Identificatie van hemolytische en fosfolipase-activiteit in ruwe extracten van zeeanemonen door Eenvoudige Bioassays

Zeeanemoon toxine interactie moet het minste aantal organismen en efficiënte protocollen gebruiken om een grote diversiteit en overvloed van de toxines en snelle identificatie van een specifiek toxine te verkrijgen. We combineerden twee efficiënte technieken om het ruwe extract te bereiden met een grote hoeveelheid eiwit en beschrijven reproduceerbare, specifieke, snelle en goedkope testen om hemolyse en fosfolic basen in het zeeanemoongif te identificeren. De methode kan worden gebruikt in bijna elk voorbeeld dat wordt besloten om een of beide soorten cytolysinen te identificeren.

De efficiëntie van de methode wordt bereikt door te zorgen voor de tijden in elke stap tijdens het bereiden van het ruwe extract. De sleutel tot hemolyse is zorgvuldige behandeling van de erytrocyt om mechanische lysis te voorkomen, en bij fosfolyse-assay, zorgen voor de temperatuur bij de bereiding van de plaat. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr.Santos Ramirez-Carreto, bioloog Sandra Salazar Garcia en bioloog Giovanni Macias Martinez vanuit mijn laboratorium.

Begin met het reinigen van de verzamelde zeeanemoon A.doi met gedestilleerd water met de hand om de grote substraatdeeltjes te verwijderen die zich aan het lichaam hechten. Vries de organismen onmiddellijk in bij min 80 graden Celsius in een ultravriezer gedurende 72 uur. Plaats de organismen vervolgens in speciale glazen voor vriesdrogen met lyofilisatieomstandigheden gedurende 48 uur.

Voor weefselhydratatie reconstitueer 20 gram drooggewicht van gelyofiliseerde organismen met 60 milliliter 50-millimolaire natriumfosfaatbuffer en één remmende cocktailtablet. Roer het monster in een magneetroerder gedurende 12 uur continu bij ongeveer 800 RPM en vier graden Celsius. Nadat u het monster gedurende 12 uur bij min 20 graden Celsius hebt ingevroren om cellyse en nematocystafscheiding te induceren, plaatst u de container in water bij kamertemperatuur totdat deze tot 90% ontdooit Herhaal deze procedure drie keer.

Om het extract te verduidelijken, centrifugeer het monster op 25, 400 keer G gedurende 40 minuten bij vier graden Celsius. Herstel het supernatant en centrifugeer het opnieuw. Herhaal de stap drie tot vier keer en herstel het supernatant eindelijk.

Het teruggewonnen supernatant of ruw extract bevat de gifcomponenten en andere celmoleculen zoals lipiden, koolhydraten en nucleïnezuren. Bepaal de eiwitconcentratie van het ruwe extract met behulp van een commerciële Bradford colorimetrische testkit. Incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur zonder te schudden.

Meet vervolgens de absorptie op 595 nanometer. Zet de gemiddelden van de BSA-absorpties van het monster uit en bepaal de vergelijking van de grafiek waarbij y de absorptie is, m de helling van de lijn, x de eiwitconcentratie en b de ordinaat van de oorsprong. Om het ruwe extract te analyseren, voegt u 30 microgram van het ruwe extract toe aan vijf microliter van de eiwitbelastingsbuffer om de eiwitten te denatureren.

Het uiteindelijke volume moet kleiner zijn dan 50 microliter. Voer de elektroforese uit op een constante van 25 milliamperes gedurende één uur en 30 minuten. Om de diffusie van de geleiwitten te voorkomen, voegt u de fixatieoplossing toe aan de eiwitten en incubeert u gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur met schudden bij 80 RPM.

Decanteer vervolgens de oplossing en voeg de eiwitverknopingsoplossing toe. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met schudden bij 80 RPM. Verwijder de oplossing en was de gel gedurende vijf minuten met 100 milliliter gedestilleerd water.

Verwijder daarna het water en herhaal deze procedure vier keer. Voer eiwitkleuring uit met 50 milliliter Coomassie Brilliant Blue R-250 gefilterde oplossing, roerend bij 60 RPM in een laboratorium roterende oscillator bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Haal een milliliter bloed uit de halsader van een schaap en verwijder de naald uit de spuit.

Giet onmiddellijk bloed af in een buis met 50 milliliter Alsever-oplossing en centrifugeer gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius bij 804 maal G. Gooi het supernatant weg en voeg 30 milliliter Alsever-oplossing toe door het langs de binnenwanden van de buis te schuiven. Resuspend de pellet langzaam met behulp van een pasteur plastic pipet en centrifugeer de oplossing opnieuw op 804 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Herhaal deze procedure totdat het supernatant is opgehelderd. Handhaaf het uiteindelijke volume van de Alsever-oplossing om een concentratie van ongeveer 2 miljoen cellen per milliliter te bereiken. Gebruik vervolgens een Neubauer-kamer of hemocytometer om de cellen te tellen.

Incubeer de oplossingsmengsels gedurende één uur bij 37 graden Celsius zonder te schudden en centrifugeer de plaat vervolgens gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 804 maal G. Recupereer het supernatant in een andere 96-putplaat met een vlakke bodem. Als het ruwe extract cytolysinen bevat, zullen erytrocyten lyseren en hemoglobine afgeven.

Lees de absorptie op 415 nanometer en bereken de hoeveelheid extract die hemolyse produceert in 50% van de erytrocyten. Verhoog de hoeveelheid zeeanemoon ruw extract en ontwerp het perceel met sigmoïdale aanpassingen met behulp van geschikte software. Was één kippenei met 1%SDS in gedestilleerd water en scheid het eigeel onder steriele omstandigheden van het eiwit.

Bereid oplossingen A, B, C en D.Voeg 500 microliter oplossingen A en C toe aan oplossing B en 100 microliter oplossing D.Meng ze en giet 25 milliliter in elke petrischaal. Wacht tot de oplossing stolt onder steriele omstandigheden en maak putten van ongeveer twee tot drie millimeter in diameter met een dunne buis. Voeg in totaal 20 microliter fosfaatbuffer toe als negatieve controle in de ene put en 20 microliter van een bepaalde fosfolipase als positieve controle in een andere put.

Plaats verschillende hoeveelheden van het ruwe extract eiwit 5, 15, 25, 35 en 45 microgram in de resterende putten, elk in een eindvolume van 20 microliter. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 20 uur. De representatieve resultaten van het protocol dat werd gebruikt om het ruwe extract van zeeanemonen te verkrijgen, toonden aan dat het combineren van twee technieken, agitatie en cycli van invriezen en ontdooien, een efficiënte afvoer van nematocysten opleverde.

De nematocyten voor en na prikkels worden hier getoond. De nematocyste tubulus wordt in deze afbeelding blootgesteld, wat de afgifte van toxine aangeeft. Het elektroforetische profiel van zeeanemoon ruw extract wordt hier getoond.

Het ruwe extract van zeeanemonen werd geanalyseerd door SDS-PAGE 15% polyacrylamide-gel en toonde eiwit van 10 kilodalton tot 250 kilodalton molecuulgewicht. Hier is baan 1 de eiwitladder en baan 2 zeeanemoongif. Cytolysinen werden gedetecteerd in de molecuulgewichtszone van 15 kilodalton en 20 kilodalton.

Hier afgebeeld is de hemolysetest in erytrocyten van schapen. De hemolytische activiteit van het extract voor en tijdens de vries- en ontdooicycli nam toe totdat 100% hemolyse werd bereikt met 50 microgram van het totale ruwe extracteiwit in de laatste twee cycli. De hoeveelheid die nodig is om 50% schapen erytrocyten te lyseren is 11,1 0,3 microgram per milliliter.

Fosfolipase-activiteit werd gedetecteerd door de vorming van heldere halo's in de gebieden van de agarplaat waar het ruwe extractmonster werd aangebracht. De resultaten tonen de aanwezigheid van fosfolipase-activiteit van 15 microgram totaal eiwit. De diameter van de halo nam toe op een dosisafhankelijke manier; dat wil zeggen, als de hoeveelheid ruw extract toenam, nam de diameter van de halo toe.

Zorg er tijdens het proberen van de procedure voor dat u nematocystafscheiding induceert, het totale eiwit kwantificeert, ruw extract analyseert door SDS-PAGE-elektroforese, de hoeveelheid ruw extracteiwit berekent om 50% van de hemolyse te produceren en verschillende hoeveelheden eiwit gebruikt in fosfolipase-assay. We kunnen het ruwe extract analyseren door proteomische techniek om polypeptiden met grote relevantie in de biotechnologie en biogeneeskunde te identificeren, zelfs een uniek molecuul te profileren en te karakteriseren en het vervolgens in het laboratorium te produceren voor een toepassing. We verkregen een deel van de sequentie van een presterend eiwit met antitumoractiviteit in de menselijke obdurate longcarcinoom epitheelcellen.

Evenzo identificeren we de sequentie van fosfolipases van biotechnologisch belang.