Name: Detectie van Wolbachia Stam wAlbB in Aedes albopictus cellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Leer vier complementaire methoden om intracellulaire Wolbachia te detecteren in Aedes albopictus-cellen. Deze protocollen verbeteren de nauwkeurigheid van infectiedetectie en ondersteunen onderzoek naar Wolbachia-gastheerinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Dr. Xin-Ru Wang van de Universiteit van Minnesota voor inzichtelijke suggesties en begeleiding. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (No.81760374).

1. Materialen en reagentia
<ol><li>Gebruik pyrogene oplossingen en media voor celkweek (zie de Tabel van Materialen).</li>
	<li>Gebruik ultrapuur water om alle oplossingen voor te bereiden.</li>
	<li>Wees voorzichtig bij het selecteren van foetaal runderserum (FBS) voor celkweek, na een veelcontroleproces. OPMERKING: Aangezien FBS-partijen regelmatig kunnen worden gewijzigd, is het onmogelijk om de relevante catalogus en lotnummers in dit protocol te vermelden.</li>
	<li>Selecteer Aa23-celstammen afgeleid van A. albopictus-eieren , overeenkomend met Wolbachia-vrije Aa23-T.</li>
</ol>2. Celkweek
<ol><li>Bereid 25 cm2 celkweekkolven met 4 ml Schneider's medium met 10% FBS.</li>
	<li>Incubeer de kolven bij 28 °C onder een 5% CO2-atmosfeer gedurende 5 tot 7 dagen 7,24.</li>
	<li>Observeer niet-gekleurde Aa23- en Aa23-T-cellen in de kolven met behulp van lichtmicroscopie bij 100x vergroting (figuur 1).</li>
</ol>3. DNA-extractie
<ol><li>Kweek de cellen gedurende 5-7 dagen tot 70-80% samenvloeiing per kolf (stap 2). Oogst de cellen met handmatig pipetteren uit 1 ml geresuspendeerd kweekmedium door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 100 × g in een microcentrifuge.</li>
	<li>Verwijder het supernatant door aspiratie en bewaar de resulterende celpellet bij -20 °C.</li>
	<li>Resuspenseer de pellets in 0,40 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), plaats 50 μL van de oplossing in een microcentrifugebuis, voeg 5 μL proteïnase K (20 mg/ml) toe en incubeer bij 55 °C gedurende 1 uur. Verwarm ten slotte deze buizen gedurende 15 minuten op 99 °C om het ruwe DNA te verkrijgen en bewaar het bij -20 °C.</li>
</ol>4. Detectie van Wolbachia nucleïnezuur
<ol><li>PCR-analyse<ol>
<li>Voer PCR uit in een totaal reactievolume van 20 μL, met 8 μL ddH2O, 10 μL Taq polymerase (zie de tabel met materialen), 1 μL DNA-sjabloon (uit stap 3), 0,5 μL voor- en achterwaartse primers (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') en wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, respectievelijk.</li>
		<li>Gebruik de volgende PCR-omstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 35 cycli van denaturatie bij 94 °C, gloeien bij 55 °C en extensie bij 72 °C; vervolgens een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 7 min.</li>
		<li>Detecteer het DNA op een 1% agarose gel (1% w/v agarose in PBS) met behulp van een gel imager.</li>
	</ol></li>
	<li>qPCR-analyse<ol>
<li>Analyseer de Wolbachia-genoomkopie voor drie biologische replicaties (n = 6) uit het geëxtraheerde DNA (stap 3) met behulp van wsp-primers 183 F (5' AAGGAACCAGTTCATG 3') en QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, genormaliseerd met respectievelijk ribosomaal eiwit S6 (RPS6) voorwaartse en omgekeerde primers (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' en 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', respectievelijk)3.</li>
		<li>Genereer een standaardcurve voor wAlbB en RPS6.<ol>
<li>Extract DNA uit PMD-18T (een speciale vector voor efficiënt klonen van PCR-producten (TA-klonen)) recombinant plasmide dat wsp - en rps6-genfragmenten bevat (Supplemental File) en meet de plasmide-DNA-concentratie (zie de Tabel van Materialen).</li>
			<li>Converteer de plasmide-DNA-concentratie naar de getalconcentratie met behulp van Eq (1). Plasmide kopienummer = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63662/63662eq01v3.jpg"> (1)</li>
			<li>Verdun het plasmidekopienummer van 101 tot 108 met ultrapuur water en stel 3 replicaties in voor elke concentratiegradiënt.</li>
			<li>Voer qPCR-versterking uit met TB Green en een real-time PCR-systeem (zie de tabel met materialen) en noteer de resultaten van elke reactie. Gebruik de Ct-waarde om een standaardcurve te ontwikkelen. Analyseer het DNA in een totaal reactievolume van 20 μL, bestaande uit 7 μL ddH2O, 10,4 μL TB Green (zie de tabel met materialen), 1 μL DNA-sjabloon (geleverd door stap 3) en 0,8 μL voorwaartse en omgekeerde primers (10 μM). Gebruik de volgende reactieomstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s en gloeien bij 60 °C gedurende 35 s.</li>
			<li>Bereken de WSP - en RPS6-genkopienummers in de cellen volgens de vastgestelde standaardcurve en de Wolbachia-relatieve dichtheid door het kopieernummer van wsp/RPS6. Analyseer de gegevens met behulp van een onafhankelijke t-test.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Western blot analyse van Wolbachia eiwit<ol>
<li>Eiwitextractie<ol>
<li>Verzamel 2 × 107 Aa23- en Aa23-T-cellen uit de zesputtenplaat (vanaf stap 2) in een microcentrifugebuis, was ze drie keer met PBS en centrifugeer ze op 100 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
			<li>Bereid 1 ml lysaten met RIPA-lysisbuffer (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% natriumdeoxycholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat [SDS], 2 mM natriumpyrofosfaat, 25 mM β-glycerofosfaat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/ml leupeptine) en PMSF (eindconcentratie 1 mM).</li>
			<li>Voeg 200 μL lysisbuffer toe aan de celpellet en houd het 30 minuten op ijs. Centrifugeer de lysaten bij 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Test de wsp-concentratie van het supernatant met behulp van een bicinchonininezuur (BCA) eiwittestkit (zie de tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Laad gelijke hoeveelheden eiwit op een 15% SDS-PAGE gel [10% gedestilleerd water; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% ammoniumpersulfaat), 0,04% TEMED].</li>
		<li>Breng het eiwit over naar nitrocellulosemembranen, blokkeer de membranen met 5% magere melk gedurende 2 h 26,27 bij kamertemperatuur en was de membranen vervolgens drie keer met TBST (1 ml Tween 20 in 1 L TBS) (zie de materiaaltabel).</li>
		<li>Incubeer de membranen 's nachts bij 4 °C met 100 μL anti-wsp polyklonaal antilichaam (in eigen huis bereid, zie aanvullend dossier)), bereid door het primaire antilichaam te verdunnen met 5% magere melk (1:12.000).</li>
		<li>Was het primaire antilichaam drie keer met TBST.</li>
		<li>Incubeer de membranen in 100 μL mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam op een shaker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Was de membranen driemaal met TBST en meng 20 μL oplossing A (HRP Substrate Luminol Reagent) en 20 μL oplossing B (HRP Substrate Peroxide Reagent) in de chemiluminescentiedetectiekit in een verhouding van 1:1. Dompel het hele membraan tegelijkertijd onder in de luminescentieoplossing en observeer de signalen met behulp van een multifunctioneel beeldvormingssysteem.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescentielokalisatie van Wolbachia-eiwit<ol>
<li>Incubeer 5 × 105 Aa23- en Aa23-T-cellen bij 28 °C op een laserconfiscale petrischaal met een dikte van 0,17 mm aan de onderkant, onder een 5% CO2-atmosfeer gedurende 3 tot 4 dagen 7,24. Wacht tot de cel 60% -70% samenvloeiing heeft en was de cellen drie keer met PBS.</li>
		<li>Fixeer de cellen gedurende 20 minuten bij 4 °C in 1 ml van 4% (g/v) paraformaldehyde in PBS.</li>
		<li>Was de vaste cellen met PBST (0,2% v/v Triton X-100 in PBS) gedurende 5 minuten en was de cellen twee keer opnieuw met PBS.</li>
		<li>Incubeer de dia's gedurende 1 uur bij 37 °C in 1 ml runderserumalbumine van 3% (w/v) runderserum in PBS.</li>
		<li>Incubeer de dia's 's nachts in 100 μL muis anti-wsp polyklonaal antilichaam (bereid in eigen huis) en muizenserum (1:1.000 verdunning in PBS) in een natte doos (het kan de luchtvochtigheid handhaven en voorkomen dat vocht verdampt) bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder de dia's uit de natte doos en breng ze terug naar kamertemperatuur; was ze drie keer met PBS en verwijder de PBS. OPMERKING: Vanaf stap 4.4.7 moeten alle bewerkingen tegen licht worden beschermd.</li>
		<li>Incubeer de dia's met 100 μL van een Alexa Fluor 488-geconjugeerd geitenantimuisantilichaam (1:2.000 verdunning in PBS) bij 37 °C gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Incubeer de monsterglaasjes met 50 μL 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI verdund in PBS tot 10 μg/ml, bindt sterk aan DNA) bij 37 °C gedurende 5 minuten en was ze vervolgens driemaal met PBS.</li>
		<li>Observeer de immunostaining onder een confocale microscoop.<ol>
<li>Schakel de stroom en de laser in.</li>
			<li>Schakel de normale en kwiklampen van de microscoop in.</li>
			<li>Start het systeem en voer de besturingssoftware uit. Plaats een druppel cederolie op de monsterglaasjes, plaats de monsterglaasjes op het microscoopstadium en verplaats het podium naar de juiste positie.</li>
			<li>Klik op de kwiklampobservatieknop in de software, open de kwiklampsluiter en observeer het monster onder een omgekeerde microscoop om scherp te stellen.</li>
			<li>Gebruik het handmatige bedieningspaneel om groene en blauwe fluorescentie te selecteren om fluorescentiefoto's te maken onder een vergroting van 100x.</li>
			<li>Schakel de observatieknop van de kwiklamp uit en begin met het verkrijgen van afbeeldingen.</li>
			<li>Om een goede beeldkwaliteit te garanderen, scant u vooraf op scangrootte (512 pixels x 512 pixels). Pas de scangrootte aan om duidelijke afbeeldingen te krijgen (1.024 pixels x 1.024 pixels).</li>
			<li>Voer ruisonderdrukking uit als het achtergrondgeluid te hoog is.</li>
			<li>Stop met scannen en sla de afbeeldingen op.</li>
			<li>Schakel de kwiklamp en lasers uit.</li>
			<li>Veeg het doel af met 75% alcohol en verlaag het doel naar de laagste positie.</li>
			<li>Schakel de sluiter en de microscoop uit.</li>
			<li>Nadat het instrument is afgekoeld, bedek het met de stofkap.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Patholology%22%5BJournal%5D)">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li>
<li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Biologial+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li>
<li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li>
<li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li>
<li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evoution%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li>
<li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li>
<li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+Developmental+Biology+-+Animals%22%5BJournal%5D)">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li>
<li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+species+are+infected+with+Wolbachia%3F-A+statistical+analysis+of+current+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li>
<li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia%3A+master+manipulators+of+invertebrate+biology%5BTitle%5D)+AND+%22National+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li>
<li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li>
<li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Neill%2C+SL+%22Influential+passengers%3A+inherited+microorganisms+and+arthropod+reproduction%22">Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction</a>. , Oxford University Press. (1997).</li>
<li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+insecticides%3A+new+thinking+on+an+ancient+problem%5BTitle%5D)+AND+%22National+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li>
<li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li>
<li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li>
<li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li>
<li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li>
<li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043(2011).</li>
<li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833(2010).</li>
<li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue%2C+Chikungunya%2C+and+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li>
<li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459(2013).</li>
<li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase%2C+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li>
<li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li>
<li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754(2012).</li>
<li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483(2019).</li>
<li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Royal+Society+Publishing.+Proceedings+B%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li>
<li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach%2C+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li>
<li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+Science+B%22%5BJournal%5D)">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li>
<li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li>
<li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunofluorescence%2C+Western+blotting%2C+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Detectie van intracellulaire Wolbachia-infectie is essentieel voor de studie van Wolbachia-gastheerinteracties en de bevestiging van succesvolle transfectie van cellen met nieuwe stammen. In dit protocol werden vier methoden gebruikt om intracellulaire Wolbachia-infectie met succes te detecteren op het nucleïnezuur- en eiwitniveau. Deze vier experimentele methoden bevestigden en verbeterden de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van cellen. 
PCR we...

De Aziatische tijgermug Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), een belangrijke vector van het denguevirus (DENV) in Azië en andere delen van de wereld1, is een natuurlijke gastheer van twee soorten intracellulaire bacteriën, Wolbachia (wAlbA en wAlbB), die verspreid zijn over de kiembaan en somatisch weefsel 2,3. De Aa23-cellijn afgeleid van A. albopictus-embryo's bestaat uit ten minste twee morfologische celtypen, die beide infectie4 ondersteunen en kunnen worden genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica (Aa23-T). Aangezien Aa23 alleen albbbehoudt, is het een bruikbaar model voor de studie van gastheer-endosymbionten interacties 4,5,6.
Wolbachia wordt door de moeder overgedragen en infecteert naar schatting 65% van de insectensoorten 8,9 en 28% van de muggensoorten10. Het infecteert een verscheidenheid aan weefsels en vormt een intieme symbiotische relatie met de gastheer, meestal induceren cytoplasmatische incompatibiliteit (CI)11 en populatievervanging door het manipuleren van het voortplantingssysteem van de gastheer12,13. Deze gastheerresponsen zijn waargenomen in natuurlijke populaties van Drosophila simulans14 en in A. aegypti in een laboratoriumkooi en veldproef15. Een belangrijke niet-productieve manipulatie die door Wolbachia wordt uitgelokt, is geïnduceerde gastheerresistentie tegen een verscheidenheid aan pathogenen, waaronder DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) en West-Nijlvirus (WNV)16,17, dat kan worden gemedieerd door een verbeterd aangeboren immuunsysteem van de symbiont18,19, concurrentie tussen Wolbachia en virussen voor essentiële gastheerbronnen20, en manipulatie van gastheer virale verdedigingsroutes21 .
Dit protocol is ontwikkeld voor het bestuderen van deze onderliggende mechanismen van Wolbachia-geïnduceerde gastheer antivirale responsen. Het maakt gebruik van vier methoden voor de detectie van intracellulaire Wolbachia-infectie van Aa23-cellen. Deze methoden bieden een sterke theoretische basis voor studies van intracellulaire Wolbachia-infectie van andere gastheersoorten. De eerste methode, PCR - een krachtige techniek die de enzymatische amplificatie van specifieke DNA-regio's mogelijk maakt zonder gebruik te maken van conventionele kloonprocedures - werd gebruikt om Wolbachia-DNA te detecteren en de aanwezigheid / afwezigheid van Wolbachia-infectie te bepalen 22. De tweede methode meet de dichtheid van Wolbachia DNA-kopieën met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR) voor betrouwbare detectie en meting van producten die tijdens elke PCR-cyclus worden gegenereerd en die direct evenredig is met de hoeveelheid sjabloon vóór PCR23. De derde methode detecteert de aanwezigheid van intracellulaire Wolbachia-eiwitten , met behulp van western blot - een van de krachtigste hulpmiddelen voor het detecteren van specifieke eiwitten in complexe mengsels door de hoge scheidingskracht van elektroforese, de specificiteit van antilichamen en de gevoeligheid van chromogene enzymatische reacties te combineren. De laatste methode is een immunofluorescentietest (IFA) die immunologie, biochemie en microscopie combineert om het Wolbachia-oppervlakte-eiwit (wsp) te detecteren via een antigeen-antilichaamreactie om de cellulaire opname van Wolbachia te bevestigen en de cellulaire lokalisatie ervan te bepalen.
Dit artikel beschrijft de vier hierboven genoemde methoden om het bestaan van Wolbachia in de cellen te verifiëren, die kunnen worden gebruikt om te detecteren of de exogene Wolbachia met succes is getransfecteerd en de Wolbachia in de cel is gewist. Na het bepalen of Wolbachia al dan niet in de cellen aanwezig is, kunnen verschillende analyses worden uitgevoerd, waaronder genomics, proteomics of metabolomics. Dit protocol demonstreert de detectie van Wolbachia via Aa23-cellen, maar kan ook in andere cellen worden gebruikt.

<table><tbody><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>inSituX platform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerium-gedoteerd yttrium-aluminiumgarnet</td><td>MSE Supplies</td><td></td><td>Ce:Y3Al5O12, YAG enkele kristalsubstraten</td></tr><tr><td>Chiphouder</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Besturingssoftware</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dompelolie</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Type A lage viscositeit 150 cSt</td></tr><tr><td>inSituX platform</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR-lichtbron&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED met een glazen lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td></tr><tr><td>Buitenring&nbsp;</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomplasers&nbsp;</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, &Oslash;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Fundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veiligheidsring</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1-veer voor &Oslash;1" lensbuizen en montages</td></tr><tr><td>Kwartskristal zonder zaad</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm diameter Z-cut 0,05 mm dikte dubbelzijdig polijsten 8 mm op -X</td></tr><tr><td>Shim</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Röntgenstraalstop</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van wolbachia stam walbb in aedes albopictus cellijnen

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Als moederlijk gekoesterde endosymbiont infecteert Wolbachia grote delen van de insectenpopulaties. Studies hebben onlangs de succesvolle regulatie van RNA-virusoverdracht gemeld met behulp van Wolbachia-getransfecteerde muggen. Belangrijke strategieën om virussen te beheersen zijn de manipulatie van de reproductie van de gastheer via cytoplasmatische incompatibiliteit en de remming van virale transcripties via immuunpriming en concurrentie voor van de gastheer afgeleide bronnen. De onderliggende mechanismen van de reacties van Wolbachia-getransfecteerde muggen op virale infectie zijn echter slecht begrepen. Dit artikel presenteert een protocol voor de in vitro identificatie van Wolbachia-infectie op het nucleïnezuur- en eiwitgehalte in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-cellen om het begrip van de interacties tussen Wolbachia en zijn insectenvectoren te verbeteren. Door het gecombineerde gebruik van polymerasekettingreactie (PCR), kwantitatieve PCR, western blot en immunologische analytische methoden is een standaard morfologisch protocol beschreven voor de detectie van Wolbachia-geïnfecteerde cellen dat nauwkeuriger is dan het gebruik van een enkele methode. Deze aanpak kan ook worden toegepast op de detectie van Wolbachia-infectie in andere insectentaxa.

Voordat Wolbachia werd gedetecteerd, werden Aa23- en Aa23-T-cellen waargenomen onder een lichtmicroscoop om eventuele morfologische verschillen tussen de twee cellijnen te bepalen. Aa23- en Aa23-T-cellen hebben ten minste twee celmorfologieën, maar geen duidelijk morfologisch verschil tussen de twee celtypen (figuur 1). Hier werden Aa23-cellen gebruikt als een modelsysteem om Wolbachia-infectie te detecteren met behulp van vier methoden. Positieve amplifica...

Vier methoden werden gebruikt om intracellulaire Wolbachia te detecteren, die elkaar aanvulden en de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van Aedes albopictus-afgeleide Aa23 en Aa23-T genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica verbeterden.

Detectie van Wolbachia Stam wAlbB in Aedes albopictus cellijnen

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Dit protocol helpt het bestaan van Wolbachia in cellen te verifiëren, wat de basis is voor het begrijpen van de interactie tussen Wolbachia en zijn gastheer. In dit protocol werden vier methoden gebruikt om intracellulaire Wolbachia-infectie met succes te detecteren, wat de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van cellen bevestigde en verbeterde. De procedure wordt gedemonstreerd door Qiuqiu Xiao, een postdoctoraal van het Key Laboratory of Modern Pathogen Biology and Characteristics.Begin met het observeren van niet-gekleurde Aa23- en Aa23-T-cellen bij 100x vergroting met behulp van lichtmicroscopie. Kweek de cellen gedurende vijf tot zeven dagen om 70 tot 80% samenvloeiing per kolf te bereiken. Breng met behulp van een pipet 1 ml van het kweekmedium over naar een microcentrifugebuis.Centrifugeer op 100 RCF gedurende vijf minuten om de cellen te oogsten. Verwijder het supernatant en bewaar de resulterende celpellet bij min 20 graden Celsius. Kweek de cellen gedurende vijf tot zeven dagen om 90 tot 100% samenvloeiing per kolf te bereiken.Resuspendeer de pellets in 0,40 ml PBS en breng 50 microliter van deze oplossing over naar een microcentrifugebuis. Voeg vijf microliter 20 mg/ml proteïnase K toe en incubeer gedurende een uur bij 55 graden Celsius. Incubeer vervolgens de buizen bij 99 graden Celsius gedurende 15 minuten om het ruwe DNA te verkrijgen en bewaar het bij min 20 graden Celsius.Om PCR uit te voeren, bereidt u een totaal reactiemengsel van 20 microliter voor en stelt u de PCR-voorwaarden in zoals beschreven in het tekstmanuscript. Detecteer het DNA op een 1% agarose gel met behulp van een gel imager. Voer kwantitatieve PCR-versterking uit met TB Green in een real-time PCR-systeem en noteer de resultaten van elke reactie.Analyseer het DNA in een totaal reactievolume van 20 microliter en stel de kwantitatieve PCR-condities in zoals beschreven in het tekstmanuscript. Bereken de WSP- en RPS6-genkopienummers in de cellen volgens de vastgestelde standaardcurve. Bereken vervolgens de relatieve dichtheid van Wolbachia door het kopieernummer van wsp/RPS6.Analyseer de gegevens met behulp van een onafhankelijke t-test. Voeg 200 microliter lysisbuffer toe aan de celpellet en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer de lysaten op 12.000 RCF gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en adem het supernatant aan.Analyseer de wsp-concentratie van het supernatant met behulp van een BCA-eiwittestkit, volgens de instructies van de fabrikant. Laad gelijke hoeveelheden eiwit op een 15% SDS-PAGE gel. Breng het eiwit over naar nitrocellulosemembranen en blokkeer de membranen met 5% magere melk gedurende twee uur bij kamertemperatuur.Was vervolgens de membranen drie keer met TBST. Incubeer de membranen 's nachts bij 4 graden Celsius met 100 microliter anti-wsp polyklonaal antilichaam bereid door het primaire antilichaam te verdunnen met 5% magere melk. Was het primaire antilichaam drie keer met TBST.Voeg 100 microliter mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam toe aan de membranen en incubeer het op een shaker gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was de membranen driemaal met TBST en meng 20 microliter oplossing A en 20 microliter oplossing B in de chemiluminescentiedetectiekit in een verhouding van één op één. Dompel het hele membraan tegelijkertijd onder in de luminescentieoplossing en observeer de signalen met behulp van een multifunctioneel beeldvormingssysteem.Op een Laser confocale petrischaal, incubeer Aa23 en Aa23-T cellen gedurende drie tot vier dagen bij 28 graden Celsius onder 5% atmosferische koolstofdioxide. Wanneer de cel 60 tot 70% samenvloeiing bereikt, wast u de cellen drie keer met PBS. Bevestig de cellen in één ml van 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.Was de vaste cellen met PBST gedurende vijf minuten en was de cellen twee keer opnieuw met PBS. Incubeer de petrischaal in één ml 3% runderserumalbumine gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Voeg 100 microliter anti-wsp polyklonaal antilichaam en muizenserum toe aan de dia's en incubeer het een nacht in een natte doos bij vier graden Celsius.Haal de petrischaal uit de natte doos en breng ze terug op kamertemperatuur. Was ze drie keer met PBS en verwijder de PBS. Bescherm de volgende procedures tegen licht.Incubeer de petrischaal met 100 microliter van een Alexa Fluor 488-geconjugeerd geitenantimuisantilichaam bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Incubeer het monster petrischaaltje met 50 microliter DAPI verdund in PBS tot 10 microgram / ml bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten en was ze vervolgens drie keer met PBS. Observeer de immunostaining onder een confocale microscoop.Voordat Wolbachia werd gedetecteerd, werden Aa23- en Aa23-T-cellen waargenomen onder een lichtmicroscoop om morfologische verschillen tussen de twee cellijnen te bepalen. De Aa23- en AA23-T-cellen hadden ten minste twee celmorfologieën, maar er werden geen duidelijke morfologische verschillen waargenomen tussen de twee celtypen. Met behulp van de diagnostische primers 81F/691R werd positieve amplificatie van het Wolbachia wsp-gen gedetecteerd in Aa23-cellen, maar niet in Aa23-T-cellen.De analyse van wolbachia-dichtheid in de cellijnen toonde een wsp/rps6-verhouding van 2,4 in Aa23-cellen, maar geen Wolbachia in Aa23-T-cellen. Western blot-analyse van eiwitextracten toonde een sterk wsp-signaal voor Aa23, maar er werd geen signaal gedetecteerd voor Aa23-T. De indirecte immunofluorescentietest detecteerde het wsp-eiwit in Aa23-cellen, terwijl alleen DAPI-gekleurd DNA werd gedetecteerd in Aa23-T-cellen.Zorg ervoor dat de kweekkolven gedurende vijf tot zeven dagen worden geïncubeerd bij 28 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide in de atmosfeer. Deze procedure kan worden gevolgd door elektronenmicroscopie waarbij men bijzondere aandacht moet besteden aan monstervoorbereiding en -sectie. De vier experimentele methoden die in deze studie werden gebruikt, bevestigden de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie in cellen, die ook van toepassing is op andere soorten cellen en weefsels.

detecting-wolbachia-strain-walbb-in-aedes-albopictus-cell-lines

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Wolbachia bacteriële infectie in Drosophila

Deze video beschrijft een methode voor het zuiveren van Wolbachia pipientis van een Anopheles gambiae cellijn en vervolgens het kweken van de endosymbiont in cel-vrij medium. Een test voor de levensvatbaarheid van de bacterie is aangetoond.

Behoud van Wolbachia in Cell-vrij medium

RNA-Seq-analyses worden steeds belangrijker voor het identificeren van de moleculaire grondslagen van adaptieve eigenschappen bij niet-modelorganismen. Hier wordt een protocol beschreven om differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren tussen diapauze en niet-diapauze Aedes albopictus muggen, van het kweken van muggen tot RNA-sequencing en bioinformatica-analyses van RNA-Seq-gegevens.

Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Aedes albopictus

Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia worden vrijgegeven in natuurlijke populaties te onderdrukken van de overdracht van arboviruses. We worden methoden beschreven aan achterzijde Ae. aegypti met Wolbachia infecties in het laboratorium voor experimenten en veld release, voorzorgsmaatregelen nemen om laboratorium aanpassing en selectie te minimaliseren.

Behoud van Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia

Dit protocol wordt beschreven hoe om virale infectie in vivo bij Drosophila melanogaster met behulp van de methode van de nano-injectie en de basistechnieken voor het analyseren van virus-gastheer interactie.

Oprichting van virale infectie en analyse van Host-Virus interactie bij Drosophila Melanogaster

Beschreven is een tijd- en ruimtebesparende methode om eieren te tellen en de broedsnelheden van individuele muggen te bepalen met behulp van 24 putweefselkweekplaten, die de schaal en snelheid van vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten aanzienlijk kunnen verhogen.

Verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor Aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (EAgaL-platen)

Een protocol om de microsporidische parasiet Edhazardia aediste cultuuren. De parasiet wordt doorgevoerd van de ene generatie Aedes aegypti muggen naar de volgende via horizontale overdracht in het larvestadium, gevolgd door verticale transmissie in het volwassen stadium. Levende sporoplasma's overleven op lange termijn in geïnfecteerde eieren.

Voortplanting van de Microsporidische Parasiet Edhazardia aedis in Aedes aegypti Muggen

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de paringsconcurrentie van mannelijke Aedes aegypti met fluorescerende kleurstof als marker. Vrouwelijke muggen worden blootgesteld aan zowel gemarkeerde als ongemarkeerde mannetjes voor copulatie. Na de paring worden hun spermathecae onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop om hun paringspartner te bepalen.

Met behulp van de fluorescerende kleurstof, Rhodamine B, om paringsconcurrentievermogen bij mannelijke Aedes aegypti-muggen te bestuderen

De manipulatie van RNA-interferentie (RNAi) vormt een formidabele uitdaging bij veel sluipwespen met een kleine grootte, zoals Trichogramma-wespen . Deze studie schetste een efficiënte RNAi-methode in Trichogramma denrolimi. De huidige methodologie biedt een robuust model voor het onderzoeken van genregulatie in Trichogramma-wespen .

RNA-interferentie in de ei-sluipwesp, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Microbiële gemeenschappen in muggen zijn veelbelovend voor vector biologische bestrijdingsstrategieën. De meeste symbionten zijn niet te kweken, waardoor metagenomische analyses nodig zijn. We beschrijven een methode om vrouwelijke muggen te ontleden en eierstokken, middendarm en speekselklieren te scheiden, kruisbesmetting te voorkomen, microbioomstudies op orgaanniveau te vergemakkelijken en het begrip van de rol van micro-organismen in de biologie van muggen te vergroten.

Dissectie van eierstokken, middendarm en speekselklieren van muggen voor microbioomanalyses op orgaanniveau

Cellijnen zijn nuttig bij studies naar intracellulaire organismen die niet buiten hun gastheercellen kunnen worden gekweekt. Hoewel met Wolbachia geïnfecteerde lijnen veel ontdekkingen mogelijk hebben gemaakt, kan de heterogeniteit binnen deze lijnen leiden tot variabele experimentele resultaten. We presenteren een protocol voor het genereren van eencellige klonen en continue culturen van met Wolbachia geïnfecteerde JW18-cellen.

Generatie van monoklonale culturen uit met Wolbachia geïnfecteerde Drosophila melanogaster JW18-cellijn

Leer vier complementaire methoden om intracellulaire Wolbachia te detecteren in Aedes albopictus-cellen. Deze protocollen verbeteren de nauwkeurigheid van infectiedetectie en ondersteunen onderzoek naar Wolbachia-gastheerinteracties.

Detectie van Wolbachia Stam wAlbB in Aedes albopictus cellijnen

Meer video's verkennen