Constructie van homozygote mutanten van trekkende sprinkhanen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie

De treksprinkhaan is een belangrijke landbouwtest. Deze methode biedt een efficiënt en gemakkelijk op te leveren protocol voor de gendrukmethoden van de Het is een systematische en gedetailleerde methode van een CRISPR / CAS9-constructie van homozygote sprinkhanenmutanten, inclusief eicelverzameling, mutantenscreening en de homozygote onderhoud. Bereid om te beginnen de injectienaalden voor door aan de glazen haarvaten te trekken met een micropipettrekker.

Stel de parameters in zoals beschreven in het tekstmanuscript en maal vervolgens de punt van de injectienaald met een micromolen. Bereid ribonucleo-eiwit voor op de injectie door één microliter Cas9-eiwit te mengen met één microliter van het geverifieerde single guide-RNA. Voeg vervolgens acht microliter vrij steriel water van RNA toe om het uiteindelijke volume van het mengsel te maken, 10 microliter.

Meng de oplossing grondig en leg deze op ijs. Verzamel vervolgens de vers gelegde eidozen van de eicelpositie en wacht tot het looien van de eieren. Gebruik na 30 minuten een fijne borstel om de eieren uit de eierdozen in water te isoleren en was de eieren drie keer met steriel water.

Leg de eieren vervolgens in een petrischaaltje en voeg steriel water toe om ze vochtig te houden. Vul de injectienaald met de bereide ribonucleo-eiwitoplossing en laad de injectie in de micromanipulator. Stel de micro-injectieparameters in op 300 Hectopascal injectiedruk, 0,5 seconden injectietijd en 25 Hectopascal compensatiedruk.

Wanneer de parameters zijn ingesteld, drukt u op het pedaal om het volume van de geïnjecteerde oplossing te evalueren. Pas de injectiedruk en injectietijd aan om ervoor te zorgen dat het injectievolume ongeveer 50 tot 100 nanoliter is. Nadat u de steriele eieren regelmatig op het injectiekussen hebt gerangschikt, plaatst u de pad op de objecttafel van de microscoop en past u de vergroting van de microscoop aan totdat de eieren worden waargenomen.

Stel vervolgens de microinjectienaald onder de microscoop in totdat de injectiepunt zichtbaar is en plaats de punt in de buurt van het te injecteren ei. Start de injectie op een geschikte hoogte en een hoek van 30 tot 45 graden. Steek de punt in het ei in de buurt van de microstapels van het ei en druk op het pedaal om de injectie te voltooien.

Trek vervolgens de naald snel in en beweeg het injectiekussen voor injectie van het volgende ei. Breng de geïnjecteerde eieren over in een kweekschaal met een stuk vochtig filtreerpapier. Plaats ze in een couveuse bij 30 graden Celsius.

Controleer na injectie elke dag de ontwikkeling van de geïnjecteerde eieren. Breng de geïnjecteerde eieren in de eerste vijf dagen elke 24 uur over in een nieuwe kweekschaal. Op de zesde dag na de injectie, willekeurig plukken en overbrengen 10 eieren in een buis en voldoende malen de eieren met twee stalen ballen op 60 hertz gedurende zes minuten met behulp van een molen.

Na het malen, resuspensie het puin in een milliliter PBS. Breng vervolgens vijf microliter van het geresuspendeerde mengsel over in 45 microliter 50 millimolair natriumhydroxide om gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius te lyseren. Om de alkalische lysisreactie te beëindigen, voegt u vijf microliter van één kies Tris-hydrochlorideoplossing toe aan het lysissysteem.

Neem één microliter van het lysisproduct als pcr-sjabloon om het doelgenfragment te versterken. Vergelijk na de PCR en sequencing de sequencingresultaten met de wildtypesequentie om te evalueren of het CRISPR/Cas9-systeem het doelgen in vivo heeft gesplitst. Laat de rest van de eieren voor verdere ontwikkeling als indels worden gedetecteerd in het embryonale stadium.

Na ontwikkeling, overbrenging en kweek de uitgekomen nimfen in een opfokkooi zoals beschreven in het manuscript. Wanneer de nimfen zich ontwikkelen tot het vijfde instar-stadium, scheid ze dan met plastic kweekbekers. Voer kruisingen uit met behulp van de G0-mutanten en wildtype sprinkhanen.

Gebruik na het verzamelen van oassisten drie tot zes ontwikkelde eieren in elke oassist om mutaties te detecteren zoals eerder beschreven. Houd mutatiepositieve oassisten voor de volgende ontwikkeling en verlaat de mutatienegatieve oassisten. Voor cryo-conservering, was de eieren met steriel water en incubeer ze in een kweekschaal zoals eerder uitgelegd.

Verzamel na vijf tot zes dagen de eieren samen in de kweekschaal en bedek ze met filterpapierfragmenten. Wikkel vervolgens het hele kweekgerecht in met een paraffinefilm. Zet de schaal twee dagen op 25 graden Celsius, gevolgd door nog eens twee dagen op een lagere temperatuur van 13 tot 16 graden Celsius.

Zet de schaal vervolgens over naar een koelkast van zes graden Celsius. Voeg om de twee weken water toe aan het gerecht om de eieren een vochtige omgeving te bieden. Tot slot, voor het reanimeren van de gecryopreserveerde eieren, plaats je de petrischaal gedurende twee dagen op 25 graden Celsius.

Plaats de eieren later in een broedmachine van 30 graden Celsius totdat de nimfen uitkomen. In dit onderzoek bevond de doellocatie voor het CRISPR/Cas9-systeem zich in het eerste exon. In de Cas9-splitsingstest kon het CRISPR / Cas9-ribonucleo-eiwit het PCR-fragment met de doellocatie verteren met een splitsingssnelheid van ongeveer 55% De sequencingresultaten voor schatting van de mutatiesnelheid in het embryonale stadium suggereerden efficiënte genoombewerking op de doellocatie.

De bewerkingsefficiëntie resulteerde in een broedpercentage van 52,73% nimf en 66,67% van de G0-volwassenen waren mozaïekmutanten. De passaging-strategie van de mutantenlijnen wordt hier getoond. De overtollige homozygote eieren werden gecryopreserveerd om de benuttingsgraad van de homozygoten te verbeteren.

Hoewel de broedsnelheid van de gecryopreserveerde eieren werd verminderd met de verlenging van de cryopreservatietijd, waren de corrigerende acties zoals het aanbrengen van filterpapierfragmenten en het herstellen van deze geconserveerde eieren met een gradiënt van stijgende temperatuur nuttig voor de reanimatie. Het belangrijkste is om te proberen de mechanische schade veroorzaakt door micro-injectie te beperken. Deze procedure kan worden gebruikt als referentie voor het bereiken van andere insecten.

Een deel van sommige details, zoals methoden voor het verzamelen van eieren, injectie en het gewas, moet worden gewijzigd. Deze techniek kan ook nuttig zijn om metamorfose en de omgevingsaanpassing van de insecten te bestuderen en de constructie van homozygote sprinkhanenmutanten versnelde het onderzoek op dit gebied.