Name: Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Leer een echogeleide, percutane intramyocardiale injectietechniek voor het afleveren van humane iPS-afgeleide cardiomyocyten bij muizen met myocardinfarct. Deze methode is minder invasief en verbetert de reparatieve eigenschappen van de cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Major Research Plan van de National Natural Science Foundation of China (nr. 91539111 tot JY), Key Project of Science and Technology van de provincie Hunan (nr. 2020SK53420 tot JY) en het Science and Technology Innovation Program van de provincie Hunan (2021RC2106 tot CF).

Alle dierproeven in deze studie werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het Second Xiangya Hospital van de Central South University. Zie de Tabel met materialen voor details over alle materialen en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt. De tijdlijnen voor celinjectie, beeldvorming en euthanasie zijn als volgt: t0- induce infarct, t1 week- beeld- en implantaatcellen, t2 weken- beeld- en implantaatcellen, t4 weken- definitieve beeldvorming, euthanasie en weefselverzameling.
1. hiPSC-cultuur, cardiomyocytendifferentiatie en celzuivering
<ol><li>Meng DMEM/F12 en keldermembraanmatrixoplossing met ijs bij 4 °C in een verhouding van 1,5:1, aliquot, en bewaar het resulterende mengsel (matrixverdunningsmiddel) bij -20 °C. Meng 25 ml DMEM/F12-kweekmedium bij 4 °C en 1 ml matrixverdunningsmiddel grondig met ijs en verdeel 1 ml/put in een plaat met 6 putten. Houd de plaat 1 uur rechtop in een incubator bij 37 °C en zuig het DMEM/F12-supernatant uit de putjes. Raak de onderkant van de 6-putplaat niet aan tijdens het uitvoeren van de procedure.</li>
	<li>Verwijder de cryopreservatiebuis met de hiPSC's uit vloeibare stikstof en ontdooi ze snel in een waterbad van 37 °C. Steriliseer het buitenoppervlak van de cryopreservatiebuis met 75% alcohol, veeg de alcohol af en breng de buis over naar een steriele ultraschone tafel.</li>
	<li>Gebruik een pipet om de cryopreservatieoplossing met hiPSC's voorzichtig over te brengen in een centrifugebuis van 15 ml, voeg 5 ml invoervrij ES-medium toe en centrifugeer de suspensie gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur bij 300 × g . Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen voorzichtig in 6 ml van het feedervrije ES-medium. Tel de cellen en pas de celconcentratie aan op 5 × 105 cellen/ml met het kweekmedium.</li>
	<li>Voeg ROCK-remmer (Y27632) toe aan de hiPSC's tot een eindconcentratie van 5 μM. Breng de hiPSC's met Y27632 over naar de 6-well-plaat die is voorbehandeld met keldermembraanmatrix en draai voorzichtig de 6-well-plaat, waarbij de vorm van het getal "8" wordt gevolgd om de hiPSC's gelijkmatig te verdelen. Plaats de hiPSC's in een vochtige incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur rechtop. Vervang het supernatant door het feedervrije ES-medium zonder de Y27632.</li>
	<li>Wanneer hiPSC's 80% mate van samenvloeiing bereiken, zuigt u het kweeksupernatant op, wast u de cellen tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), voegt u insulinevrije RPMI1640 + B27 toe met 10 μM CHIR99021 (GSK3-β-remmer) en plaatst u de hiPSC's gedurende 24 uur in een vochtige CO 2-incubator bij 37 °C.</li>
	<li>Vervang de helft van het supernatant door RPMI1640 + B27 medium zonder insuline en incubeer de cellen gedurende nog eens 24 uur.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium volledig door RPMI1640 + B27 (zonder insuline). Plaats de platen in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur rechtop.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium na 3 dagen volledig door insulinevrije RPMI1640 + B27 + 5 μM IWR1 (Wnt-signaalwegremmer) en plaats de platen in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium na 5 dagen door RPMI1640 + B27 zonder insuline en blijf gedurende 48 uur incuberen in een vochtige CO 2-incubator bij 37 °C.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium na 7 dagen door het RPMI + B27 (inclusief insuline) medium en plaats de platen gedurende 3 dagen in een bevochtigde CO 2-incubator bij 37 °C. Vervang het medium elke 3 dagen door het RPMI + B27 medium. Zoek naar het spontaan kloppen van cellen na 9-12 dagen differentiatie.</li>
	<li>Vervang na het observeren van de pulserende cellen het RPMI + B27-medium door glucosevrij RPMI 1640-medium dat melkzuur bevat (1 ml melkzuur toegevoegd aan 500 ml glucosevrij RPMI 1640-medium). Incubeer de cellen gedurende 72 uur in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Vervang na 72 uur het supernatant door RPMI + B27 medium en incubeer gedurende 48 uur in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Zuig het kweeksupernatant op onder onderdruk en was de cellen 3x met PBS om sporen van het kweekmedium te verwijderen. Gebruik het enzymmengsel voor celloslating om de hiPSC-CMs bij 37 °C in afzonderlijke cellen te dissociëren. Verzamel de verkregen cellen in een centrifugebuis van 15 ml met 3 ml cardiomyocytenondersteuningsoplossing, centrifugeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur bij 300 × g en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen met RPMI + B27-medium, zaai ze op 6-putplaten met keldermembraanmatrix en incuber ze gedurende 48 uur in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Vervang het kweeksupernatant voor zuivering door glucosevrij RPMI 1640-medium dat melkzuur bevat en incubeer gedurende 72 uur in een vochtige incubator bij 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Vervang het kweeksupernatant door RPMI + B27 medium en verander het medium om de 3 dagen.</li>
	<li>Ga door met het bovenstaande proces gedurende 30 dagen en vervang het kweeksupernatant door glucosevrij medium dat melkzuur bevat voor verdere zuivering. Incubeer de cellen gedurende 3 dagen met dit medium en vervang het supernatant door RPMI + B27. Kweek de cellen continu gedurende 30 dagen totdat de hiPSC-CMs stabiel kloppen en gebruik deze cellen voor intramyocardiale injectie bij muizen.</li>
</ol>2. Voorbereiding van hiPSC-CMs en de opstelling van een acuut myocardinfarctmodel bij muizen
<ol><li>Vacuüm aspirateer het kweeksupernatant van hiPSC-CMs gekweekt gedurende 60 dagen, was de cellen 3x met PBS en dissocieer de hiPSC-CMs in individuele cellen bij 37 °C met het celloslatingsenzymmengsel (~ 3-5 min). Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 15 ml met 5 ml RPMI + B27-medium en meng goed voordat u de cellen telt om het totale aantal cellen te berekenen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur op 300 × g . Gooi het supernatant weg en voeg cardiomyocytenondersteunend medium toe om te resuspenderen tot een concentratie van 0,6 × 105 cellen/μL.</li>
	<li>Houd de centrifugebuis met de geresuspendeerde hiPSC-CMs gereed bij 37 °C voor injectie 14,17,18,19,20.</li>
	<li>Plaats de muizen in een anesthesiedoos die is verbonden met isofluraan om anesthetische inhalatie te induceren, gevolgd door het gebruik van vetzalf op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl ze onder narcose zijn. OPMERKING: De isofluraanconcentratie was 5%. Let tijdens het experiment op laboratoriumventilatie.</li>
	<li>Let op verlies van reflexen in de voeten en het staartgebied na het knijpen wanneer de muis plat op de operatietafel wordt gelegd, wat wijst op voldoende anesthesie. Buprenorfine (0,1 mg/kg) intraperitoneaal toedienen.</li>
	<li>Smeer het haar op het midden van de nek en de linkerborst van de muizen in met een ontharingscrème en veeg de aangebrachte crème en het haar na 5 minuten af met gaas.</li>
	<li>Bevestig de ledematen en de muizenstaart met tape. Bevestig de snijtanden van de muis met een 2-0 zijden draad en tape. Steriliseer het operatiegebied (mediane nek en linkerborst) met drie afwisselende rondes betadine gevolgd door alcohol.</li>
	<li>Plaats een chirurgisch gordijn rond het gesteriliseerde chirurgische gebied. Maak vervolgens een mediane nekincisie met een fijne anatomische schaar en een fijne ontleedtang om de luchtpijp volledig bloot te leggen. Snijd indien nodig een paar voorste cervicale spieren af voor stabilisatie. OPMERKING: De operators waren blind voor de diergroepen.</li>
	<li>Breng een tracheale buis (20 G katheterpunctienaald) door de mond.</li>
	<li>Sluit de tracheale buis aan op de ventilator en controleer op thoracale beweging om ervoor te zorgen dat beide longen goed worden geventileerd.</li>
	<li>Pas de ademhalingsparameters aan (ademhalingssnelheid: 100-150 bpm, getijdenvolume 250-300 μL). Bevestig daarna de linkerachterpoot aan de rechteronderkant, maak de tape rond de linker bovenste ledemaat los en voer een thoracotomie uit in de 3-4 intercostale ruimte van de linker thorax met behulp van een fijne ontleedschaar en tang voor maximale blootstelling aan het hart.</li>
	<li>Verwijder met een tang het hartzakje onder een microscoop om de linker voorste dalende kransslagader (LAD) aan de onderrand van het linker atriale aanhangsel te visualiseren.</li>
	<li>Gebruik een 6-0 zijden draad om het proximale uiteinde van de LAD te ligaten. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat het acute MI-model voldoende is vastgesteld (wanneer de distale LAD op de ligatieplaats verandert van rood naar wit), sluit u de borstkas laag voor laag en hecht u de huid met 4-0 intermitterende hechtingen met schroefdraad. Voer alle bovengenoemde chirurgische procedures uit voor MI-inductie voor de schijngroep van dieren, behalve voor ligatie.</li>
	<li>Schakel de inhalatie-anesthesie uit, verwijder de canule nadat de muis de spontane ademhaling hervat en breng deze terug naar zijn kooi. Houd het dier in de gaten totdat het weer voldoende bewustzijn heeft om sternale lighouding te behouden. Breng het niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld. Dien intraperitoneale injecties van buprenorfine (0,1 mg/kg x 3 dagen) en carprofen (5 mg/kg x 1 dag) elke 12 uur postoperatief toe.</li>
	<li>Injecteer ciclosporine A (10 mg·kg-1·dag-1) in de intraperitoneale holte van muizen 3 dagen voor toediening van hiPSC-CMs om de afstoting van de getransplanteerde cellen te voorkomen. Injecteer ciclosporine A continu gedurende 1 maand na transplantatie.</li>
</ol>3. hiPSC-CM injectie onder echografische begeleiding
<ol><li>Na het instellen van het MI-model, wijst u de MI-modelmuizen (12 weken oude C57BL / 6-muizen; 22 g tot 24 g in gewicht, 50% mannelijk en 50% vrouwelijk) toe aan groepen met een enkele dosis (SD, n = 8 in deze studie) en groepen met meerdere doses (MD, n = 8 in deze studie) op de eerste post-MI-dag en plaatst u ze in de eerste en tweede week na MI in een anesthesiebox verbonden met 5% isofluraan voor de inductie van inhalatie-anesthesie gevolgd door tracheale intubatie.</li>
	<li>Smeer het haar op de borst en bovenbuik van de muizen in met ontharingscrème en veeg de crème 5 minuten later af met gaas. Controleer de hartslag van de muis op de operatiekaart en dien inhalatie-isofluraan toe totdat de hartslag op 400-500 bpm wordt gehouden.</li>
	<li>Bevestig de ledematen en staart van de muis met tape op de detectieconsole en stel de platformtemperatuur in op 37 °C.</li>
	<li>Breng een speciale ultrasone gelei aan op de bovenbuik en gebruik een kleinere veterinaire ultrasone sonde met hoge resolutie om leverbeelden van muizen te verkrijgen.</li>
	<li>Verlaag de ventilatorsnelheid tot 50 bpm. Gebruik een microspuit van 5 μL om ~3 × 105 cellen te tekenen (vanaf stap 2.1). Houd de spuit vast met een micromanipulator en steek een naald van 3 mm in het linker para-xiphoid-proces (figuur 1A). Volg de bovenrand van het middenrif onder echografische begeleiding (figuur 1B), observeer het ademhalingsritme en -bereik (figuur 1C, D) en voer het hartzakje in aan het einde van de expiratoire cyclus om schade aan de lever en de longen te voorkomen (figuur 1D).</li>
	<li>Nadat de micro-injectornaald de pericardholte is binnengegaan, past u de ademhalingssnelheid aan op de oorspronkelijke parameter (150 bpm). Verkrijg het parasternale lange-asbeeld van het muizenhart door M-schimmel echocardiografie volgens de instructies van de fabrikant17 (figuur 1E). Injecteer onder ultrasone begeleiding 3 × 10 5 cellen (figuur 1F) in drie marginale gebieden (1 × 105 cellen per geïnjecteerde plaats) van de infarctplaats.</li>
	<li>Verwijder de speciale ultrasone sonde en spoel de gelei af. Spenen de muis van de inhalatie-anesthesie en breng hem na volledig bewustzijn terug naar zijn kooi.</li>
	<li>Herhaal de bovenstaande echogeleide celinjectieprocedures 1 en 2 weken na het vaststellen van MI voor de MD-groep muizen.</li>
</ol>4. Evaluatie van de hartfunctie, fluorescentielabeling, getransplanteerd celgetal, myocardinfarct en detectie van menselijke mitochondriën van organen bij muizen 30 dagen na de ligatie van de linker voorste dalende tak
<ol><li>Hartfunctie beoordeling<ol><li>Plaats de muis in een met isofluraan verbonden anesthesiedoos voor inductie-inhalatie-anesthesie, gevolgd door het gebruik van vetzalf op de ogen om uitdroging te voorkomen tijdens anesthesie. Verwijder het haar op de linkerborst van de muis met ontharingscrème. Leg de muis op het bedieningspaneel om de hartslag te controleren en de isofluraaninhalatie aan te passen. Houd de hartslag van de muis op 400-500 bpm. Het experimentele eindpunt is dag 30 (na de MI-inductie).</li>
		<li>Bevestig de ledematen en staart van de muis met tape op de detectieconsole en stel de platformtemperatuur in op 37 °C.</li>
		<li>Na het aanbrengen van een speciale ultrasone gel op het voorste hartgebied, gebruikt u een (veterinaire) cardiale ultrasone sonde met hoge resolutie om parasternale beelden met lange as en tweedimensionale korte-asbeelden te verkrijgen onder echocardiografie van M-schimmel en B-schimmel volgens de instructies van de fabrikant17.</li>
		<li>Nadat de ultrasone detectie is voltooid, spoelt u de speciale ultrasone gel af, schakelt u de inhalatie-anesthesie uit en brengt u de muis na volledig bewustzijn afzonderlijk terug naar zijn kooi.</li>
		<li>Analyseer de verkregen gegevens en bereken de linkerventrikel ejectiefractie (EF) en fractionele verkorting (FS) met behulp van de analysesoftware. Zorg ervoor dat de operator blind is voor de experimentele groepen17.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluorescentie-etikettering van secties<ol><li>Was het geïsoleerde hart met PBS, dompel het onder in 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 12 uur. Haal het hart eruit en dompel het gedurende 24 uur onder in 30% sucrose om uit te drogen.</li>
		<li>Sluit het gedehydrateerde hart in met de optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding op droogijs. Snijd het hart van onder tot aan de top met een cryostaatdikte van 10 μm en plaats de secties op dia's en bewaar de dia's bij -20 °C.</li>
		<li>Was de dia's met het hartweefsel met PBS gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Permeabiliseer het weefsel op dia's met 0,5% Triton X-100 bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten en was ze 3x met PBS gedurende 5 minuten per wasbeurt.</li>
		<li>Nadat u het weefsel hebt bedekt met 10% ezelsserum en 90% PBS (blokkeringsoplossing), blokkeert u de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Na het verwijderen van de blokkerende oplossing, incubeer de secties met het primaire antilichaam (verdund tot 1:100 met de blokkerende oplossing) gedurende een nacht bij 4 °C. Was ze 3x met PBS gedurende 5 min per wasbeurt.</li>
		<li>Incubeer het weefsel op glaasjes met fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam (verdund tot 1:100 met de blokkerende oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: Vermijd het blootstellen van de weefsels met het fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichaam aan licht vanaf dit punt.</li>
		<li>Was de dia's 3x met PBS gedurende 5 min per wasbeurt.</li>
		<li>Monteer de dia's met behulp van 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-bevattend montagemedium en fotografeer onder een fluorescentiemicroscoop17.</li>
	</ol></li>
	<li>Getransplanteerde hiPSC-CMs tellen17<ol><li>Voer weefselimmunofluorescentiekleuring uit op bevroren delen van het hart voor voetgangersspecifieke troponine T (hcTnT), humaan nucleair antigeen (HNA) en niet-specifieke sarcomerische alfa-actinine.</li>
		<li>Nadat het hele hart serieel is gesneden, neemt u één sectie voor elke 50 secties voor fluorescentie-etikettering.</li>
		<li>Leg willekeurig vijf afbeeldingen met een hoge vergroting per segment vast. Tel het geënte aantal gezichtsvelden, bereken het gemiddelde aantal getransplanteerde cellen per oppervlakte-eenheid en stel ze in als A1/μm2. Bereken het totale geënte oppervlak van het segment met ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) en stel dit in als B1μm2, zodat het geënte getal in dit segment = A1 × B121,22.</li>
		<li>Bereken het totale aantal getransplanteerde cellen per muizenhart met behulp van Eq (1) en het percentage engraftmentsnelheid met Eq (2), aangezien uit elke 50 secties één sectie werd gekozen21,22.</li>
		<li>Totaal aantal getransplanteerde cellen per muizenhart = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ Een × Bn) × 50 (1) engraftment tarief = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63647/63647eq01.jpg" style="margin: auto;"> (2) OPMERKING: Het aantal leveringen bedroeg 3 × 10 5 voor de SD-groep en 3 × 3 × 105 voor de MD-groep.</li>
	</ol></li>
	<li>Beoordeling van het myocardinfarctgebied<ol><li>Snijd een dwarsdoorsnede bevroren sectie (korte as) van het geïsoleerde hart, van de top tot de basis van het hart met een dikte van 10 μm.</li>
		<li>Nadat het hele hart in serie is gesneden, neemt u één sectieschuif voor elke 30 secties en fixeert u deze in een voorverwarmde Bouin-oplossing bij 58 °C. Bevlek de sectie met 0,04% Direct Red en 0,1% Fast Green collageenvlekken (verdund in PBS) volgens de instructies van de fabrikant17.</li>
		<li>Gebruik software (bijv. ImageJ) om de beelden te analyseren na cross-sectionele fotografie van het hele lichaam van het hart onder een microscoop met behulp van Eq (3):14,17 Infarctgebied % = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63647/63647eq02.jpg" style="margin: auto;"> × 100% (3)</li>
	</ol></li>
	<li>Detectie van menselijk mitochondriaal DNA in verschillende organen<ol><li>Verdoof de muizen met 5% isofluraan en offer ze op door posterieure cervicale dislocatie. Ontleed de muizen 4 weken na celtransplantatie. Oogst de organen (lever, longen, hersenen, nieren, milt) en een deel van het myocardium (n = 3 in deze sectie).</li>
		<li>Maal elk orgaanweefsel in vloeibare stikstof en extraheer DNA uit het weefsel met behulp van de kit waarnaar wordt verwezen (zie de materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Volg de instructies van de fabrikant om de kit en primers waarnaar wordt verwezen te gebruiken (zie de materiaaltabel) om menselijk mitochondriaal DNA in de bovengenoemde weefsels te detecteren (vanaf stap 4.5.1).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Leuschner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+monocyte+kinetics+in+acute+myocardial+infarction+are+sustained+by+extramedullary+monocytopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).</li>
<li>Lázár, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart%3A+insights+from+the+fall-out%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li>
<li>Davis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art%3A+cardiac+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">State of the art: cardiac transplantation.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).</li>
<li>Mancini, D., Colombo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+assist+devices%3A+A+rapidly+evolving+alternative+to+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant.</a> Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).</li>
<li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+myocardial+remuscularization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Translating myocardial remuscularization.</a> Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+investigation+of+hypoxia-preconditioned+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+myocardial+repair+in+nonhuman+primates%3A+Paracrine+activity+without+remuscularization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization.</a> Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).</li>
<li>Kempf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+scalable+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).</li>
<li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).</li>
<li>Nguyen, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+strategies+to+address+the+major+clinical+barriers+facing+stem+cell+regenerative+therapy+for+cardiovascular+disease%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review.</a> JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).</li>
<li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remuscularization+of+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Remuscularization of the failing heart.</a> The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+hypoxia-preconditioned+mesenchymal+stem+cells+improves+infarcted+heart+function+via+enhanced+survival+of+implanted+cells+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+improves+Sca-1%2B+stem+cell+survival+and+directs+ischemic+cardiomyocytes+toward+a+prosurvival+phenotype+via+exosomal+transfer%3A+a+critical+role+for+HSF1%2FmiR-34a%2FHSP70+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway.</a> Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+from+CCND2-overexpressing+human+induced-pluripotent+stem+cells+repopulate+the+myocardial+scar+in+mice%3A+A+6-month+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).</li>
<li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+microvessels+improve+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocyte+engraftment+and+cardiac+function+after+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats.</a> Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+with+echocardiography-guided+multiple+percutaneous+left+ventricular+intramyocardial+injection+of+hiPSC-CMs+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873(2021).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+competent+DNA+damage-free+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair.</a> Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).</li>
<li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+preconditioning+enhances+transplantation+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice.</a> Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+engraftment+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+via+a+transient+inhibition+of+rho+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452(2019).</li>
<li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).</li>
<li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+revisited%3A+inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).</li>
<li>Rainer, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-specific+transforming+growth+factor+%CE%B2+suppression+blocks+neutrophil+infiltration%2C+augments+multiple+cytoprotective+cascades%2C+and+reduces+early+mortality+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocyte+therapy+in+mouse+permanent+ischemia+and+ischemia-reperfusion+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models.</a> Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167(2019).</li>
<li>Iwanaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+G-CSF+on+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De kritieke stappen van deze studie omvatten hiPSC-cultuur, cardiomyocytendifferentiatie, hiPSC-CM-zuivering en hiPSC-CM-transplantatie in de plaats van het myocardinfarct van de muis. De sleutel is om cardiale echografie te gebruiken om de behandeling transcutaan te leiden naar de infarctplaats aan de rand van het infarct waar hiPSC-CMs in het gebied werden geïnjecteerd.
Met de verlenging van de kweektijd verandert het hiPSC-CM-fenotype in morfologie (grotere celgrootte), structuur (spier, fi...

Wanneer acute MI optreedt, sterven myocardiale cellen in het infarctgebied snel als gevolg van ischemie en hypoxie. Verschillende ontstekingsfactoren komen vrij na celdood en breuk, terwijl ontstekingscellen de infarctplaats infiltreren om ontsteking1 te veroorzaken. Significant is dat fibroblasten en collageen, beide zonder contractiliteit en elektrische geleidbaarheid, de myocardiale cellen op de infarctplaats vervangen om littekenweefsel te vormen. Vanwege de beperkte regeneratiecapaciteit van cardiomyocyten bij volwassen zoogdieren is levensvatbaar weefsel gevormd na een groot infarctgebied meestal niet voldoende voor het handhaven van voldoende cardiale output2. MI veroorzaakt hartfalen en in ernstige gevallen van hartfalen kunnen patiënten alleen vertrouwen op harttransplantaties of ventriculaire hulpmiddelen om normale hartfuncties te behouden 3,4.
Na MI is de ideale behandelingsstrategie om de dode cardiomyocyten te vervangen door nieuw gevormde cardiomyocyten, waarbij elektromechanische koppeling met gezonde weefsels wordt gevormd. Behandelingsopties hebben echter meestal myocardiale berging aangenomen in plaats van vervanging. Momenteel behoren op stamcellen en voorlopercellen gebaseerde therapieën tot de meest veelbelovende strategieën om myocardherstel na MI5 te bevorderen. De transplantatie van deze cellen heeft echter verschillende problemen, voornamelijk het onvermogen van volwassen stamcellen om te differentiëren in cardiomyocyten en hun korte levensduur6.
De ethische kwesties met betrekking tot het gebruik van embryonale stamcellen (ES) kunnen worden omzeild door iPSC's, die een veelbelovende bron van cellen zijn. Bovendien beschikken iPSC's over sterke zelfvernieuwingscapaciteiten en kunnen ze differentiëren in cardiomyocyten7. Studies hebben aangetoond dat hiPSC-CMs getransplanteerd in de MI-site kunnen overleven en gap junctions vormen met gastheercellen 8,9. Omdat deze getransplanteerde cellen zich echter in de micro-omgeving van ischemie en ontsteking bevinden, is hun overlevingskans extreem laag10,11.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de overlevingskans van getransplanteerde cellen te verbeteren, zoals hypoxie en hitteschokvoorbehandeling van getransplanteerde cellen12,13, genetische modificatie 14,15 en de gelijktijdige transplantatie van cellen en haarvaten 16. Helaas worden de meeste methoden beperkt door complexiteit en hoge kosten. Daarom stelt deze studie een reproduceerbare, handige, relatief invasieve en effectieve hiPSC-CM-toedieningsmethode voor.
Echogeleide intramyocardiale celinjectie kan worden uitgevoerd met alleen een kleine veterinaire echografiemachine met hoge resolutie en een micro-injector, ongeacht de locatie. Onder echografische begeleiding is het direct afleveren van cellen onder het xiphoid-proces van het hartzakje naar het myocardium bij muizen een veilig protocol dat lever- en longschade voorkomt. Deze methode kan gelijktijdig met andere technologieën worden gecombineerd om de overlevingskans van getransplanteerde cellen aanzienlijk te verbeteren.

<table><tbody><tr><td>Antilichaam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cardiac troponin T</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse IgG H&amp;L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse IgG H&amp;L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150110</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&amp;L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&amp;L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150062</td><td></td></tr><tr><td>Human cardiac troponin T</td><td>Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>Isolectin B4</td><td>Vector</td><td>FL-1201</td><td></td></tr><tr><td>Sarcomeric alpha actinin</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement(minus insulin)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement(serum free)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17&ndash;504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bouin's solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SDHT10132</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>cyclosporine A</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-B0579</td><td></td></tr><tr><td>DIRECT RED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>365548-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>FAST GREEN FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-free RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Selleck</td><td>S7086</td><td></td></tr><tr><td>melkzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6661</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356234</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR Green MasterMix kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>echografie koppelingsmiddel</td><td>CARENT</td><td>22396269389</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S6390</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur en benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7500 Real-Time PCR</td><td></td></tr><tr><td>cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>fijne anatomische schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>fijne dissectiepincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Micro spuit</td><td>Hamilton</td><td>7633</td><td></td></tr><tr><td>Diermodelanesthesiemachine</td><td>MATRX</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-high resolutie klein dier echografie beeldvormingssysteem</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statistical Product and Service Solutions</td><td>IBM</td><td>21</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>1.48</td><td></td></tr><tr><td>Human mitochondrial DNA primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de voorwaartse primersequentie</td><td>CCGCTACCATAATCATCGCTAT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de omgekeerde primersequentie</td><td>TGCTAATACAATGCCAGTCAGG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

Het belangrijkste doel van celtherapie na myocardinfarct (MI) is om de celgetransplanteerde snelheid effectief te verbeteren, en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn een veelbelovende celbron voor hartherstel na ischemische schade. Een lage getransplanteerde snelheid is echter een belangrijk obstakel voor effectieve hartweefselregeneratie na transplantatie. Dit protocol toont aan dat meerdere hiPSC-CM echogeleide percutane injecties in een MI-gebied de celtransplantatiesnelheden effectief verhogen. De studie beschrijft ook het volledige hiPSC-CM-cultuurproces, voorbehandeling en echogeleide percutane toedieningsmethoden. Bovendien helpt het gebruik van menselijk mitochondriaal DNA de afwezigheid van hiPSC-CMs in andere muisorganen te detecteren. Ten slotte beschrijft dit artikel de veranderingen in hartfunctie, angiogenese, celgrootte en apoptose in de infarctgrenszone bij muizen 4 weken na celafgifte. Er kan worden geconcludeerd dat echocardiografie-geleide percutane injectie van het linkerventrikelmyocardium een haalbare, relatief invasieve, bevredigende, herhaalbare en effectieve cellulaire therapie is.

Echocardiografie voor evaluatie van de linkerventrikelfunctie van de muizen in elke groep toonde aan dat de MI-verwondingen effectief waren omgekeerd in de MD-groep (figuur 2A). Vergeleken met de MI-groep vertoonde de SD-groep een verhoogde ejectiefractie (EF) (van 30% tot 35%; Figuur 2B) en fractieverkorting (FS) (van 18% naar 22%; Figuur 2C) na MI. Het is echter nog belangrijker om op te merken dat meerdere injecties van de hiPSC-...

Echogeleide celafgifte rond de plaats van myocardinfarct bij muizen is een veilige, effectieve en handige manier van celtransplantatie.

Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Dit is het eerste rapport dat aantoont dat echocardiografie-geleide, percutane intramyocardiale injectie van cardiomyocyten de herstellende eigenschap van menselijke iPS-afgeleide cardiomyocyten aanzienlijk verbetert. Deze methode is een haalbare, bevredigende, herhaalbare minder invasieve en effectieve procedure voor het leveren van humane iPS-afgeleide cardiomyocytentherapie. Wij geloven dat percutane intramyocardiale toediening een veilige en efficiënte methode is voor lokale medicijnafgifte voor ziekten zoals ischemische hartziekte, myocardinfarct en hartfalen.Dit project wordt begeleid door professor Jinfu Yang en professor Jun Peng. het demonstreren van de procedure zal Xun Wu, Kele Qin en Kun Xiang, MD PhD's van mijn laboratorium en Di Wang, een PhD van Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research. Om te beginnen, vacuüm aspirateer de cultuur supernatant van een 60-daagse cultuur van hiPSC-CMs.Was de cellen driemaal met PBS. Dissocieer vervolgens de hiPSC-CMs in individuele cellen met behulp van het celloslatingsenzymmengsel bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten. Verzamel de cellen in een buis van 15 milliliter met vijf milliliter RPMI plus B27-medium en meng.Tel de cellen en bereken het totale aantal cellen. Centrifugeer de celsuspensie op 300G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in cardiomyocytensteunmedium tot een concentratie van 6 x 10 van de 4e cellen per microliter.Plaats de buis op 37 graden Celsius tot de injectiestap. Nadat de muis voldoende is verdoofd, fixeert u de ledematen en staart met tape. Bevestig vervolgens de snijtanden van de muis met een 2/0 zijden draad en tape.Steriliseer de mediane hals en linkerborst met drie afwisselende rondes betaïne gevolgd door alcohol. Maak een mediane nekincisie met een fijne anatomische schaar en een fijne ontleedtang. Snijd een paar voorste cervicale spieren af om de luchtpijp te stabiliseren en volledig bloot te leggen.Steek een 20-gauge katheterpunctienaald als een tracheale buis door de mond. Sluit de tracheale buis aan op de ventilator en controleer op thoracale beweging om ervoor te zorgen dat beide longen goed worden geventileerd. Pas de ademhalingsparameters aan.Bevestig vervolgens de linkerachterpoot aan de rechteronderzijde en maak de tape rond de linker bovenste ledemaat los. Voer met een fijne ontleedschaar en tang een thoracotomie uit op de drie tot vier intercostale ruimte van de linker thorax. Verwijder met een tang het hartzakje en lokaliseer de linker voorste dalende kransslagader.Gebruik een 6/0 zijden draad om het proximale uiteinde van de slagader te ligateren. Om ervoor te zorgen dat het acute myocardinfarctmodel wordt vastgesteld, wacht u tot de distale kant van de slagader op de ligatieplaats verandert van rood naar wit. Sluit de borst laag voor laag en hecht de huid met 4/0 draad.Voer voor de schijngroep van dieren alle chirurgische procedures uit, behalve ligatie. Plaats de muizen in de eerste twee weken na een hartinfarct in een anesthesiedoos die is verbonden met 5% isofluoraan en voer tracheale intubatie uit. Injecteer drie dagen voor toediening van hiPSC-CMs ciclosporine A in de intraperitoneale holte in een dosis van 10 milligram per kilogram per dag.Verwijder het haar van de borst en bovenbuik van de muis met ontharingscrème. Toevoerinhalatie isofluoraan totdat de hartslag op 400 tot 500 slagen per minuut wordt gehouden. Bevestig de ledematen en staart van de muis met tape op de detectieconsole en stel de platformtemperatuur in op 37 graden Celsius.Breng de echografie gelei aan op de bovenbuik. Met behulp van een hoge resolutie veterinaire echografie sonde, verkrijgen muis leverbeelden. Trek met behulp van een microliter microspuit ongeveer 3 x 10 tot de 5e hiPSC-CMs.Houd de spuit vast en plaats een naald van drie millimeter bij het linker paraxiphoïde proces. Volg onder echografische begeleiding de bovenrand van het diafragma. Observeer het ademhalingsritme en het bereik.Voer het hartzakje in aan het einde van de expiratoire cirkel en vermijd schade aan de lever en de longen. Verkrijg vervolgens het parasternale lange-asbeeld van het muizenhart door B-modus echocardiografie. Injecteer onder ultrasone begeleiding 1 x 10 in de 5e hiPSC-CMs-cellen in elk van de drie marginale gebieden van de infarctplaats.Verwijder de ultrasone sonde en spoel de gelei af. Spenen de muis van de anesthesie en breng hem terug naar zijn kooi. Injecteer cyclosporine A continu gedurende één maand na transplantatie.Echocardiogram van de linker ventrikel toonde aan dat de verwondingen als gevolg van een myocardinfarct omgekeerd waren in de groep met meerdere doses. Transplantatie van hiPSC-CMs resulteerde ook in verhoogde ejectiefractie en fractieverkorting. Meting van hartparameters met behulp van Sirius Red en Fast Green-kleuring toonde aan dat de infarctgrootte en collageenvolumefractie afnamen, terwijl de dikte van de linkerventrikel voorste wand na transplantatie toenam.Etikettering voor niet-specifieke alfa-actine in groen, DAPI in blauw en mensspecifieke troponine T in rood toonde de aanwezigheid van getransplanteerde cellen in infarct en marginaal infarctgebied. Het aantal en het percentage getransplanteerde cellen waren hoger in de groep met meerdere doses in vergelijking met een enkele dosis. 28 dagen na een hartinfarct vertoonde de groep met meerdere doses een toename van het aantal cellen dat de endotheelcelmarker, I-B4, tot expressie bracht.Tarwekiemagglutinine en sarcomerische alfa-actininekleuring op cardiomyocyten vertoonden een vermindering van de minimale vezeldiameter. Een lager aantal tunnelpositieve cardiomyocytenkernen in de groep met meerdere doses duidde op verminderde apoptose. PCR-analyse detecteerde het menselijke mitochondriale DNA alleen in het hart, met specifieke transplantatie.Zorg er bij het inbrengen van de naald voor dat deze de pericardholte binnengaat, samen met de bovenste marge van het diafragma en aan het einde van de expiratoire cirkel om de verwonding aan de lever of de long te voorkomen.

ultrasound-guided-induced-pluripotent-stem-cell-derived-cardiomyocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Intramyocardial cel levering in muriene modellen van cardiovasculaire ziekten, zoals hypertensie of myocardiaal infarct, wordt veel gebruikt om het therapeutisch potentieel van verschillende celtypes in regeneratieve studies testen. Daarom zal een gedetailleerde beschrijving en een duidelijke visualisatie van deze chirurgische procedure helpen om de beperkingen en voordelen van cardiovasculaire cel therapeutische analyses in kleine knaagdieren te definiëren.

Intramyocardiale Cell Levering: Waarnemingen in Muizen Harten

Echocardiografie-geleide percutane intramyocardiale injectie vertegenwoordigt een efficiënte, betrouwbare en richtbare modaliteit voor de levering van genoverdracht agentia of cellen in muizen hart. Naar aanleiding van de stappen in dit protocol, kan de operator snel bevoegd in deze veelzijdige, minimaal invasieve techniek geworden.

Echogeleide Transthoracale intramyocardiale Injectie in Muizen

We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Hier beschrijven we de voorbereiding van levensvatbare ventriculaire plakjes van volwassen muizen en hun gebruik voor scherpe elektrodeactiepotentiële opnamen. Deze multicellulaire preparaten leveren een geconserveerde in vivo weefselstructuur, waardoor ze in vitro een waardevol model vormen voor elektrofysiologische en farmacologische studies.

Murine Korte As Ventriculaire Hartschijven voor Elektrofysiologische Studies

Hier presenteren we een protocol voor de inductie van links ventriculaire cryoinjury gevolgd door de inplanting van een patch van de hartspier, afgeleid van menselijke iPS-cel cardiomyocytes in een cavia-model.

Implantatie van hiPSC afkomstige hartspier Patches na myocardiale letsel in een cavia-Model

In dit protocol demonstreren en uitwerken we over het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen voor cardiomyocyt differentiatie en zuivering, en verder, over hoe de transplantatie-efficiëntie te verbeteren met de met Rho geassocieerde proteïnekinaseremmer voor behandeling in een muis myocardinfarct model.

Verbetering van de Engraftment van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten via een voorbijgaande remming van de activiteit van Rho kinase

We hebben getracht een varkensmodel van hartfalen op te stellen dat werd veroorzaakt door linker slagaderblokkades en snelle pacing om het effect en de veiligheid van intramyocardiale toediening van stamcellen voor celgebaseerde therapieën te testen.

Vaststelling van een varkensmodel van post-myocard hartinfarct voor stamcelbehandeling

Stamcellen worden voortdurend onderzocht als mogelijke behandelingen voor personen met myocardiale schade, maar hun verminderde levensvatbaarheid en retentie in gewond weefsel kan hun werkzaamheid op lange termijn beïnvloeden. In dit manuscript beschrijven we een alternatieve methode voor stamcellevering in een murinemodel van ischemie reperfusieletsel.

Vertraagde intramyocardial levering van stamcellen na Ischemie Reperfusie Letsel in een Murine Model

Dit protocol is bedoeld om een 3D-bioprint patch te transplanteren op het epicardium van infarct muizen die hartfalen modelleren. Het bevat details met betrekking tot anesthesie, de chirurgische borstopening, permanente ligatie van de linker voorste aflopende (LAD) kransslagader en toepassing van een bioprinted patch op het infarct gebied van het hart.

Transplantatie van een 3D Bioprinted Patch in een Murine Model van Myocardikoesie Infarct

Stamcelgebaseerde therapie is naar voren gekomen als een efficiënte strategie om gewonde hartweefsels te herstellen na een myocardinfarct. Wij bieden een optimale in vivo toepassing voor stamceltransplantatie met behulp van gelatinehydrogels die enzymatisch met elkaar verbonden kunnen zijn.

Intramyocardtransplantatie van MSC-Loading Injecteerbare Hydrogels na myocardinfarct in een Murine-model

Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor echocardiografie-geleide intramyocardiale injecties in rattenmodellen van een myocardinfarct met behulp van een naald van 29 G x 88 mm. Deze techniek zorgt voor een robuuste, nauwkeurige en reproduceerbare toediening van therapeutische middelen rechtstreeks in de peri-infarctzone.

Echocardiografiegeleide injectie voor gerichte en betrouwbare intramyocardiale stamcelafgifte in een rattenmodel van een myocardinfarct

Leer een echogeleide, percutane intramyocardiale injectietechniek voor het afleveren van humane iPS-afgeleide cardiomyocyten bij muizen met myocardinfarct. Deze methode is minder invasief en verbetert de reparatieve eigenschappen van de cellen.

Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen

Meer video's verkennen