Beoordeling van de open waarschijnlijkheid van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie in de setting van co-enzym Q-overmaat
1 juni 2022
Deze methode maakt gebruik van de bijdrage van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie aan protonlek met lage geleiding om de spanningsdrempel voor porieopening te bepalen bij neonatale fragiele X-syndroommuizen met een verhoogd cardiomyocyt mitochondriaal co-enzym Q-gehalte in vergelijking met wildtypecontrole.
Dit protocol biedt een nieuwe manier om de lage geleidingsopening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige manier biedt om de open waarschijnlijkheid van de porie te meten als functie van mitochondriaal membraanpotentiaal. Deze techniek kan gemakkelijk worden toegepast op mitochondriën geïsoleerd van elk orgaansysteem en soort.
Begin met de kalibratie van de zuurstofelektrode door een druppel van 50% kaliumchloride-elektrolytoplossing bovenop de koepel van de elektrodeschijf te plaatsen. Plaats een klein stukje sigarettenpapier van twee vierkante centimeter bedekt met een iets groter stuk polytetrafluorethyleenmembraan over de elektrolytdruppel. Gebruik vervolgens het applicatorgereedschap om de kleine elektrodeschijf O-ring over de koepel van de elektrode te duwen.
Vul vervolgens het reservoir goed aan met de elektrolytoplossing. Plaats de grotere O-ring in de uitsparing rond de elektrodeschijf goed. Installeer vervolgens de schijf in de elektrodekamer en sluit deze aan op de besturingseenheid.
Voeg twee milliliter luchtverzadigd gedeïoniseerd water en de met polytetrafluorethyleen gecoate magneet toe aan de reactiekamer. Als u klaar bent, sluit u de kamer aan op de achterkant van de besturingseenheid. Stel de temperatuur in op 37 graden Celsius en de roersnelheid op 100.
Laat de systeemtemperatuur gedurende 10 minuten in evenwicht blijven voordat u kalibratiet. Nadat u de juiste temperatuur, roersnelheid en druk hebt gecontroleerd, selecteert u op het tabblad Kalibratie de optie Vloeistoffasekalibratie om vloeistoffasekalibratie uit te voeren. Druk vervolgens op OK en wacht tot het signaal is afgevlakt.
Zodra het plateau is bereikt, drukt u op OK. Voeg vervolgens ongeveer 20 milligram natriumdyniet toe om nul zuurstof in de kamer te vestigen. Druk nogmaals op OK en wacht tot het signaal is afgevlakt voordat u op de knop Opslaan klikt om de kalibratie te accepteren. Om het tetrafenylfosfonium of TPP-selectieve elektrodeassemblage te bereiden, vult u de TPP-selectieve elektrodepunt met een 10 millimolaire TPP-oplossing met behulp van een spuit en een flexibele naald.
Vermijd luchtbellen tijdens het vullen van de elektrodepunt. Maak de dop van de elektrodehouder los om de interne referentie-elektrode in de TPP-tip te plaatsen. Als u klaar bent, monteert u het TPP-selectieve elektrodeapparaat, inclusief de referentie-elektrode en elektrodehouder.
Draai de dop vast om de punt vast te zetten. Sluit vervolgens de kabel aan op de hulppoort van de schakelkast en de TPP-elektrodehouder. Plaats de TPP-selectieve en referentie-elektroden in de aangepaste plunjerassemblage voor ionselectieve elektroden.
Sluit de referentieelektrode aan op de referentiepoort van de besturingskast. Voeg vervolgens, om de reactiekamer voor te bereiden, één milliliter van het reactiemengsel toe aan de reactiekamer zonder luchtbellen te creëren. Sluit de kamer met behulp van de aangepaste plunjer met de TPP-selectieve en referentie-elektroden op hun plaats.
Zodra de kamer is gesloten, brengt u extra reagentia rechtstreeks in de reactiekamer met behulp van afzonderlijke microspuiten die zijn aangepast met plastic slangen. Wanneer de installatie klaar is, selecteert u Ga om de opname te starten. Zodra een stabiel spanningssignaal is verkregen, kalibreert u de TPP-selectieve elektrode door één micromolaire stappen van een 0,1 millimolaire TPP-oplossing toe te voegen om een uiteindelijke concentratie van drie micromolair te bereiken.
Observeer de logaritmische afname van het TPP-spanningssignaal bij elke optelling. Voeg na het stabiliseren van zuurstof- en TPP-sporen 100 microgram vers bereide cardiomyocyten mitochondriën toe aan de reactiekamer via de reagenstoevoegingspoort in de plunjerassemblage tot een eindconcentratie van 0,1 milligram per milliliter. Observeer de afname van het zuurstofgehalte in de kamer als de mitochondriën energie krijgen en zuurstof verbruiken.
Zie ook de abrupte toename van het TPP-spanningssignaal als de mitochondriën een membraanpotentiaal genereren en TPP uit de oplossing opnemen. Voeg vervolgens 2,5 microgram per milliliter oligomycine toe om de ademhaling van toestand 4 te induceren. Om de open waarschijnlijkheid van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie of mPTP te beoordelen, observeer de afname van het membraanpotentiaal in de loop van de tijd tijdens lekademhaling.
Zodra de gewenste membraanpotentiaal is bereikt, voegt u één micromolair ciclosporine A als mPTP-remmer toe aan de reactiekamer om de open waarschijnlijkheid van de mPTP bij die specifieke membraanpotentiaal te beoordelen. Meet vervolgens het effect van ciclosporine A op het zuurstofverbruik en de membraanpotentiaal voor en na de toevoeging van ciclosporine A. In de representatieve curven van gelijktijdig zuurstofverbruik en membraanpotentiaal werd een hoog membraanpotentiaal ingesteld op nul, intermediair op vijf en laag op 10 millivolt ten opzichte van het twee micromolaire TPP-kalibratieniveau.
De mitochondriën bij nul millivolt vertoonden 100% mPTP gesloten waarschijnlijkheid en bij 10 millivolt vertoonden 100% open waarschijnlijkheid. Na toevoeging van oligomycine werd geen significant verschil in zuurstofverbruik waargenomen, wat suggereert dat adenosinetrifosfaat, of ATP-synthase, minimaal bijdraagt aan de ademhaling van toestand 2. Verder werden de zuurstofverbruikssnelheid en het membraanpotentiaal voor en na cyclosporine A-additie vergeleken.
Een afname van het zuurstofverbruik en een toename van de stabilisatie van de membraanpotentiaal duidden op de sluiting van een open mPTP. Wanneer de mPTP gesloten is, was er geen afname van het zuurstofverbruik en bleef het membraanpotentiaal dalen. De resultaten toonden vergelijkbare gesloten en open mPTP-waarschijnlijkheden bij hoge en lage membraanpotentialen in de FVB-controle en Fmr1 knock-out cardiale mitochondriën.
Bij het intermediaire membraanpotentiaal vertoonden de Fmr1 knock-out cardiale mitochondriën een verhoogde gesloten mPTP-waarschijnlijkheid in vergelijking met de FVB-controles. Er mogen geen luchtbellen in de kamer worden ingebracht, omdat dit zal leiden tot onstabiele zuurstofverbruiksmetingen en interpretatie moeilijk zal maken. Volgens deze procedure kan het calciumbelastingsvermogen worden gemeten.
Deze methode beoordeelt de hoge geleidingsopening van de porie en vult de resultaten van onze techniek aan.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de opening met lage geleidbaarheid van de mitochondriale permeabiliteitstransitiepoort (mPTP) bij neonatale fragiele X-syndroom muizen, waarbij de spanningsdrempel voor poortopening wordt benadrukt. De bevindingen vergelijken het mitochondriale co-enzym Q-gehalte van cardiomyocyten in modelorganismen met wildtype controles, waardoor een nieuwe benadering ontstaat om mPTP-gedrag te meten als functie van mitochondriale membraanpotentiaal.
Belangrijkste studieonderdelen
Onderzoeksgebied
- Mitochondriale fysiologie
- Fragiel X-syndroom
- Cardiomyocytfunctie
Achtergrond
- Mitochondriale permeabiliteitstransitiepoort (mPTP) speelt een cruciale rol in cellulaire energiemetabolisme.
- Fragiel X-syndroom is bekend om zijn invloed op cellulaire functie en metabolisme.
- De studie heeft tot doel de relatie tussen mPTP-gedrag en mitochondriaal potentieel in hartcellen te verduidelijken.
Gebruikte methoden
- Calibratie van een zuurstofelektrode voor het meten van mitochondriale activiteit
- Cardiomyocyt-mitochondria van neonatale fragiele X-syndroom muizen en wildtype controles
- Toepassing van mPTP-remmers zoals cyclosporine A om de waarschijnlijkheid van poortopening te beoordelen
Belangrijkste resultaten
- Identificeerde de spanningsdrempel voor mPTP-opening in hartmitochondria.
- Demonstreerde verschillende mPTP-openingswaarschijnlijkheden tussen fragiel X-syndroom en wildtype controle mitochondria.
- Valideerde dat sluitings- en openingswaarschijnlijkheden van mPTP worden beïnvloed door membraanpotentiaal.
Conclusies
- De studie stelt een nieuwe methodologie voor het analyseren van mPTP-dynamica en hun implicaties in ziektemodellen vast.
- Deze bevindingen verbeteren ons begrip van mitochondriale disfunctie bij fragiel X-syndroom en gerelateerde aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) open probability as a function of membrane potential enables mechanistic de-risking in early discovery and target validation for mitochondrial dysfunction. This approach provides predictive confidence for evaluating mitochondrial liabilities and supports portfolio triage in disease-relevant models. The method's adaptability across organ systems and species enhances its enterprise value for translational research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mPTP gating mechanisms under defined voltage thresholds.
- Supports functional target validation by quantifying pore open probability in response to modulators like cyclosporine A.
- Facilitates mechanistic de-risking of mitochondrial targets in disease-relevant systems.
- Provides a platform for comparative studies across genetic backgrounds and tissue types.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized, quantitative readouts for mPTP activity using simultaneous oxygen consumption and membrane potential measurements.
- Enables reproducible assessment of compound effects on mitochondrial function in isolated organelles.
- Supports assay scalability and cross-laboratory standardization through robust electrode-based protocols.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of mitochondrial modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial functional readouts with disease-relevant phenotypes in genetic models.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of mitochondrial targets.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying functional mitochondrial liabilities.
- Facilitates biomarker alignment for translational research in mitochondrial pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This technique integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative assessment of mitochondrial function in isolated systems.
- Discovery Biology: Provides voltage-dependent mPTP open probability data for pathway clarification and target validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in mitochondrial assays.
- Analytics: Generates simultaneous oxygen consumption and membrane potential measurements for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical models by supporting disease-relevant system interrogation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable protocol for diverse organ systems and species in mitochondrial research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales mitochondrial functional assays for cross-team reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking mitochondrial liabilities early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mitochondrial-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation and electrode-based measurement techniques.
- Demands access to polarography and TPP-selective electrode instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility of quantitative outputs.
- Adaptable to various organ systems and species with protocol optimization.
- Careful handling is needed to avoid air bubbles and ensure stable oxygen consumption readings.
