Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie

Deze protocollen maken de studie van erfelijke immuniteit tegen microsporidia mogelijk. Technieken die hier worden uitgelegd, kunnen ons helpen begrijpen hoe immuniteit wordt overgedragen tussen generaties en de moleculen die de immuniteit voor microsporidia bij nakomelingen bepalen. C.elegans is een eenvoudig en genetisch handelbaar model met een korte generatietijd voor het testen van overerving.

De vele beschikbare hulpmiddelen voor de worm kunnen worden gebruikt om moleculaire mechanismen van intergenerationele immuniteit te ontdekken. Gebruik bij het infecteren van P0-dieren een lage sporendosis die geen significante invloed heeft op het vermogen van de ouder om nageslacht te produceren. Dit zorgt ervoor dat bleken voldoende F1-dieren oplevert voor stroomafwaartse experimenten Om te beginnen, verplaats het vereiste aantal 10-centimeter ongeplaatste nematodengroeimediumplaten van vier graden Celsius naar kamertemperatuur een dag voor geplande infecties.

Vlak voor de infectie, pellet naar beneden ongeveer 2, 500 gesynchroniseerde L1 wormen in een microfuge buis op 1, 400 keer G gedurende 30 seconden. Verwijder het supernatant met een pipetpunt om wormen in 50 microliter M9-media achter te laten. Voeg één milliliter 10X Escherichia coli stam OP50 toe aan de 1-stadium wormen en N.parisii sporen aan de gewenste concentratie.

Bereid als niet-geïnfecteerde controle een gelijkwaardige buis van L1s en OP50 met een volume van M9-media dat overeenkomt met het volume van het gebruikte sporenpreparaat. Meng het L1-wormmonster door kort te vortexen en plaats boven één milliliter wormen op een 10-centimeter ongewassen nematodengroeimediumplaat. Draai om ervoor te zorgen dat de vloeistof zich over de hele plaat verspreidt.

Droog de platen in een schone kast met de deksels eraf gedurende 10 tot 20 minuten of tot ze volledig droog zijn voordat ze 72 uur bij 21 graden Celsius worden geïncubeerd. Onderzoek 72 uur na infectie platen onder de ontleedmicroscoop. De plaat met geïnfecteerde wormen moet minder embryo's bevatten dan de platen met niet-geïnfecteerde wormen.

Spoel vervolgens de wormen van de platen in een microcentrifugebuis met behulp van één milliliter M9-medium. Als er veel wormen op de platen achterblijven, pellet de wormen dan door centrifugeren op 1400 keer G gedurende 30 seconden. Verwijder het supernatant en voer extra plaatwassingen uit.

Centrifugeer gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur op 1400 maal G om de wormen te pelleteren en was tweemaal met één milliliter M9-media of totdat het supernatant helder is. Hang het opnieuw op in een laatste volume van een milliliter M9-media en meng goed door te pipetteren. Breng 100 microliter van de gesuspendeerde wormen over in een verse buis en bleek de resterende 900 microliter om de volwassen wormen open te breken en F1-embryo's vrij te geven voor testen.

Voer infecties uit met wijzigingen. zoals vermeld in het manuscript. Onderzoek 72 uur na infectie platen onder een ontleedmicroscoop.

De plaat met naïeve wormen moet kleiner zijn en minder embryo's bevatten dan de platen met geprimeerde wormen. Start vervolgens het kleurings- en bevestigingsproces van wormen door ze van de platen in een microcentrifugebuis te spoelen met één milliliter van 0,1% Tween 20 in M9-media. Als er veel wormen op de platen achterblijven, pelleteert u de wormen door centrifugering op 1,400 maal G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur, verwijdert u het supernatant met een pipetpunt en voert u extra plaatwassingen uit.

Na het pelleteren van de wormen door centrifugeren gedurende 30 seconden bij 1, 400 maal G bij kamertemperatuur, tweemaal wassen met één milliliter M9-media met 0,1%Tween 20 of totdat het supernatant helder is. Verwijder het supernatant, voeg 700 microliter aceton toe en laat de wormen gedurende 10 minuten op kamertemperatuur fixeren. Pellet deze vaste wormen gedurende 30 seconden bij 10.000 maal G bij kamertemperatuur en geef twee wasbeurten van één milliliter fosfaatbufferzoutoplossing met 0,1%Tween 20.

Bereid 50 milliliter DY96-werkoplossing voor, wikkel de container in folie en bewaar deze in een lade om blootstelling aan licht te voorkomen. Voeg 500 microliter DY96-werkoplossing toe aan de wormkorrel en draai gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Centrifugeer deze reactie gedurende 30 seconden bij 10.000 keer G bij kamertemperatuur om de wormen te pelleteren en het supernatant te verwijderen.

Voeg vervolgens 15 microliter van het montagemedium met of zonder DAPI toe. Pipetteer 10 microliter van deze gekleurde wormen op een microscoopglaasje en plaats een afdekslip over de bovenkant. Om de DY96-gekleurde wormen op dia's te analyseren, voert u beeldvorming uit met behulp van het GFP-kanaal van een fluorescentiemicroscoop.

Om de fitheid van de wormpopulaties te bepalen, gebruikt u een 5X- of 10X-doelstelling om de graviditeit van meer dan 100 wormen per aandoening te testen. 72 uur na infectie werden de F1-dieren gefixeerd en gekleurd met DY96 om de resistentie tegen microsporidia te beoordelen. Geïnfecteerde ouderlijke populaties en niet-geïnfecteerde controles werden 72 uur na infectie vastgesteld en gekleurd met DY96 om de wormembryo's en microsporidia-sporen te visualiseren.

Geïnfecteerde dieren zijn klein, bevatten veel microsporidia-sporen en produceren minder embryo's dan gezonde, niet-geïnfecteerde controles. Beoordeling van de graviditeit van wormen toonde aan dat ongeveer 95% van de niet-geïnfecteerde dieren nakomelingen produceerde, vergeleken met de geïnfecteerde dieren, die minder dan 80% waren Kwantificeringen onthulden dat ongeveer 90% van de met microsporidia behandelde populatie besmet was, zoals bepaald door het aantal wormen dat DY96-gekleurde sporen bevatte. Kwantificeringen van deze vaste dieren onthulden dat de geprimeerde wormen aanzienlijk meer embryo's bevatten dan hun naïeve tegenhangers, wat wijst op een grotere fitheid in het licht van infectie.

Fiji ImageJ werd gebruikt om de parasietlast van individuele naïeve en immuungeprimeerde wormen te bepalen, wat het percentage van het lichaam is dat gevuld is met fluorescerende N.parisii-sporen. Kwantificeringen onthulden een dramatische vermindering van de parasietlast van wormen die afkomstig waren van geïnfecteerde ouders. Verder onthulden de berekeningen van de individuele wormgrootte dat geprimeerde wormen een aanzienlijk groeivoordeel hadden ten opzichte van naïeve dieren in het licht van N.parisii-infectie.

Beeldvormende studies toonden aan dat terwijl naïeve dieren meestal meerdere sporen en verschillende geïnfecteerde cellen bevatten, de geprimeerde dieren veel minder of geen sporen hadden en meestal geen sporoplasmata. Als niet-geprimeerde en geprimeerde F1-populaties vergelijkbare aantallen gravid en geïnfecteerde dieren hebben, tel dan het aantal eieren per dier en analyseer geïnfecteerd weefsel met ImageJ om subtielere verschillen te vinden. Terwijl directe gele 96 vlekken rijpen, kan fluorescentie in situ hybridisatie sporoplasmata in cellen onthullen.

Dit kan u het aantal geïnfecteerde cellen in geprimeerde en niet-geprimeerde wormen laten zien. Deze technieken hebben aangetoond dat de ouderlijke transcriptionele respons instrumenteel kan zijn bij het induceren van erfelijke immuniteit bij nakomelingen. Onderzoekers onderzoeken nu de aard van deze immuniteit bij nakomelingen.