Toepassing van RNA-interferentie in de dennenaaltjes, Bursaphelenchus xylophilus

RNAi is een effectieve methode geworden voor het identificeren van de functie van genen in nematoden en wordt voorgesteld als een nieuwe manier om pathogene nematoden effectief te bestrijden. RNAi is het weken van nematoden in dsRNA kan voldoende zijn voor de procedure. Verzamel om te beginnen de nematoden volgens de Baermann-trechtermethode.

Plaats hiervoor een geklemde rubberen buis onder een trechter en plaats twee lagen filterpapier in de mond van de trechter. Breng de Botrytis cinerea schimmelculturen over in de trechter en voeg water toe om de schimmelmat onder te dompelen. Wanneer nematoden worden verzameld, voegt u 500 microliter extractiereagens en 100 microliter magnetische kralen toe aan een centrifugebuis van twee milliliter.

Aspirateer 20 microliter van de nematoden en maal de monsters op 9.000 x g gedurende 30 seconden. Incubeer gedurende vijf minuten en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng het supernatant over in een verse centrifugebuis.

Voeg 100 microliter chloroform toe en meng door de buis meerdere keren om te keren. Incubeer gedurende drie minuten en centrifugeer vervolgens bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng het supernatant opnieuw over in een verse centrifugebuis.

Voeg 250 microliter isopropylalcohol en vortex krachtig toe. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten en vortex. Gooi het supernatant weg en voeg 500 microliter 75% ethanol toe om het RNA te wassen.

Vortex het monster gevolgd door centrifugatie bij 12.000 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Droog de RNA-pellet gedurende vijf minuten aan de lucht en resuspenseer deze in 30 microliter RNase-vrij water. Bereken de RNA-concentratie met behulp van deze formule en bereken de verhouding A260 tot A280.

Gebruik vervolgens een paar primers om de partiële coderingssequentie van het BX ppm-1-gen van het B.xylophilus te versterken. Kloon vervolgens de ppm-1 gensequenties in een pGEM-T Easy vector die de T7 promotor bevat. Herstel het 894 base pair long ppm-1 genfragment door het gekloonde plasmide te gebruiken als sjabloon voor pcr.

Gebruik vervolgens een in vitro transcriptiekit om het dsRNA te synthetiseren. Analyseer de kwaliteit van het dsRNA met behulp van een spectrofotometer en visualiseer de producten op een 1% agarose gel. Voeg vier microliter 5X weekbuffer toe en vul het volume aan tot 20 microliter met dubbel gedestilleerd water om een uiteindelijke RNA-concentratie van 0,8 microgram per milliliter te krijgen.

Plaats vervolgens de aaltjes 30 minuten in de schaal en wacht tot de eieren zich aan de bodem hechten. Verwijder voorzichtig het water en de nematoden zonder de eieren te verstoren totdat alleen de eieren in het gerecht achterblijven. Broed de verzamelde eieren 24 uur in het donker uit bij 25 graden Celsius om J2-larven te verkrijgen.

Verzamel de larven in een buis en was ze drie keer met dubbel gedestilleerd water. Breng vervolgens de larven over in de buis met de dsRNA-oplossing. Voeg hieraan resorcinol-oplossing toe om een 1% -oplossing te krijgen.

Leg de larven op een schudtafel om te zorgen voor voldoende opname van dsRNA in de larven. Voor controles, week dezelfde hoeveelheid nematoden in de weekbuffer zonder de dsRNA-sonde of met een GFP dsRNA-sonde. Voer een qPCR uit met behulp van de actB- en tbb-2-genen als interne referenties om de veranderingen in genexpressieniveau te evalueren.

Gebruik de delta delta Ct-methode om het relatieve genexpressieniveau te schatten op basis van de oplossingscurve en Ct-waarde. Kweek na RNAi de J2-larven tot de volwassenheid op Botrytis cinerea-gazons op PDA-platen. Verzamel de volwassenen met behulp van de Baermann-trechtermethode zoals weergegeven in sectie één.

Verkrijg afbeeldingen van de volwassen nematoden onder een microscoop en gebruik de ImageJ-software om de lichaamslengte van 50 mannelijke en 50 vrouwelijke nematoden te meten. Analyseer de gegevens door het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elk monster te berekenen. Pas de t-test van de student toe om de middelen van de monsters uit de verschillende groepen te vergelijken.

Relatieve genexpressieanalyse nadat RNAi aangaf dat het ppm-1 dsRNA de expressie van het ppm-1 één gen van B.Xylophilus effectief kan remmen. Terwijl exogene GFP dsRNA geen effect had op de ppm-1 expressie. Na RNAi nam de grootte van de volwassenen aanzienlijk af, ondanks het bereiken van geslachtsrijpheid, wat resulteerde in het mutant fenotype van de kleine lichaamsgrootte.

De gemiddelde lichaamslengte van de gemuteerde vrouwtjes en mannetjes was 544 en 526 micrometer vergeleken met 971 en 912 micrometer voor de controlegroep Het belangrijkste is om de nematoden over te brengen naar de dubbelstrengs RNA-oplossing en een ander reagens toe te voegen om de nematoden te stimuleren om zich te voeden. Deze methode is geschikt voor grootschalige genscreening en wordt veel gebruikt in celonderzoek. Het bestuderen van de genfunctie van B.Xylophilus met deze methode heeft een leidende waarde voor de biologische bestrijding van B.Xylophilus.