Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen
31 maart 2022
Er wordt een protocol beschreven dat lasermicrodissectie gebruikt om individuele nematodenweefsels te isoleren voor RNA-sequencing. Het protocol vereist geen soortspecifieke genetische toolkits, waardoor genexpressieprofielen kunnen worden vergeleken tussen verschillende soorten op het niveau van single-tissue monsters.
We combineren laser capture microdissectie met een single cell RNA seek protocol genaamd CEL-Seq2 om transcriptomische datasets te genereren voor kleine individuele weefselmonsters. Met deze techniek kunnen we genexpressie bestuderen in weefsels of soorten die niet kunnen worden bestudeerd met behulp van traditionele celsorteermethoden. Bovendien biedt het meer specificiteit dan een bulk RNA-seq-benadering.
Hier demonstreerden we deze techniek voor de viercellige staartpunten van C.elegans vierde larvestadium mannetjes en hermafrodieten. Maar het mooie van deze aanpak is dat het zelfs kan worden toegepast op niet-modelsoorten. De procedure wordt gedemonstreerd door mevrouw Raya Jallad, promovendus van mijn laboratorium en Dr. Antonio Herrera, momenteel hoofd biomedisch wetenschapper aan de Baylor-school in Chattanooga, Tennessee.
Begin met het voorzichtig pipetteren van één tot twee milliliter M9-buffer tegen de wand van de plaat zonder te spuiten. Draai de plaat om de wormen te verjagen. Verwijder en gooi alle vloeistof en de wormen weg door de pipetpunt tegen de wand van de plaat aan de rand van de agar te plaatsen om te voorkomen dat er gaten prikken.
Deze video toont de plaat voordat moeders en larven worden verwijderd. Alleen embryo's mogen overblijven nadat de moeders en de larve zijn verwijderd. L1-larve begint te verschijnen na incubatie gedurende ongeveer een uur.
Plaats vervolgens het bord op 25 graden Celsius. Verwijder na een uur de plaat uit de couveuse. Laat voorzichtig een milliliter M9-buffer op de agar vallen en draai de plaat om de L1's los te maken, maar niet de embryo's.
Centrifugeer de buis en pipetteer de L1's rechtstreeks op het bacteriële gazon van een gezaaide plaat. Houd de wormen op 25 graden Celsius. Begin onder een dissectiemicroscoop bij een vergroting van 30 tot 50 X met het plukken van de mannetjes en de hermafrodieten van de synchronisatieplaten op afzonderlijke niet-gezaaide platen.
Mannetjes onderscheiden zich van hermafrodieten door de uitpuilende vorm en lichtere kleur van de mannelijke staarten in vergelijking met de puntige vorm en donkerdere kleur van de hermafrodietstaarten. Was de wormen van de plaat met één tot twee milliliter M9-buffer met behulp van een pipetpunt voorgewassen met M9-buffer met 0,01% reinigingsmiddel. Breng de wormen over in een centrifugebuis van één milliliter, draai gedurende één minuut en voeg een milliliter M9-buffer toe.
Nogmaals, draai een minuut. Voeg een milliliter ijskoude 70% methanol toe en meng goed. Herhaal de was met een milliliter methanol, meng goed.
Draai het een minuut en voeg 500 microliter 70% methanol toe. Meng het en bewaar het bij vier graden Celsius gedurende een uur tot een nacht. Pipet 20 microliter van de vaste wormen op de gecoate zijde van een polyethyleenntalaat of PEN-membraan glasschuif.
Wacht tot de methanol is verdampt. Verwijder het plastic schild over het podium en klik op de knop Voor het lossen met de opwaartse pijl voor het laden van de membraanglijders. Zorg ervoor dat de glijbaan volledig droog is, draai zodat het membraan naar beneden is gericht en plaats de dia.
Klik op Doorgaan in het venster voorbeeld wijzigen. De diahouder zal bewegen. Vervang vervolgens het plastic schild, aan de onderkant van het scherm, kies welke diahouder de dia bevat en klik op de ontlaadknop met de neerwaartse pijl om de buizen te laden.
Trek de lade eruit en verwijder het buisblok. Steek de buisdoppen van vier PCR-buizen van 500 microliter in de houder en vouw de buis eronder. Breng het blok terug naar de lade en schuif de lade terug in de microscoopfase.
Selecteer in het pop-upvenster van het apparaat voor het wijzigen van verzamelobjecten de optie PCR-buizen en klik op OK. Klik op de lege buislocatie linksonder op het scherm onder de buisdoppen van het collectorapparaat en selecteer tlbf in het bedieningspaneel van de microscoop voor helder veldverlichting met doorgelaten licht. Pas met de 2.5X-lens de focus aan totdat de wormen en de oppervlaktestructuur van het PEN-membraan zichtbaar zijn.
Schakel over naar de 20X-lens en verplaats het podium naar een gebied zonder wormen. Pas de focus zodanig aan dat de belachtige structuren in het membraan een gelige kleur hebben om de laser op het juiste brandpuntsvlak te richten en vervolgens de laserparameters in te stellen. Voor de staartpunten begin je met power 45 diafragma 30 in snelheid 20.
Selecteer in het laserbedieningspaneel kalibreren en volg de instructies. Klik vervolgens onderaan het scherm bij buisdoppen van collector-apparaat op positie A, selecteer aan de rechterkant van het scherm enkele vorm, gevolgd door tekenen en knippen. Selecteer vervolgens punt om te wijzen en teken een lijn.
Klik op start cut zodat de laser door het membraan snijdt. Zoek een worm en schakel over om te bewegen en te snijden. Gebruik de muis om door de staart te snijden.
Als u het monster wilt verzamelen, schakelt u over naar de instelling tekenen en snijden met de point-to-point-functie en tekent u vorm om de snede van een membraansectie te voltooien. Selecteer de volgende buis bij de buisdop van het collectorapparaat aan de onderkant van het scherm en snijd de volgende staartpunt. Zodra vier staarten zijn gesneden, lost u het buisrek door met de neerwaartse pijl op lossen te klikken.
Zoek de membraansecties onder een ontleedmicroscoop en ga verder met de downstream monsterverwerking. Hier RNA sequencing met CEL-Seq2. Pipetteer 1,2 microliter van een CEL-Seq2 primer master mix direct bovenop het monster en sluit de buis.
Label met het primernummer en plaats onmiddellijk de buisdop direct op een stuk droogijs om het monster te bevriezen en zo RNA-afbraak te voorkomen. Herhaal dit totdat alle monsters zijn verzameld. Bewaar de buisjes tot slot bij min 70 graden Celsius.
C.elegans L3 hermafrodieten en mannetjes op 21 tot 23 uur na het uitkomen kunnen onder een dissectiemicroscoop worden onderscheiden door de morfologie van hun staarten. Het verhaal van hermafrodiet is smal, terwijl dat van mannen gezwollen is en duidelijk lijkt. Het uiterlijk van de PEN-membraanschuifstructuur en wormstaart wordt op deze afbeeldingen weergegeven.
Hier is de scherpstelling correct voor de 20X en 40X lenzen bij de microscoop. De ontleedde staart, vrijgesneden PEN-membraan is hier zichtbaar. Na het sluiten van de opening in de snede, zal het membraanstuk in de buisdop onder de glijbaan vallen.
Een buisdop met een PEN-membraansectie met daarin een ontleedde staartpunt wordt hier getoond. De grafische afbeelding vertegenwoordigt de natuurlijke log getransformeerde unieke moleculaire identificatie of UMI-tellingen per individuele staartpunt voor verschillende tijdstippen en geslachten. De powsimR-software wordt gebruikt om te bepalen hoeveel onafhankelijke monsters nodig zijn om differentiële expressie- of DE-genen op verschillende expressieniveaus te detecteren.
De grafische afbeelding hier vertegenwoordigt de ware positieve snelheid om de DE-genen te detecteren tussen twee voorwaarden voor vier verschillende simulaties met verschillende steekproefgroottes per aandoening. De stippellijn geeft een echt positief percentage van 80% aan. De false discovery rate en dezelfde vier simulaties worden hier getoond.
De stippellijn geeft een detectiepercentage van 10% aan. De grafieken toonden aan dat een steekproefgrootte van 70 staartpunten per aandoening voldoende is voor het detecteren van de DE-genen, behalve voor de genen met zeer lage expressieniveaus. Voor een goede synchronisatie moet u ervoor zorgen dat alleen embryo's op de plaat aanwezig zijn.
Om ervoor te zorgen dat het monsterverlies niet verloren gaat, pipetteert u het primermengsel rechtstreeks op het PEN-membraangedeelte in de dop en sluit u de dop uiterst voorzichtig. Omdat het soort-agnostisch is, kunnen we dit protocol gebruiken om te onderzoeken hoe genregulerende netwerken zijn geëvolueerd voor homologe structuren in verschillende soorten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een techniek die laser capture microdissectie combineert met het CEL-Seq2 protocol voor het genereren van transcriptomische gegevens uit kleine individuele weefselmonsters. De methode maakt gedetailleerde genexpressieanalyse mogelijk in C. elegans en kan worden aangepast voor niet-modelsoorten, waardoor de behoefte aan soortspecifieke genetische tools wordt omzeild.
Belangrijkste studieonderdelen
Onderzoeksgebied
- Moleculair biologie
- Genexpressieprofilering
- Transcriptomics
Achtergrond
- Traditionele methoden zijn vaak onvoldoende voor het bestuderen van specifieke weefsels of soorten.
- Deze innovatieve aanpak maakt individuele weefselanalyse mogelijk.
- Benadrukt het nut van laser microdissectie in RNA-sequencing.
Gebruikte methoden
- Laser capture microdissectie
- C. elegans genitaliën (staartpunten) van larvale stadia
- CEL-Seq2 RNA-sequencing technologie
Belangrijkste resultaten
- Succesvol isoleren en verwerken van staartpunten van zowel mannelijke als hermafrodiet C. elegans.
- Maakt evaluatie van genexpressieniveaus in specifieke weefsels mogelijk.
- Demonstreert de aanpasbaarheid van de methode voor verschillende soorten.
Conclusies
- Deze studie toont een robuuste methode voor het isoleren en analyseren van weefselspecifiek RNA.
- De bevindingen verbeteren het begrip van genexpressie zonder de noodzaak van uitgebreide genetische tools.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Laser microdissection (LMD) combined with single-cell RNA-seq enables species-agnostic, high-specificity transcriptomic profiling of discrete tissues without requiring genetic modification or cell dissociation. This approach addresses a critical gap in early discovery by allowing functional genomics in non-model organisms and tissues where conventional toolkits are unavailable. The method enhances predictive confidence in target validation and supports cross-species comparative studies for portfolio expansion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression in native tissue microenvironments without species-specific genetic tools.
- Supports functional target validation by preserving cell context and minimizing stress-induced artifacts.
- Facilitates mechanistic de-risking for homologous tissue structures across diverse species.
- Improves predictive confidence in early-stage target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares highly specific tissue samples for downstream RNA-seq workflows, increasing assay relevance.
- Enables quantitative, reproducible transcriptomic outputs from small tissue samples.
- Supports standardization of sample preparation for cross-condition and cross-species comparisons.
- Provides a platform for scalable, reusable tissue-specific transcriptomics in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic data with disease-relevant tissue states for translational biomarker exploration.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation in both model and non-model organisms.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust, context-specific gene expression data.
- Facilitates comparative studies of gene regulatory networks across species for translational insights.
Pipeline & Workflow Integration
LMD-based tissue isolation integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling direct transcriptomic analysis of intact tissues prior to preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in native tissue contexts.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible tissue samples for quantitative RNA-seq analysis.
- Analytics: Provides quantitative gene expression measurements and statistical power analysis for condition comparisons.
- Translational Research: Enables cross-species and developmental stage comparisons for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, species-agnostic workflow for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue isolation and RNA-seq preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, context-specific data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and expansion into non-model species and tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection, microscopy, and RNA-seq library preparation.
- Needs access to LMD instrumentation and high-quality RNA-seq analytical infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Adaptation across species may require optimization of tissue preparation and synchronization protocols.
- Sample size and tissue accessibility may limit throughput; power analysis is essential for study design.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:00
Removing Mothers and Larvae and Collecting Newly Hatched L1s
2:00
Collecting L4 Males and Hermaphrodites and Fixation
3:07
Laser Microdissection and Setting up the Microscope
4:27
Cutting
6:27
Results: Appearance of Caenorhabditis elegans L3 Hermaphrodites and Males, the Focal Plane for the PEN Membrane Slide for Laser Dissection, and Power Analysis Using PowsimR
8:14
Conclusion
