Kwantitatieve analyse van visco-elastische eigenschappen van rode bloedcellen met behulp van een optisch pincet en onscherpe microscopie

Deze methodologie maakt het mogelijk om het mechanische gedrag van erytrocyten te onderzoeken, hun visco-elastische parameters en zachte glasachtige kenmerken te karakteriseren voor verschillende fysiologische en pathologische aandoeningen. Onze op één cel gebaseerde methode verifieert videoreferenties door de metaalwaarden te gebruiken voor de vormfactor die krachten en verplaatsingen, de spanningen en schaafwonden in het erytrocytenoppervlak relateert. Begin met het gieten van siliconenvet over het rubberen ringoppervlak op een manier die de hele omtrek bedekt.

Plaats vervolgens de rubberen ring op de coverslip met de vetzijde naar de coverslip gericht. Wacht vijf minuten op de juiste bevestiging en de monsterhouders zijn dan klaar om de celcultuur te ontvangen. Vervolgens zaait u met de oplossing van cellen die eerder volgens het geschreven protocol zijn bereid, de cellen in de monsterhouder.

Voeg 0,2 microliter van een polystyreenboloplossing van 10% volume per volume toe aan het monster. Plaats de tweede coverslip boven de rubberen ring. Sluit de installatie en voltooi de monstervoorbereiding.

Verplaats ten slotte het hele monster naar de microscoop. Om te beginnen met het experimenteren, gebruikt u het OT-systeem, vangt u de bol op met de OT-laser en bevestigt u deze vervolgens aan de coverslip, dicht bij de cel. Vang vervolgens een andere bol op en herhaal dezelfde bevestigingsprocedure door de bol tegen het celoppervlak te drukken, in de buurt van het bovenoppervlak en dicht bij de celrand.

Voeg een sinusoïdale functie van amplitude en variërende frequenties toe. Druk vervolgens op de startknop en gebruik de piëzo-elektrische trap om de piëzo-elektrische verplaatsing mogelijk te maken. Houd de RBC-bol in de val en onderwerp het monster aan een cyclus van bewegingen met behulp van de eerder ingestelde sinusoïdale functie.

Open voor analyse de ImageJ-software en importeer de volledige film die is verkregen tijdens de sinusoïdale bewegingen. Klik op aanpassen en selecteer vervolgens optiedrempel. Pas de drempel aan met beide schuifbalken en selecteer de referentiebol door op bestand te klikken, gevolgd door rechthoek.

Klik vervolgens op het tabblad Analyseren op "Metingen instellen" en selecteer de optie "Massamiddelpunt". Klik nogmaals op het tabblad Analyseren en selecteer Deeltjes analyseren. Er verschijnt een nieuw venster met een tabel met xy-coördinaten voor het midden van de massa.

Herhaal de procedure voor de andere bol die aan het RBC-oppervlak is bevestigd. Open de analysesoftware en importeer de eerder verkregen txt-bestanden. Genereer een plot met de massamiddelpunten op de y-as en de tijd op de x-as.

Plot de resultaten in een grafiek met behulp van de x-as voor verliesconstante, aangeduid met K dubbel priemgetal, en de y-as voor opslagconstante, aangeduid met K priemgetal. Ten eerste, voor video-acquisitie, verplaats de piëzo-elektrische fase in de xy-richting, met behulp van de software om te zoeken naar een geïsoleerde cel die aan de coverslip is bevestigd. Vang een polystyreenbol met een bekende diameter op en bevestig deze aan het RBC-oppervlak.

Verplaats vervolgens met behulp van de piëzo-elektrische fase de gevangen kraal die aan het RBC-oppervlak is bevestigd om de cel te vervormen en bevestig vervolgens de kraal aan de coverlip. Wijzig nu de positie van de z-as om de scherpgestelde afbeelding te vinden. Nadat u de positie hebt vastgesteld, gebruikt u de camerasoftware om een film van de hele cel te maken.

Verplaats vervolgens de positie van de z-as twee micrometer naar beneden of omhoog om een onscherp beeld voor de gekozen cel te verkrijgen. Zoek ten slotte, zonder de positie van de z-as te wijzigen, naar een gebied zonder cellen om dezelfde procedure te herhalen en maak een film van de achtergrond van de afbeelding. Zoek voor contrastbeeldacquisitie eerst de waarde van N nul, klik op het polygoonselectiepictogram, klik vervolgens op het tabblad Analyseren en selecteer meten.

Gebruik vervolgens de contrastvergelijking om N-afbeelding minus N nul te bepalen en voer dit uit door wiskunde"onder proces" te selecteren, gevolgd door aftrekken. Deel later het resultaat door N nul minus B.Zoek ten slotte het contrast voor de scherpgestelde en onscherpe afbeeldingen. Gebruik nu de Hartley-transformatie om de RBC-dikte te verkrijgen.

Klik in ImageJ op proces, gevolgd door FFT"- en FFT-opties en kies vervolgens FHT. Voer vervolgens de inverse transformatie FHT uit door het proces te selecteren, gevolgd door FFT" en FFT. Gebruik de resulterende afbeelding om het hoogteprofiel te verkrijgen.

Nadat u de afbeelding hebt gevonden die het RBC-hoogteprofiel bevat, gebruikt u het onscherpe contrast van twee micrometers om een set van twee afbeeldingen in ImageJ te maken. Als u de vormfactor wilt vinden, gebruikt u een aangepaste ImageJ-macro om de stapel te analyseren. De macro levert een tabel met de positie van de rand, de omtrek, de inverse van de omtrek en een afbeelding van de geanalyseerde cel.

Controleer of de randen van deze afbeelding vergelijkbaar zijn met de randen van de referentiefiguur. Anders herhaalt u de procedure en gebruikt u de som van de inverse van de omtrek om de vormfactor te vinden. Begin met het ordenen van de experimentele gegevens in een tabel.

Maak een nieuwe tabel in de analysesoftware door op het tabblad Bestand te klikken. Bepaal 10 verschillende kolommen voor de parameters. Om de curve G priem en G dubbel priem in de analysesoftware te plotten, gebruikt u de gegevens uit de vorige tabel en klikt u op de plot"knop.

Om de parameters Gamma en GM te verkrijgen, klikt u op het tabblad curve fit en selecteert u fit1" om een nieuw venster te openen. Selecteer het vierkant, klik op de knop Definiëren en typ de vergelijking. Klik op de knop "ok" in beide vensters en de fitting verschijnt.

Maak vervolgens twee andere plots, namelijk G-priemgetal en G dubbel priemgetal als functie van omega. Plaats de foutbalken alleen op de y-as, zoals eerder is aangetoond. Herhaal de procedure voor het aanpassen van de curve en selecteer de optie G".

Klik op curvedefinitie "onder algemene pasvorm en schrijf vervolgens de betreffende vergelijking. Klik ten slotte op OK en er verschijnt een curve-aanpassing samen met de waarden voor Alpha en G zero. Nogmaals, voer een andere curve-aanpassingsprocedure uit.

Selecteer de optie G", klik op curvedefinitie" onder algemene pasvorm en schrijf vervolgens de betreffende vergelijking. Klik ten slotte op ok en er verschijnt een curve-aanpassing. De figuur toont de opslagelastische constante als functie van de verlieselastische constante.

De waargenomen lineaire afhankelijkheid toont aan dat het RBC-oppervlak kan worden beschouwd als een zacht glasachtig materiaal. Door de waarden voor de totale celvormfactor en RBC-oppervlaktedikte toe te passen, kunnen de waarden voor de exponent Alpha worden bepaald. Deze techniek kan de basis vormen voor nieuwe diagnostische methoden die veranderingen in de visco-elastische eigenschappen van erytrocyten correleren met wijzigingen in de bloedstroom van personen met verschillende pathologieën.