Analyse van fecale microbiotadynamiek bij lupusgevoelige muizen met behulp van een eenvoudige, kosteneffectieve DNA-isolatiemethode
2 mei 2022
Dit protocol biedt een eenvoudige, kosteneffectieve DNA-isolatiemethode voor de analyse van veranderingen in de microbiota van de muizendarm tijdens de ontwikkeling van auto-immuunziekten.
De voorgestelde DNA-isolatiemethode kan dienen om de darmmicrobiotadynamiek in muismodellen voor auto-immuunziekten te bestuderen. Een meer veelzijdige, kosteneffectieve en efficiënte methode wordt voorgesteld om DNA te verkrijgen uit fecale monsters die vergelijkbaar zijn met commercieel verkrijgbare kits. Om te beginnen, neem elke muis afzonderlijk uit zijn kooi, verzamel een fecale pellet rechtstreeks uit de anus en bewaar deze bij min 80 graden Celsius totdat deze wordt verwerkt.
Verwerk de monsters met steriele en schone tangen, buizen en handschoenen. Voeg een bevroren pellet toe aan een vooraf gewogen, twee milliliter schroefdopbuis en noteer het fecale gewicht in grammen, dat tussen 0,02 en 0,05 gram per fecale pellet moet zijn. Voeg aan de pellet een dunne laag glasparels van 0,1 millimeter, 500 microliter lysisbuffer en 200 microliter 20% natriumdodecylsulfaat toe.
Bead klop de buis vier minuten in een homogenisator, gevolgd door drie tot vijf minuten vortexing. Centrifugeer de buizen voor een korte tijd om de bubbels en het schuim te elimineren. Om DNA uit de microbiotamonsters te extraheren, brengt u 350 microliter monstersupernatant over naar een nieuwe, 1,5 milliliter snapdopbuis, zonder vuil.
Voeg 500 microliter fenol:chloroform:isoamylalcohol toe, in een verhouding van 25:24:1, en vortex gedurende één minuut. Breng na centrifugatie 180 microliter van de bovenste waterige fase over in een nieuwe, 1,5 milliliter snap dopbuis. Voeg 180 microliter chloroform toe, keer om en meng.
Breng hieruit 180 microliter van de waterige fase over in een nieuwe snap-dopbuis. Voeg in een bioveiligheidskast 180 microliter koude isopropanol en 36 microliter vijf molaire ammoniumacetaat toe. Keer het een paar keer om om te mengen en plaats de buis gedurende 20 minuten op ijs.
Gooi het supernatant weg, gevolgd door de pellets meerdere keren te wassen met 500 microliter koude 70% ethanol. Gooi het supernatant weg en droog de buis ondersteboven op tissuepapier gedurende 20 minuten aan de lucht, totdat de pellet helder wordt. Suspensie de pellet in 50 microliter water van moleculaire kwaliteit en verwarm de vloeistof gedurende 10 minuten op 37 graden Celsius om grote DNA-pellets volledig op te lossen.
Na verhitting centrifugeer je deze buizen gedurende één minuut op 3.400 maal G om de condensdruppels uit het deksel terug te winnen. Meet de concentratie en verkrijg de 260/280-verhouding met behulp van een spectrofotometer. Een verhouding voor DNA van goede kwaliteit ligt over het algemeen tussen de 1,8 en twee.
Centrifugeer de bereide monsters op 600 maal G gedurende één minuut bij kamertemperatuur, voordat u gedurende 24 uur bij min 80 graden Celsius bevriest. Stuur vervolgens 20 microliter monsters met concentraties variërend van één tot 50 nanogram per microliter naar het Argonne National Laboratory voor sequencing. De muizenstam zonder de receptor CX3CR1 heeft een andere samenstelling van de darmmicrobiota in vergelijking met wild-type MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP-muizen, vertoont significante verschillen in bepaalde geslachten, relevant voor potentieel pathogene bacteriën zoals die in het phylum Proteobacteria.
Wees voorzichtig met het besmetten van het monster. Het moet steriel zijn. Ook is het belangrijk om nauwkeurig te pipetteren bij het overbrengen van het supernatant in een nieuwe buis.
Deze methode is geschikt voor moleculaire analyse zoals PCR, restrictie-enzymvertering of genomische bibliotheekconstructie. Bij lupus bewezen we een sterke relatie tussen de darmmicrobiota en lupusprogressie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol biedt een eenvoudige, kosteneffectieve methode voor DNA-isolatie voor de analyse van veranderingen in het muizendarmmicrobioom tijdens de ontwikkeling van auto-immuunziekten. De methode is ontworpen om de dynamiek van het darmmicrobioom in muismodellen van auto-immuunziekten te bestuderen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Microbiologie
- Auto-immuniteit
Achtergrond
- Het begrijpen van de darmmicrobiota is van cruciaal belang in het onderzoek naar auto-immuunziekten.
- Huidige methoden voor DNA-isolatie kunnen duur en complex zijn.
- Deze studie stelt een efficiënter en kosteneffectiever alternatief voor.
- Fecale monsters worden gebruikt om veranderingen in de microbiota te analyseren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor DNA-extractie uit fecesmonsters.
- Om de studie van de darmmicrobiota in modellen van auto-immuunziekten te faciliteren.
- Om de efficiëntie van de nieuwe methode te vergelijken met commercieel verkrijgbare kits.
Gebruikte methoden
- Individuele verzameling van fecespellets van muizen.
- Opslag van monsters bij -80 °C.
- Gebruik van steriele instrumenten voor monsterverwerking.
- Preparatie van monsters met lysisbuffer en glasparels.
Belangrijkste resultaten
- De voorgestelde methode levert een DNA-kwaliteit die vergelijkbaar is met die van commerciële kits.
- Het is kosteneffectief en efficiënt voor microbiota-analyse.
- Het faciliteert verder onderzoek naar de mechanismen van auto-immuunziekten.
Conclusies
- Deze DNA-isolatiemethode is een waardevol instrument voor onderzoekers.
- Het ondersteunt het onderzoek naar de darmmicrobiota in de context van ziekten.
- Het stimuleert toegankelijker onderzoek op het gebied van autoimmuniteit.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Betrouwbare analyse van de dynamiek van het darmmicrobioot in auto-immuunziektemodellen is essentieel voor het begrijpen van de omgevings- en genetische bijdragen aan de progressie van de ziekte. Dit kosteneffectieve DNA-isolatieprotocol maakt schaalbare, reproduceerbare extractie van microbieel DNA uit fecale muizenmonsters mogelijk, wat high-throughput microbioomstudies in preklinisch onderzoek ondersteunt. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen bij het koppelen van verschuivingen in het microbioom aan auto-immuunfenotypen, wat bijdraagt aan vroege ontdekking en translationele strategieën.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om interacties tussen het microbioom en het immuunsysteem te onderzoeken in ziekterelevante muismodellen.
- Ondersteunt de functionele validatie van kandidaat-signaalpaden die beïnvloed worden door de samenstelling van het darmmicrobioom.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door microbiële verschuivingen te koppelen aan de progressie van auto-immuunziekten.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare DNA-monsters voor downstream sequencing en moleculaire assays.
- Garandeert kwantitatief, hoogwaardig DNA dat geschikt is voor PCR- en next-generation sequencing-workflows.
- Maakt schaalbare monsterverwerking mogelijk voor vergelijkende microbioomstudies over verschillende experimentele cohorten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische microbiota-profilering af met de progressie van de ziekte en inspanningen voor de ontdekking van biomarkers.
- Ondersteunt de continuïteit van bevindingen in de ontdekkingsfase naar translationele validatie in auto-immuunmodellen.
- Vermindert biologische ambiguïteit bij het koppelen van omgevingsfactoren aan ziektefenotypen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit DNA-isolatieprotocol past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor robuuste microbiomanalyse in lupus-gevoelige muismodellen mogelijk wordt en de identificatie van lead-verbindingen en mechanistische studies wordt ondersteund.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing over door microbiota gedreven immuunmodulatie bij autoimmuniteit.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve DNA-outputs voor sequencing-gebaseerde microbiome-profilering.
- Analytics: Biedt hoogwaardige input voor statistische vergelijking van verschuivingen in microbiële gemeenschappen tussen genotypes of behandelingen.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen preklinische microbiome-bevindingen en potentiële biomarkerontwikkeling bij auto-immuunziekten.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een schaalbaar, kosteneffectief protocol dat aanpasbaar is aan diverse muismodellen en experimentele ontwerpen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in associaties tussen microbiota en ziekten en de validatie van targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert DNA-extractie, wat de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende studies verbetert.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk door de bijdragen van het microbioom aan ziektemechanismen te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van microbiome-modulerende interventies in pipelines voor auto-immuunziekten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist technische expertise in steriele monsterafhandeling en moleculaire biologie-workflows.
- Toegang tot homogenisatoren, centrifuges en spectrophotometers is nodig voor kwaliteitscontrole.
- Strikte standaardisatie tussen teams is vereist om contaminatie en variabiliteit te minimaliseren.
- Aanpasbaar aan diverse muismodellen, maar optimalisatie voor verschillende monstertypes kan noodzakelijk zijn.
- Afhankelijk van nauwkeurig pipetteren en steriele technieken om de integriteit van de gegevens te waarborgen.
