Isolatie, uitbreiding en differentiatie van mesenchymale stamcellen uit de infrapatellaire vetpad van de geitenstikkingsverbinding

Infrapatellar Fat Pad-afgeleide Mesenchymale Stamcellen, of kortweg IFP-MSC's, is een relatief minder bestudeerd stamceltype. Dit protocol is een eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode die de isolatie van IFP-MSC's van geitenstikselassets aantoont. Het grote voordeel van de techniek is dat een groot aantal hoogwaardige IFP-MSC's kan worden verkregen.

Geïsoleerde IFP-MSC's kunnen zich onderscheiden in meerdere afstammingslijnen en beschikken over een uitgebreid regeneratief potentieel. Vanwege hun anatomische locatie hebben IFP-MSC's interesse gekregen in het repareren van kraakbeendefecten en het verlichten van kraakbeendegradatie bij artrose. De methode heeft implicaties voor celgebaseerde therapie op het gebied van tissue engineering en regeneratieve geneeskunde.

De procedure voor isolatie, uitbreiding en differentiatie van IFP-MSC's zal worden gedemonstreerd door Dr. Sugata Hazra en Mr.Aman Mahajan. Om te beginnen met de isolatie van Infrapatellar Fat Pad Mesenchymale Stamcellen, of IFP-MSC's, verzamelt u geiten femorotibiale gewrichten die ongeveer 15 centimeter van de femorale en tibiale gebieden van de achterpoten omvatten in een gesteriliseerde verzamelmonsterdoos. Bewaar het monster bij vier graden Celsius voor transport naar het laboratorium voor verdere verwerking.

Plaats het monster op een petrischaaltje van 150 millimeter en zorg ervoor dat het monster tijdens de hele procedure aseptisch en een bioveiligheidskast wordt verwerkt. Spoel het grondig af met geautoclaveerde PBS aangevuld met antibiotica. Houd het monster gehydrateerd met PBS.

Onderzoek zorgvuldig de anatomische gebieden van het monster. Voor gemakkelijke toegang verwijdert u de extra weefsels van beide lange botten volledig door het eindoppervlak van het dijbeen met één hand vast te houden en het in de lengterichting naar het gewricht te snijden met een scherpe schaar. Verwijder vervolgens, zonder het weefsel rond het gewrichtskapsel te verstoren, de spieren en het vetweefsel uit het bot.

Maak op dezelfde manier nog een incisie aan het tibiale uiteinde van het monster en verwijder de spieren en het vetweefsel uit het tibiale bot. Zorg ervoor dat beide lange botten volledig bloot zijn en dat het gewrichtskapsel zichtbaar is. Maak vervolgens een incisie aan weerszijden van het synoviale membraan om het knikgewricht open te snijden.

Knip de patella los van het synoviale membraan en de patellabanden met behulp van verse gesteriliseerde scharen en tangen. Plaats de afgescheiden patella onmiddellijk in een petrischaal met PBS. Verwijder van de gescheiden patella het volledige vetkussen dat op het binnenoppervlak aanwezig is met een schaar en een tang.

Verzamel het in een andere verse petrischaal en hak het fijn met een scalpel. Neem andere chirurgische hulpmiddelen op om de kleine vetsegmenten van ongeveer twee tot drie millimeter te verkrijgen. Gebruik een spatel om het gehakte weefsel over te brengen naar een centrifugebuis van 50 milliliter en was het driemaal met PBS aangevuld met antibiotica gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een reageerbuismixer.

Voor enzymatische spijsvertering incubeer je ongeveer vijf gram van het gehakte weefsel in Dulbecco's Modified Eagle Media, of DMEM, laag-glucose media met 1,5 milligram per milliliter type II collagenase en 2% FBS bij 37 graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur. Zuig het verteerde weefsel zorgvuldig op en filter het door een celzeef van 70 micron om onverteerde delen te verwijderen. Centrifugeer het filtraat in een centrifugebuis van 15 milliliter bij 150 maal g gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant voordat u de celpellet tweemaal met DMEM-laag glucose wast. Suspensie de pellet opnieuw in volledige DMEM, ook wel expansiemedia genoemd. Zaai de cellen op een petrischaaltje van 150 millimeter en kweek ze in de expansiemedia aangevuld met vijf nanogram per milliliter Basic Fibroblast Growth Factor, of BFGF, en 50 microgram per milliliter 2-Phospho-L-ascorbinezuur trinatriumzout.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-incubator om de cellen te laten hechten en prolifereren. Controleer dagelijks de aanhechting en groei van de cellen. Voor goed onderhoud en uitbreiding van de IFP-MSC's, verwissel de media om de drie dagen.

Voeg tijdens het veranderen van de media verse vijf nanogram per milliliter BFGF en 50 microgram per millimeter 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout rechtstreeks toe aan de petrischaal. Zodra de cellen 80% tot 90% confluent worden, subcultureer ze door de expansiemedia uit de petrischaal te verwijderen en de cellen te wassen met 1X PBS. Voeg vervolgens vier milliliter van 0,25% Trypsine-EDTA toe aan het gerecht en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-incubator.

Tik na vier minuten op de plaat op zijn kant om de cellen los te maken. Bevestig het volledige loslaten van alle cellen onder een microscoop. Eenmaal bevestigd, voeg een gelijk volume expansiemedia toe om het trypsine te neutraliseren.

Gebruik een pipet om deze gedissocieerde cellen te verzamelen in een verse polypropyleenbuis van 15 milliliter en centrifugeer ze bij 150 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in het gewenste volume expansiemedia. Tel de cellen met behulp van de standaard celtelmethode en subcultureer ze voor verdere expansie met een zaaidichtheid van 10.000 cellen per vierkante centimeter in een petrischaaltje van 150 milliliter.

Gebruik voor alle testen een confluente monolaag van cellen met passagenummer P2 tot P5. Wanneer de geëxpandeerde cellen 80% tot 90% confluency bereiken, dissocieert u de cellen met behulp van trypsine-EDTA-oplossing voordat u ze gedurende vijf minuten in een centrifugebuis van 15 milliliter op 150 keer g pelleteert. Resuspendeer de pellet vervolgens in geitenplasma met een dichtheid van 2 miljoen cellen per 50 microliter. Voeg 50 microliter plasma met de cellen toe aan een gesteriliseerde petrischaal van 90 millimeter, gevolgd door de toevoeging van calciumchloride in een eindconcentratie van 0,3% Meng goed om verknoopte plasmahydrogel te fabriceren.

Breng na het incuberen van de gefabriceerde hydrogel op 37 graden Celsius gedurende 40 minuten de hydrogels over op 24-well weefselkweekplaten met chondrogene media. Verander de media elke drie dagen gedurende 14 dagen. De hydrogels gekweekt in complete DMEM-media zonder TGF-beta 1 worden beschouwd als niet-geïnduceerde controles.

Na 14 dagen chondrogene differentiatie van cellen in plasmahydrogel, wast u de hydrogels driemaal met PBS gedurende elk vijf minuten en fixeert u de monsters gedurende drie uur in neutraal gebufferd formaline. Geïsoleerde IFP-MSC's waren homogeen aanhangend en bereikten langwerpige morfologie binnen 24 uur na in vitro kweek. De cellen vermenigvuldigden efficiënt 80% tot 90% confluency binnen zes dagen na expansie en vertoonden clonogene capaciteit, wat wijst op efficiënte proliferatieve en zelfvernieuwingscapaciteiten.

Wanneer behandeld om te differentiëren in adipogene afstamming, produceerden de geïsoleerde cellen lipidedruppels, wat werd bevestigd door Oil Red O-kleuring op dag 14 en 21. Dergelijke oliedruppels waren niet zichtbaar in de cellen zonder adipogene inducerende factoren. De geïsoleerde cellen ingekapseld in plasmahydrogel toonden de vorming van wit en glanzend neoweefsel na 14 dagen in de geïnduceerde groep vertoonde het chondrogene potentieel.

De niet-geïnduceerde groep had bleek wit weefsel met verminderde glans. Bovendien gaf positieve histologische kleuring voor Alcian Blue en Safranin O in de geïnduceerde groep aan dat de cellen gesulfateerde glycosaminoglycanen konden afscheiden, een van de belangrijkste componenten van de kraakbeenmatrix. Daarentegen waren de hydrogelsecties van de niet-geïnduceerde groepen negatief voor Safranin O- en Alcian Blue-kleuring, wat het chondrogene differentiatiepotentieel van de mesenchymale stamcellen alleen in de aanwezigheid van chondrogene stimuli bevestigt.

De geïsoleerde cellen geïnduceerd met osteogene media vertoonden positieve kleuring voor alkalische fosfatase, wat mineralisatie aan het einde van 14 dagen bevestigde. Na 28 dagen osteogene inductie werden de verkalkte afzettingen waargenomen met Alizarine Red S-kleuring. De resultaten onderstreepten het differentiatiepotentieel van geïnduceerde cellen in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen.

Het is essentieel om het monster onder aseptische omstandigheden te verwerken om besmetting te voorkomen. Het is ook belangrijk om de juiste locatie van de patella te identificeren. Deze procedure opent de weg om verschillende celtypen te isoleren, zoals gewrichtschorndrocyten, ligamentfibroblasten en stamcellen uit synovium en synoviale vloeistof, met brede toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.

Na isolatie van IFP-MSC's met behulp van deze techniek, werd de effectiviteit ervan met name onderzocht voor regeneratie van musculoskeletale weefsels, zoals kraakbeen, bot en ligament met behulp van steiger- en steigervrije benaderingen.