomen. Verder werd bij het poolen en concentreren van fracties 1-4 als de EV-fractie en fracties 5-8 als de eiwitfractie expressie van CD63, CD81 en CD9 in de EV-fractie waargenomen. De expressie van GM130 of calnexin werd niet waargenomen in een van de fractietypen. De gepoolde fracties van zowel controle- als ER-stresscondities werden gevisualiseerd met transmissie-elektronenmicroscopie en blaasjes werden waargenomen in de EV-fracties, maar niet in de eiwitfracties. Deeltjes in de EV en eiwitfracties van beide omstandigheden werden ook gekwantificeerd met nanodeeltjes tracking analyse. Samen tonen deze gegevens aan dat SEC een effectieve methode is voor het scheiden van EV's van geconditioneerde celkweekmedia.

Western blotting onthult adequate scheiding van EV's van CCM Om de effectiviteit van SEC voor het scheiden van EV's van celkweekmedia te evalueren, werd een western blot uitgevoerd met behulp van elke afzonderlijke fractie uit de controlemonsters om de expressie van de drie canonieke EV-markers, CD9, CD63 en CD81, evenals GM130 en calnexin18, die werden gebruikt als negatieve controles te onderzoeken (figuur 3). Albumine-expressie...

Het protocol hier toont aan dat extracellulaire blaasjes adequaat kunnen worden gescheiden van geconditioneerde celkweekmedia met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie.

Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

Scheiding van extracellulaire blaasjes van vloeistoffen zoals conditiecelkweekmedia kan onderzoekers in staat stellen vesticulaire lading te karakteriseren en hun intracellulaire communicatiemechanismen te verkennen. Deze techniek zorgt voor voldoende scheiding van EV's en extracellulaire eiwitten van geconditioneerde celkweekmedia die eenvoudig en gebruiksvriendelijk is. Om te beginnen plaats PBS in een waterbad van 37 graden Celsius.Observeer de controle en tunicamycine behandelde celkweekkolven onder een samengestelde microscoop met een 10 x en 100 x objectieflens. Noteer eventuele verschillen tussen de kolven. Haal het medium uit de kolf en plaats het in een buisje van 50 milliliter.Centrifugeer vervolgens de buis op 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden celsius en breng de super natant over naar een nieuwe buis. Centrifugeer de buis bij 2000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Breng de super natant over in een nieuwe buis en plaats de buis op ijs.Neem vier 15 milliliter drie kilodalton cutoff ultrafiltratie-eenheden en voeg vijf milliliter PBS toe aan elke buis. Bereid de filters voor door de units gedurende 10 minuten op vier graden Celsius op 4.000 G te centrifugeren. Nadat u PBS uit de eenheden hebt verwijderd, verdeelt u het supernatant van de controle- en behandelingsomstandigheden in twee ultrafiltratie-eenheden met elk ongeveer 12,5 milliliter media in elk.Centrifugeer de buizen bij 4.000 G gedurende één uur en 45 minuten bij vier graden Celsius of totdat het geconcentreerde medium of retentaat in elke eenheid is geconcentreerd tot 250 microliter of minder. Breng het retentaat van beide regeleenheden over in een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en van behandelde eenheden in een andere buis. Meet het totale volume van het retentaat in elke microcentrifugebuis.Als het volume kleiner is dan 500 microliter, voegt u 0,22 micron gefilterd PBS toe totdat het uiteindelijke volume 500 microliter is. Plaats buisjes in een vriezer van min 80 graden Celsius. Schakel de automatische breukcollector of AFC in.Verwijder de kolom van vier graden celsius en laat de kolom opwarmen tot kamertemperatuur. Verwijder retentatemonsters uit de min 80 graden Celsius vriezer en leg ze op ijs om te ontdooien, terwijl je wacht, zet acht gelabelde 1,5 milliliter buizen in de AFC-carrousel met deksels naar binnen gericht. Plaats de kolom in de AFC met de streepjescode naar de lezer gericht en pas de instellingen aan om acht fracties van elk 500 microliter te verzamelen en het buffervolume naar standaard.Controleer vervolgens de instructies op het scherm om de verzameling te starten. Nadat de opslagbuffer volledig is opgenomen in het bovenste gedeelte van de kolommatrix. Begin met het spoelen van de kolom door 15 milliliter PBS aan de kolom toe te voegen.Voeg PBS niet te vroeg toe, omdat dit de opslagbuffer verdunt en voldoende spoeling voorkomt. Net voordat alle 15 milliliter PBS door de matrix wordt geabsorbeerd, klikt u op oke om het spoelen te stoppen en eventuele resterende PBS van de bovenkant van de kolommatrix te verwijderen met een micropipet. Raak de matrix niet aan.Voeg 500 microliter monster toe aan het midden van de kolom en klik op OK om de run te starten. Nadat het monster volledig in de matrix is opgenomen, voegt u onmiddellijk acht milliliter PBS toe aan de kolom. AFC disstoot automatisch het lege volume in het midden van de carrousel voordat alle acht fracties van elk 500 microliter worden verzameld.Verwijder na de run fracties uit de carrousel en plaats ze op ijs. Verwijder vervolgens het lege volume uit het midden van de carrousel. Voeg vervolgens 10 milliliter PBS toe aan de kolom om het resterende monster uit de kolom te wassen.En zodra het berouwvolle monster volledig is gespoeld, voegt u 15 milliliter PBS toe aan de kolom. Terwijl de uiteindelijke PBS door de matrix wordt geabsorbeerd, voegt u 500 microliter 0,5 molair natriumhydroxide toe aan het midden van de matrix van de kolom. Voeg vervolgens, terwijl het natriumhydroxide wordt geabsorbeerd, 30 milliliter PBS toe aan de kolom en laat het doorspoelen.Eenmaal klaar met alle monsters behoudt u de kolom voor later gebruik door 15 milliliter 0,05% natriumazide aan de kolom toe te voegen. Laat ongeveer vijf milliliter natriumazide achter op de bovenkant van de kolommatrix. Verwijder de kolom uit de AFC en bevestig de boven- en onderkappen voordat u de kolom op vier graden Celsius plaatst voor opslag.Bouw de ultrafiltratie-eenheid. Verkrijg twee milliliter, drie kilodalton cutoff ultrafiltratie-eenheden per monster. Elke eenheid bestaat uit drie delen, kegel, filter en doorstroomcilinder.Label elk onderdeel goed. Voeg een milliliter PBS toe aan het filtergedeelte en sluit af met het kegelstuk. Centrifugeer de kegel van de ultrafiltratie-eenheid op 3.500 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en verwijder de gefilterde PBS uit de stroom door de cilinder.Draai de ultrafiltratie-eenheid ondersteboven en centrifugeer gedurende twee minuten bij 1000 G bij vier graden Celsius om eventuele resterende PBS te verwijderen. Combineer vier 500 microliter van elke fractie en voeg ze toe aan de ultrafiltratie-eenheid. Vervolgens vallen de centrifugekolommen een uur samen, 45 minuten bij 3.500 G bij vier graden Celsius of totdat het retentaatniveau op 100 microliter ligt.Verwijder de stroom door de cilinder en gooi de stroom weg. Draai de ultrafiltratie-eenheid ondersteboven en centrifugeer twee minuten op 1000 XG bij vier graden Celsius. Breng het retentaat in de kegel over in een buis van 1,5 milliliter en maak het monstervolume tot 150 microliter met 0,22 micron gefilterd PBS voordat u de buizen in de vriezer van min 80 graden Celsius plaatst.Een representatief westelijk blok van individuele fracties vertoonde een sterke expressie van CD9, CD63 en CD81. Overtredingen één tot vier met weinig of geen expressie overtredingen vijf tot acht. In geen enkele fractie werd een expressie van GM130 of calnexin waargenomen.Albumine was alleen aanwezig in de fracties zes tot en met acht. De effectiviteit van het concentreren van de EV- en eiwitfracties werd ook geëvalueerd. Expressie van CD9 en CD63 werd waargenomen in de cellysaten.Alle drie de CD-eiwitten waren aanwezig in EV-fracties van controle- en tunicamycine behandelde monsters, maar niet in de eiwitfracties. Het tumorgevoeligheidsgen 101 was aanwezig in cellysaten, maar niet in EV- of eiwitfracties. De GM130 en calnexin werden alleen waargenomen in de cellysaten.In de western blot van exosoom uitgeputte celkweekmedia waren de EV-markers aanwezig in de cellysaten, maar niet in de mediamonsters. Albumine-expressie werd waargenomen in de eiwitfracties en minimale expressie in de cellysaten. TEM-waarnemingen toonden bolvormige structuren aan in de EV-fracties van met controle en tunicamycine behandelde monsters.Deze structuren werden niet waargenomen in beide eiwitfracties van het monstertype. Nanodeeltjes tracking analyse onthult verschillen in deeltjesconcentraties van controle en behandelde fracties in EV fracties in vergelijking met de controle, iets meer deeltjes waren aanwezig in de tunicamycine behandeling. In de eiwitfracties werden echter minder deeltjes gedetecteerd ten opzichte van EV's.Het is belangrijk om hetzelfde monstervolume te hebben voor de controle- en behandelde omstandigheden, waardoor EV's van de verschillende behandelingen eenvoudig kunnen worden vergeleken. Na het scheiden van EV's van de condition cell culture media kunnen we het eiwit-, RNA- en lipidegehalte van de blaasjes karakteriseren met proteomics RNA sequencing en lipidomics.

size-exclusion-chromatography-for-separating-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Watson, D. C., et al. Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the use of size exclusion chromatography with porous resin beads to isolate bacterial extracellular vesicles (EVs) from a bacterial culture filtrate. Larger EVs elute early by bypassing the resin pores, while smaller proteins enter the pores and elute later.

Isolation of Bacterial Extracellular Vesicles Using Size-Exclusion Chromatography 

This video describes a method based on size-exclusion chromatography (SEC) to isolate extracellular vesicles or EVs derived from the brain immune cells―the microglia. The EVs act as molecular cargo to deliver mediators, which regulate an immune response. Therefore, the isolated EVs can be used as an in vitro model to study the microglia-neuron crosstalk during a neuronal immune response.

SEC-based Isolation of Microglia-derived Extracellular Vesicles: A Technique to Isolate Extracellular Vesicles from Microglia Conditioned Culture Media

This video demonstrates the density gradient ultracentrifugation-based purification method to isolate subpopulations of extracellular vesicles suitable for characterization studies.

Purification of Subpopulations of Extracellular Vesicles: A Technique to Purify Subpopulations of Extracellular Vesicles Using Density Gradient Ultracentrifugation

In this video, we demonstrate a technique–size exclusion chromatography–to separate a heterogenous population of outer membrane vesicles or OMVs derived from bacteria. These vesicles are nanosized spherical structures and are separated into large and small subpopulations based on their size through Size Exclusion Chromatography.

Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A Technique to Separate Heterogenous Population of Gram-Negative Bacterial Outer Membrane Vesicles Based on Their Size

This video demonstrates the size exclusion chromatography (SEC) technique for purifying bacterial extracellular vesicles (EVs) from the culture filtrate of Mycobacterium tuberculosis (Mtb). The technique utilizes a porous resin-packed column to obtain purified fractions of EVs. The porous particles selectively allow smaller proteins to enter the pores, resulting in slower elution. At the same time, EVs are excluded from entering the pores due to their larger size and are eluted first.

A Size Exclusion Chromatography Technique to Purify Mycobacterial Extracellular Vesicles

Dit artikel presenteert methoden voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van Caenorhabditis elegans extracellulaire blaasjes.

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

Bacteriële blaasjes spelen een belangrijke rol bij pathogenese en hebben veelbelovende biotechnologische toepassingen. De heterogeniteit van blaasjes bemoeilijkt analyse en gebruik; daarom is een eenvoudige, reproduceerbare methode nodig om verschillende groottes van blaasjes te scheiden. Hier demonstreren we het gebruik van grootte-uitsluitingschromatografie om heterogene blaasjes geproduceerd door Aggregatibacter actinomycetemcomitanste scheiden .

Grootte uitsluiting chromatografie om bacteriële buitenste membraanblaasje heterogeniteit te analyseren

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Extracellulaire blaasjes zijn veelbelovend voor biomedische toepassingen, maar de huidige isolatiemethoden zijn tijdrovend en onpraktisch voor klinisch gebruik. In deze studie presenteren we een microfluïdisch apparaat dat de directe isolatie van extracellulaire blaasjes uit grote hoeveelheden biovloeistoffen op een continue manier met minimale stappen mogelijk maakt.

Isolatie in één stap van extracellulaire blaasjes uit monsters met een groot volume met een gespleten A4F-microfluïdisch apparaat

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het sorteren van extracellulaire blaasjes (EV's) die vrijkomen door mesenchymale stromale cellen. Het richt zich met name op de instelling van het instrument en de optimalisatie van de sorteeromstandigheden. Het doel is om extracellulaire blaasjes te sorteren met behoud van hun kenmerken.

Een succesvolle sortering instellen voor extracellulaire isolatie van blaasjes

Dit protocol beschrijft de isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg met behulp van enzymatische vertering en grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor reproduceerbare terugwinning van vesikelverrijkte fracties uit structureel complexe, laagopbrengstweefsels mogelijk is voor downstream moleculaire analyse.

Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie

Leer grootte-uitsluitingschromatografie om extracellulaire blaasjes te scheiden van geconditioneerde celkweekmedia. Deze methode maakt analyse van vesiculair vracht en onderzoek naar intercellulaire communicatiemechanismen mogelijk.

Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia

Meer video's verkennen