Voorbereiding en karakterisering van op grafeen gebaseerde 3D biohybride hydrogel bioink voor perifere neuro-engineering

Het stamcelsysteem staat onder invloed van zijn belangrijke componenten. Het behoud en de differentiatie van stamcellen is ondenkbaar zonder de aanwezigheid van hun micro-omgeving. Deze micro-omgeving, stamcelniche genaamd, bestaat uit cellen en steigers.

Perifere neuropathie kan zijn en af en toe, ze kunnen zoals letsel aan de brachii plexus, verschillende trauma's, tumor, autonome anomalieën, immuundefinitie, en metabole ziekte. Er zijn verschillende 3D-kweekmethoden ontwikkeld om een betere en meer natuurlijke niche voor de stamcellen te bieden. Sferoïdevorming en 3D-bioprinting zijn relatief nieuwe en veelbelovende methoden voor 3D-culturen.

3D-bioprinting kan ook worden gebruikt in neuro-engineering studies. Daarom werden binnen deze studie bioinks op basis van grafeen en alginaat / gelatine ontwikkeld en bestudeerd op hun regeneratieve eigenschappen. Om te beginnen, kweek Wharton's gelei mesenchymale stamcellen of WJMSC's in DMEM F12-medium met 10% foetaal kalfsserum of FBS, 1% pen / streptokokken en 1% L-glutamine onder een steriele laminaire stroom bij kamertemperatuur.

Wanneer de gekweekte cellen voor 80% samenvloeien in de kolf, giet u het medium en wast u de cellen met vijf milliliter PBS. Voeg vervolgens vijf milliliter 0,25% trypsine en 2,21 millimolar natrium EDTA toe en incubeer bij 37 graden Celsius. Voeg na vijf minuten 10 milliliter DMEM F12-medium met 10% FBS toe aan de cellen.

Suspensie de cellen, verzamel het medium en breng het over naar een centrifugebuis. Centrifugeer vervolgens de cellen en gooi het supernatant weg voordat u de cellen opnieuw inzaait in een nieuwe kolf met een vers voedingsmedium dat 10% FBS bevat. Om de bioink van de controlegroep zonder grafeen te bereiden, weegt u 4,5 milligram alginaat en 1,5 milligram gelatine af en brengt u deze over naar een centrifugebuis.

Voeg vervolgens 50 milliliter DMEM F12-medium met 10% FBS toe aan de buis. Weeg nogmaals 4,5 milligram alginaat en 1,5 milligram gelatine af en breng ze over in een centrifugebuis. Voeg vervolgens 50 microliter 0,1% grafeen toe aan de buis en maak het volume 50 milliliter met DMEM F12-medium dat 10% FBS bevat.

Meng de bioinks door pipetteren en vortexen voor autoclaveren bij 121 graden Celsius onder 1,5. atmosferische druk gedurende 20 minuten. Na het autoclaveren centrifugeert u de oplossing om gevormde bellen te verwijderen en plaatst u de bioinks op 37 graden Celsius totdat de cellen zijn voorbereid.

Maak voor de celbioink-interactie de bioink-groepen. Groep één omvat 3D-B en 3D-G geprint met bioink voor bioprinting. Groep twee omvat 3D-BS en 3D-GS bioinks waarop sferoïden werden gevormd na bioprinting.

Tel voor groep één de cellen één bij 10 tot de zevende cel in 0,5 milliliter medium. Voeg vervolgens 4,5 milliliter bioink toe. Breng het mengsel met behulp van spuiten over naar de patronen in de steriele kast.

Installeer de cartridges in het overeenkomstige extrudergedeelte van de bioprinter. Neem voor de tweede groep vijf milliliter bioink van elk van de bioinkgroepen en breng ze over naar steriele patronen met behulp van een injector. Gebruik de bioprinter met twee coaxiale printkoppen en de pneumatisch aangedreven extrusietechnologie.

Stel de XYZ-resolutie per microstap in op 1,25 micrometer, de extrusiebreedte op 400 micrometer en de extrusiehoogte op 200 micrometer. Gebruik een raster van 20 bij 20 bij 5 millimeter om 3D-modellen te maken. Maak 3D-modellen met behulp van open source webgebaseerde CAD-programma's.

Stel voor het 3D-bioprintproces de gemiddelde druk van de printer in op 7,5 psi. Stel vervolgens de cartridge- en bedtemperatuur in op 37 graden Celsius en snelheid op 60%Plaats het systeem in de thuispositie tijdens de schrijffase. Plaats de assen automatisch en selecteer en stel de extruder in voordat u het bioprintproces start.

Verwijder na het afdrukken het monster en plaats het onder een laminaire flowkast. Spuit vervolgens de bioinks met 0,1 normale calciumchlorideoplossing of voeg een milliliteroplossing toe met een pipet bij kamertemperatuur en wacht 10 tot 20 seconden. Was vervolgens de geprinte patronen twee keer met PBS dat calcium en magnesium bevat.

Voeg twee milliliter DMEM F12-medium met 10% FBS toe aan de bovenkant van elke cel met bioink-groep en incuber de platen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens twee milliliter suspensiemedium met één bij 10 tot de zesde cellen toe aan elke groep en incuber de platen. Observeer en fotografeer na 24 uur alle batches bioink voor sferoïdevorming onder een omgekeerde microscoop voor WJMSC-differentiatie naar neuronachtige cellen, behalve voor de controlegroep.

Voeg twee milliliter neurogeen differentiatiemedium per put toe en ververs om de twee dagen. Volg gedurende zeven dagen om neurale differentiatie te observeren. Onderzoek vervolgens met behulp van timelapse-beeldvorming de effecten van grafeen op stamcellen en monitor celinteracties binnen de bioink.

Het effect van grafeenconcentratie op celproliferatie wordt hier aangetoond. In vergelijking met de controle werd een significante afname waargenomen voor de grafeenconcentratie van 0,001%. Er waren geen significante verschillen tussen de andere groepen en de controle.

De celgrafeeninteracties toonden aan dat grafeen werd getolereerd in het 2D-systeem en door de cellen werd ingenomen door middel van endocytose. Timelapse-beeldvorming toonde aan dat cellen die overleefden in het 3D-grafeenmedium hun vitaliteit behielden door GFP-helderheid tot het einde van de incubatie. SEM-beelden en FIIR-analyse van de 3D-B- en 3D-G-bioinkgroepen worden hier getoond.

Bioink-celinteracties werden zowel aan de oppervlakte als intern aangetoond. De cellen waren morfologisch rond en bevestigd aan het materiaal. Bij 3D-neuronale differentiatie werd aangenomen dat de grenzen van de sferoïde cellen in beide groepen transparant en levendig waren, en de sferoïden in de grafeengroep waren relatief groter en hielden het grafeen in de cel gevangen.

Immunostaining van 2D- en 3D-cellen wordt hier getoond. De groene afbeeldingen vertegenwoordigen neuronachtige structuren. Het 2D-positieve controlemonster vertoonde minder neuronachtige structuurmarkers dan de 3D-monsters.

We ontdekten dat op grafeen gebaseerde bioinks succesvoller waren in termen van differentiatie van stamcellen in neuronachtige cellen. We stellen voor dat op grafeen gebaseerde bioinks uitstekende hulpmiddelen zouden zijn voor de behandeling van perifere zenuwaandoeningen in verdere studies. Tegenwoordig kan het stamcelsysteem worden gecreëerd door tissue engineering met natuurlijke en synthetische biomaterialen De creatie van kunstmatige weefsels die levende weefsels kunnen vervangen die kunnen worden gebruikt bij de regeneratie van deze weefsels, het verwijderen van de schade en het bieden van functie wordt geleverd door tissue engineering.