Name: Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer laser microdissectie voor transcriptoomanalyse van individuele weefsels met CEL-Seq2. Deze methode werkt voor C. elegans en is geschikt voor niet-modelsoorten zonder specifieke genetische tools.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door NIH (R01GM141395) en NSF (1656736) subsidies aan DF en NIH fellowship (F32GM136170) aan AW. Figuur 1 is gemaakt met behulp van BioRender.com.

<ol><li>Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+%26%2334%3Bthe+worm%26%2334%3B+to+%26%2334%3Bthe+worms%26%2334%3B+and+back+again%3A+the+evolutionary+developmental+biology+of+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">From &#34;the worm&#34; to &#34;the worms&#34; and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes.</a> Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).</li>
<li>Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+model+systems+in+evolution+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nematode model systems in evolution and development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).</li>
<li>WormBase. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wormbase.org/#012-3-6">https://wormbase.org/#012-3-6</a> (2022).</li>
<li>WormAtlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://wormatlas.org">https://wormatlas.org</a> (2022).</li>
<li>WormBook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://wormbook.org">http://wormbook.org</a> (2022).</li>
<li>WormBook in Genetics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook">https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook</a> (2022).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li>
<li>Kaletsky, R., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+C.+elegans+adult+cells+and+tissues+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).</li>
<li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 365 (6459), 1971(2019).</li>
<li>Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+bulk%3A+a+review+of+single+cell+transcriptomics+methodologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications.</a> Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).</li>
<li>Von Stetina, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+microarray+profiling+experiments+reveal+a+comprehensive+picture+of+gene+expression+in+the+C.+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system.</a> Genome Biology. 8 (7), 135(2007).</li>
<li>Baugh, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeodomain+protein+PAL-1+specifies+a+lineage-specific+regulatory+network+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo.</a> Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).</li>
<li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3%27-end-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).</li>
<li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLoS One. 6 (4), 19505(2011).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Yanai, I., Hashimshony, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2-single-cell+RNA+sequencing+by+multiplexed+linear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification.</a> Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019(2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+grow+or+not+to+grow%3A+nutritional+control+of+development+during+Caenorhabditis+elegans+L1+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest.</a> Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+responses+throughout+the+Caenorhabditis+elegans+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle.</a> Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).</li>
<li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li>
<li>Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+defined+sub-stages+of+C.+elegans+vulval+development+in+the+fourth+larval+stage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage.</a> BMC Developmental Biology. 15, 26(2015).</li>
<li>Lytal, N., Ran, D., An, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+methods+on+single-cell+RNA-seq+data%3A+an+empirical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey.</a> Frontiers in Genetics. 11, 41(2020).</li>
<li>Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((powsimR%3A+power+analysis+for+bulk+and+single+cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).</li>
<li>Bolkova, J., Lanctot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+expression+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+using+single+molecule+RNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH.</a> Methods. 98, 42-49 (2016).</li>
<li>Ji, N., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+of+C.+elegans+worms+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos.</a> WormBook. , 1-16 (2012).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 7 (12), 2357(2017).</li>
<li>Baird, S. E., Chamberlin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+briggsae+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis briggsae methods.</a> WormBook. , 1-9 (2006).</li>
<li>Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+tipulae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Oscheius tipulae.</a> WormBook. , 1-8 (2006).</li>
<li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+transgenesis+efficiency+and+CRISPR-associated+tools+through+codon+optimization+and+native+intron+addition+in+Pristionchus+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes.</a> Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).</li>
<li>Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+dissociation+protocol+for+FACS-based+isolation+of+rare+cell+types+from+Caenorhabditis+elegans+L1+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae.</a> MethodsX. 7, 100922(2020).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
<li>Steiner, F. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+affinity+purification+of+nuclei+for+chromatin+profiling+in+whole+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).</li>
<li>Ebbing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).</li>
<li>Rödelsperger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+nematodes+identifies+sperm+cells+as+a+source+of+genomic+novelty+and+rapid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution.</a> Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).</li>
<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Kritieke stappen van de methode Indien correct uitgevoerd, zal de hier beschreven methode robuuste RNA-profielen verkrijgen met een relatief klein aantal laserontleden monsters (70 staartpunten in dit voorbeeld). Voor monsters van ontwikkelende dieren is nauwe synchronisatie echter van cruciaal belang om de variabiliteit tussen monsters te verminderen. Om deze reden beveelt het protocol de hatch-off-methode voor wormsynchronisatie aan. Hier kan de onderzoeker het leeftijdsverschil tussen individuen (1...

Nematoden - met name de rhabditid-nematoden gerelateerd aan het modelsysteem Caenorhabditis elegans - zijn om vele redenen een prachtige groep dieren voor evolutionaire ontwikkelingsbiologie (EDB) 1,2. Voordelen zijn onder meer hun kleine aantal cellen, gedefinieerde en consistente cellijnlijnen, transparantie en gemak van cultuur en houderij. Er zijn ook veel bronnen beschikbaar, waaronder hoogwaardige genomen voor meerdere soorten, en voor C. elegans, uitgebreide moleculair genetische hulpmiddelen en kennis over ontwikkeling, genetica, anatomie en fysiologie 3,4,5,6.
Net als bij veel andere organismen heeft het vermogen om transcriptoomdynamiek in afzonderlijke weefsels of afzonderlijke cellen te karakteriseren een revolutie teweeggebracht in de analyse van de ontwikkeling in C. elegans 7,8,9,10. In staat zijn om eencellige transcriptomen tussen nematoden te vergelijken, zou EDB op dezelfde manier transformeren met behulp van deze organismen. Dergelijke vergelijkingen zouden bijvoorbeeld inzicht geven in hoe genregulerende netwerken zijn geëvolueerd voor personages (eigenschappen) die zijn bewaard gebleven, voor personages die zijn afgeweken of voor personages die onafhankelijk zijn geëvolueerd.

Het isoleren van bepaalde weefsels of cellen van nematoden is echter een van de grote uitdagingen. Voor veel organismen kunnen afzonderlijke cellen worden losgekoppeld van weefsels en op een onbevooroordeelde manier worden geoogst of kunnen worden gelabeld met weefselspecifieke expressie van een fluorescerend eiwit en gesorteerd op fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)11. In C. elegans is high-throughput (HTP) isolatie van cellen meestal beperkt tot embryo's omdat de taaie buitenste cuticula (en hydrostatisch skelet) de celisolatie van larven en volwassenen heeft belemmerd. Om deze uitdaging te omzeilen, hebben sommige methoden genetische hulpmiddelen gebruikt in hele C. elegans-wormen, zoals weefselspecifieke mRNA-tagging12 en differentiële expressievergelijkingen tussen wildtype en mutanten die een celtype13 beïnvloeden. Meer recente methoden hebben de uitdaging overwonnen door de cuticula op te lossen om kernen14 of hele cellen 8,9,15 te isoleren. Celisolatie en celcultuur hebben echter de voor de hand liggende nadelen dat cellen worden verwijderd uit hun natuurlijke ontwikkelings- of anatomische context - bijvoorbeeld weg van cel-celsignalering en contact met de extracellulaire matrix - die naar verwachting het genexpressieprofiel zullen beïnvloeden15. Bovendien zijn de genetische hulpmiddelen en weefselspecifieke markers soortspecifiek (d.w.z. ze kunnen alleen worden gebruikt in C. elegans).
LMD biedt een alternatieve methode voor het isoleren van weefsels zonder de natuurlijke context van cellen te verstoren. Belangrijk voor EDB is dat LMD ook transcriptomen van homologe weefsels van verschillende soorten kan vergelijken zonder dat er soortspecifieke genetische toolkits nodig zijn als genoom- of hele transcriptoomsequenties van deze soorten beschikbaar zijn. LMD omvat het richten van weefsels door directe microscopische observatie en het gebruik van een lasermicrobeam - geïntegreerd in de optica van de microscoop - om het weefsel van belang uit te snijden en te oogsten (vast te leggen) 16. Beperkingen van LMD zijn dat het niet bevorderlijk is voor zeer HTP-benaderingen (hoewel de transcriptieprofielen voor staartpunten, zoals beschreven in dit protocol, robuust waren met ~ 70 monsters), bepaalde monsters moeilijk te ontleden kunnen zijn en sneden beperkt zijn tot de precisie van de laser en wat kan worden gevisualiseerd in de microscoop.
Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe LMD, gevolgd door single-tissue RNA-Seq, kan worden gebruikt om stadium- en weefselspecifieke transcriptoomgegevens van nematoden te verkrijgen. Specifiek demonstreert het LMD voor het isoleren van staartpunten van larven in het vierde stadium (L4) van C. elegans. Deze methode kan echter worden aangepast aan andere weefsels en, natuurlijk, verschillende soorten.
Bij C. elegans zijn er 4 cellen die de staartpunt maken bij zowel mannetjes als hermafrodieten. Tijdens het L4-stadium bij mannen - maar niet bij hermafrodieten - veranderen de staartpuntcellen van vorm en migreren ze vooraan en naar binnen. Dit proces komt ook voor bij sommige, maar niet alle andere rhabditid nematodensoorten. Daarom is de staartpunt een goed model voor de evolutie van seksuele dimorfe morfogenese. Door zijn positie is de staartpunt ook gemakkelijk te isoleren door LMD.
Om transcriptoomprofielen van staartpunten te verkrijgen, maakt het huidige protocol gebruik van CEL-Seq2, een RNA-seq-methode die is ontwikkeld voor enkele cellen17,18. Deze methode heeft verschillende voordelen voor lmd-afgeleide weefsels. CEL-Seq2 is zeer gevoelig en efficiënt en maakt gebruik van unieke moleculaire identificatiemiddelen (UMI's) om eenvoudige kwantificering van mRNA-metingen mogelijk te maken, in vitro transcriptie om lineaire amplificatie te garanderen en barcodering die multiplexing van individuele weefselmonsters mogelijk maakt. De enige beperking van CEL-Seq2 is dat herstelde reads vertekend zijn tot het 3'-einde van mRNA's, en de meeste isovormen kunnen dus niet worden onderscheiden.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;0.5 &micro;M PEN membraan glazen platen RNase vrij</td><td>Leica</td><td>11600288</td><td>voor LMD</td></tr><tr><td>500 &micro;L PCR buizen (nuclease-vrij)</td><td>Axygen</td><td>732-0675</td><td>om de staartpunten in te snijden</td></tr><tr><td>Samengestelde microscoop met 40x objectief en DIC</td><td>elke</td><td></td><td>om de leeftijd van wormen te controleren</td></tr><tr><td>Desktopbevochtiger</td><td>elke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop met doorgelaten lichtbasis</td><td>elke</td><td></td><td>voor al het wormwerk</td></tr><tr><td>glazen pasteur pipetten</td><td>elke</td><td></td><td>handgreep van wormpick</td></tr><tr><td>glas slides en deksels</td><td>elke</td><td></td><td>om de leeftijd van wormen te controleren</td></tr><tr><td>LMD6 microdissectie systeem</td><td>Leica</td><td>meerdere</td><td>om staartpunten te snijden</td></tr><tr><td>LoBind buizen 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>M9 Buffer</td><td></td><td></td><td>Recept in WormBook</td></tr><tr><td>Methanol 99,8%</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>om wormen te fixeren</td></tr><tr><td>NGM groeimedium</td><td>US Biological</td><td>N1000</td><td>Buffers en zouten moeten worden toegevoegd: Recept in WormBook</td></tr><tr><td>P10 pipet variabel volume</td><td>bijv. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet variabel volume</td><td>bijv. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipet variabel volume</td><td>bijv. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 1.000 &micro;L</td><td>elke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 1-10 &micro;L gefilterd</td><td>elke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>platina iridium draad</td><td>Tritech</td><td>PT-9010</td><td>om wormpick te maken</td></tr><tr><td>steriele en nuclease-vrije 1 mL centrifuge buizen</td><td>elke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Voeg een zeer kleine hoeveelheid toe aan M9 buffer om te voorkomen dat wormen aan de pipettips blijven plakken</td></tr><tr><td>geventileerde 6 mm plastic Petri schotels</td><td>elke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voor CEL-Seq2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation Systeem met reagentia voor gevoelige RNA- en DNA-detectie</td><td>Aligent</td><td></td><td>geautomatiseerd elektroforesesysteem</td></tr><tr><td>AMPure XP kralen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA opruimingskralen</td></tr><tr><td>Kraalbinding buffer&nbsp; 20% PEG8000, 2,5 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEL-Seq2 primers (zie Tabel S1)</td><td>Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf</td><td>6335000020</td><td>Thermische cycler met programmeerbare deksel en blok voor 200 &micro;l buizen.</td></tr><tr><td>DNA Polymerase I (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18052-025</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix 10 mM</td><td>elke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA ligase</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT Voor PCR Product Clean-Up</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td>exonuclease oplossing</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transcriptie Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>Voor stap 4.6.1</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>elke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix met HF Buffer</td><td>NEB</td><td>M0531</td><td>PCR mix stap 4.9.7</td></tr><tr><td>willekeurige hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN</td><td>IDT</td><td></td><td>een primer met 6 nucleotiden die willekeurig zijn</td></tr><tr><td>RNA Fragmentatie buffer</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA Fragmentatie stop buffer</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA PCR Index Primers (RPI1&ndash;RPI48)</td><td>Illumina, NEB of IDT</td><td></td><td>RPIX in protocol stap 4.9.7, sequenties verkrijgbaar bij Illumina</td></tr><tr><td>RNAClean XP kralen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Oppervlakte Decontaminant</td><td>Thermo Scientific</td><td>7000TS1</td><td>of een ander soortgelijk product</td></tr><tr><td>RNaseH (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Tweede streng buffer</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Superscripit II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>reverse transcriptase</td></tr></tbody></table>

laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologieën hebben een revolutie teweeggebracht in de analyse van de transcriptomen van specifieke celtypen. Ze vereisen echter vaak soortspecifieke genetische "toolkits", zoals promotors die weefselspecifieke expressie van fluorescerende eiwitten aansturen. Verder verwijderen protocollen die weefsels verstoren om individuele cellen te isoleren cellen uit hun oorspronkelijke omgeving (bijvoorbeeld signalering van buren) en kunnen ze resulteren in stressreacties of andere verschillen met inheemse genexpressietoestanden. In het huidige protocol is lasermicrodissectie (LMD) geoptimaliseerd om individuele nematodenstaarttips te isoleren voor de studie van genexpressie tijdens de morfogenese van de mannelijke staartpunt.
LMD maakt de isolatie van een deel van het dier mogelijk zonder de noodzaak van cellulaire verstoring of soortspecifieke toolkits en is dus van toepassing op elke soort. Vervolgens kunnen eencellige RNA-seq-bibliotheekvoorbereidingsprotocollen zoals CEL-Seq2 worden toegepast op LMD-geïsoleerde afzonderlijke weefsels en worden geanalyseerd met behulp van standaardpijpleidingen, aangezien een goed geannoteerd genoom of transcriptoom beschikbaar is voor de soort. Dergelijke gegevens kunnen worden gebruikt om vast te stellen hoe geconserveerd of verschillend de transcriptomen zijn die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van dat weefsel in verschillende soorten.
Beperkingen zijn onder meer de mogelijkheid om het weefsel van belang uit te snijden en de steekproefgrootte. Uit een vermogensanalyse blijkt dat er maar liefst 70 staartpunten per conditie nodig zijn voor 80% vermogen. Nauwe synchronisatie van de ontwikkeling is nodig om dit aantal dieren in hetzelfde ontwikkelingsstadium te verkrijgen. Zo wordt ook een methode beschreven om dieren met intervallen van 1 uur te synchroniseren.

Na laservangst microdissectie, individuele staartpunten van mannetjes en hermafrodieten op 4 tijdstippen (L3 22 h na het uitkomen; L4 24, 26 en 28 uur na het uitkomen) werden voorbereid voor RNA-sequencing met behulp van het CEL-Seq2-protocol. CEL-Seq2 primers bevatten unieke barcodes waarmee sequencing reads van een bepaald monster (in dit geval een individuele staartpunt) bioinformatisch kunnen worden geïdentificeerd. Sequencinggegevens werden met deze methode gegenereerd voor een totaal van 557 staartpunten (266 herma...

Er wordt een protocol beschreven dat lasermicrodissectie gebruikt om individuele nematodenweefsels te isoleren voor RNA-sequencing. Het protocol vereist geen soortspecifieke genetische toolkits, waardoor genexpressieprofielen kunnen worden vergeleken tussen verschillende soorten op het niveau van single-tissue monsters.

Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

We combineren laser capture microdissectie met een single cell RNA seek protocol genaamd CEL-Seq2 om transcriptomische datasets te genereren voor kleine individuele weefselmonsters. Met deze techniek kunnen we genexpressie bestuderen in weefsels of soorten die niet kunnen worden bestudeerd met behulp van traditionele celsorteermethoden. Bovendien biedt het meer specificiteit dan een bulk RNA-seq-benadering.Hier demonstreerden we deze techniek voor de viercellige staartpunten van C.elegans vierde larvestadium mannetjes en hermafrodieten. Maar het mooie van deze aanpak is dat het zelfs kan worden toegepast op niet-modelsoorten. De procedure wordt gedemonstreerd door mevrouw Raya Jallad, promovendus van mijn laboratorium en Dr. Antonio Herrera, momenteel hoofd biomedisch wetenschapper aan de Baylor-school in Chattanooga, Tennessee.Begin met het voorzichtig pipetteren van één tot twee milliliter M9-buffer tegen de wand van de plaat zonder te spuiten. Draai de plaat om de wormen te verjagen. Verwijder en gooi alle vloeistof en de wormen weg door de pipetpunt tegen de wand van de plaat aan de rand van de agar te plaatsen om te voorkomen dat er gaten prikken.Deze video toont de plaat voordat moeders en larven worden verwijderd. Alleen embryo's mogen overblijven nadat de moeders en de larve zijn verwijderd. L1-larve begint te verschijnen na incubatie gedurende ongeveer een uur.Plaats vervolgens het bord op 25 graden Celsius. Verwijder na een uur de plaat uit de couveuse. Laat voorzichtig een milliliter M9-buffer op de agar vallen en draai de plaat om de L1's los te maken, maar niet de embryo's.Centrifugeer de buis en pipetteer de L1's rechtstreeks op het bacteriële gazon van een gezaaide plaat. Houd de wormen op 25 graden Celsius. Begin onder een dissectiemicroscoop bij een vergroting van 30 tot 50 X met het plukken van de mannetjes en de hermafrodieten van de synchronisatieplaten op afzonderlijke niet-gezaaide platen.Mannetjes onderscheiden zich van hermafrodieten door de uitpuilende vorm en lichtere kleur van de mannelijke staarten in vergelijking met de puntige vorm en donkerdere kleur van de hermafrodietstaarten. Was de wormen van de plaat met één tot twee milliliter M9-buffer met behulp van een pipetpunt voorgewassen met M9-buffer met 0,01% reinigingsmiddel. Breng de wormen over in een centrifugebuis van één milliliter, draai gedurende één minuut en voeg een milliliter M9-buffer toe.Nogmaals, draai een minuut. Voeg een milliliter ijskoude 70% methanol toe en meng goed. Herhaal de was met een milliliter methanol, meng goed.Draai het een minuut en voeg 500 microliter 70% methanol toe. Meng het en bewaar het bij vier graden Celsius gedurende een uur tot een nacht. Pipet 20 microliter van de vaste wormen op de gecoate zijde van een polyethyleenntalaat of PEN-membraan glasschuif.Wacht tot de methanol is verdampt. Verwijder het plastic schild over het podium en klik op de knop Voor het lossen met de opwaartse pijl voor het laden van de membraanglijders. Zorg ervoor dat de glijbaan volledig droog is, draai zodat het membraan naar beneden is gericht en plaats de dia.Klik op Doorgaan in het venster voorbeeld wijzigen. De diahouder zal bewegen. Vervang vervolgens het plastic schild, aan de onderkant van het scherm, kies welke diahouder de dia bevat en klik op de ontlaadknop met de neerwaartse pijl om de buizen te laden.Trek de lade eruit en verwijder het buisblok. Steek de buisdoppen van vier PCR-buizen van 500 microliter in de houder en vouw de buis eronder. Breng het blok terug naar de lade en schuif de lade terug in de microscoopfase.Selecteer in het pop-upvenster van het apparaat voor het wijzigen van verzamelobjecten de optie PCR-buizen en klik op OK. Klik op de lege buislocatie linksonder op het scherm onder de buisdoppen van het collectorapparaat en selecteer tlbf in het bedieningspaneel van de microscoop voor helder veldverlichting met doorgelaten licht. Pas met de 2.5X-lens de focus aan totdat de wormen en de oppervlaktestructuur van het PEN-membraan zichtbaar zijn.Schakel over naar de 20X-lens en verplaats het podium naar een gebied zonder wormen. Pas de focus zodanig aan dat de belachtige structuren in het membraan een gelige kleur hebben om de laser op het juiste brandpuntsvlak te richten en vervolgens de laserparameters in te stellen. Voor de staartpunten begin je met power 45 diafragma 30 in snelheid 20.Selecteer in het laserbedieningspaneel kalibreren en volg de instructies. Klik vervolgens onderaan het scherm bij buisdoppen van collector-apparaat op positie A, selecteer aan de rechterkant van het scherm enkele vorm, gevolgd door tekenen en knippen. Selecteer vervolgens punt om te wijzen en teken een lijn.Klik op start cut zodat de laser door het membraan snijdt. Zoek een worm en schakel over om te bewegen en te snijden. Gebruik de muis om door de staart te snijden.Als u het monster wilt verzamelen, schakelt u over naar de instelling tekenen en snijden met de point-to-point-functie en tekent u vorm om de snede van een membraansectie te voltooien. Selecteer de volgende buis bij de buisdop van het collectorapparaat aan de onderkant van het scherm en snijd de volgende staartpunt. Zodra vier staarten zijn gesneden, lost u het buisrek door met de neerwaartse pijl op lossen te klikken.Zoek de membraansecties onder een ontleedmicroscoop en ga verder met de downstream monsterverwerking. Hier RNA sequencing met CEL-Seq2. Pipetteer 1,2 microliter van een CEL-Seq2 primer master mix direct bovenop het monster en sluit de buis.Label met het primernummer en plaats onmiddellijk de buisdop direct op een stuk droogijs om het monster te bevriezen en zo RNA-afbraak te voorkomen. Herhaal dit totdat alle monsters zijn verzameld. Bewaar de buisjes tot slot bij min 70 graden Celsius.C.elegans L3 hermafrodieten en mannetjes op 21 tot 23 uur na het uitkomen kunnen onder een dissectiemicroscoop worden onderscheiden door de morfologie van hun staarten. Het verhaal van hermafrodiet is smal, terwijl dat van mannen gezwollen is en duidelijk lijkt. Het uiterlijk van de PEN-membraanschuifstructuur en wormstaart wordt op deze afbeeldingen weergegeven.Hier is de scherpstelling correct voor de 20X en 40X lenzen bij de microscoop. De ontleedde staart, vrijgesneden PEN-membraan is hier zichtbaar. Na het sluiten van de opening in de snede, zal het membraanstuk in de buisdop onder de glijbaan vallen.Een buisdop met een PEN-membraansectie met daarin een ontleedde staartpunt wordt hier getoond. De grafische afbeelding vertegenwoordigt de natuurlijke log getransformeerde unieke moleculaire identificatie of UMI-tellingen per individuele staartpunt voor verschillende tijdstippen en geslachten. De powsimR-software wordt gebruikt om te bepalen hoeveel onafhankelijke monsters nodig zijn om differentiële expressie- of DE-genen op verschillende expressieniveaus te detecteren.De grafische afbeelding hier vertegenwoordigt de ware positieve snelheid om de DE-genen te detecteren tussen twee voorwaarden voor vier verschillende simulaties met verschillende steekproefgroottes per aandoening. De stippellijn geeft een echt positief percentage van 80% aan. De false discovery rate en dezelfde vier simulaties worden hier getoond.De stippellijn geeft een detectiepercentage van 10% aan. De grafieken toonden aan dat een steekproefgrootte van 70 staartpunten per aandoening voldoende is voor het detecteren van de DE-genen, behalve voor de genen met zeer lage expressieniveaus. Voor een goede synchronisatie moet u ervoor zorgen dat alleen embryo's op de plaat aanwezig zijn.Om ervoor te zorgen dat het monsterverlies niet verloren gaat, pipetteert u het primermengsel rechtstreeks op het PEN-membraangedeelte in de dop en sluit u de dop uiterst voorzichtig. Omdat het soort-agnostisch is, kunnen we dit protocol gebruiken om te onderzoeken hoe genregulerende netwerken zijn geëvolueerd voor homologe structuren in verschillende soorten.

laser-microdissection-for-species-agnostic-single-tissue-applications

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Laser capture microdissectie van weefsel van zoogdieren

The video describes the laser dissection of the 3D organotypic co-culture model with micron-level precision. In 3D organotypic models, stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimensionally co-cultured with cancer epithelial cells. The 3D model serves as an experimental tool that enables invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser Microdissection: A Technique to Isolate Invading Colorectal Cancer cells from a 3D Organotypic Culture Model

This video describes the technique for obtaining a single cell from a heterogeneous cell population using laser capture microdissection. The single isolated cell can be used for further genomic studies or cancer research.

Single Cell Sampling Using Laser Capture Microdissection: A Technique to Harvest Target Cells from a Heterogeneous Cell Population

SIVQ-LCM is een innovatieve aanpak die een computer algoritme, Ruimtelijk Invariante Vector Quantization (SIVQ) benut, om de lasermicrodissectie (LCM) proces te sturen. De SIVQ-LCM workflow verbetert de snelheid en nauwkeurigheid van microdissection, met toepassingen in zowel de onderzoeks-en klinische settings.

SIVQ-LCM protocol voor de ArcturusXT Instrument

Microdissectie is uitgebreid toegepast voor de behandeling van DNA, RNA en eiwitten in weefsel. Laser capture microscopie (LCM) is de meest gebruikte methode, maar een nieuwe frees-techniek, mesodissection, is sinds kort beschikbaar. We tonen RNA extractie uit mesodissected formaline gefixeerd paraffine-ingebed weefsel slides van Mycobacterium tuberculosis granulomen.

A Novel Microdissection aanpak voor het herstellen<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Specifieke Afschriften van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde Lung Granulomen

De isolatie van individuele dopamine neuronen of het ventrale tegmentale met directe of indirecte immunohistochemie wordt aangetoond met behulp van lasermicrodissectie. Parameters voor isolatie van weefsel uit een glasplaatje met een infrarood laser en van membraansystemen dia met de combinatie van infrarood en ultraviolet laser besproken.

Lasermicrodissectie - Een demonstratie van de Isolatie van individuele dopamineneuronen en de Gehele Ventral tegmentum

Hier presenteren we een protocol voor laser-geassisteerde microdissectie van specifieke plantencellen voor transcriptioneel profileren. Hoewel het protocol geschikt is voor verschillende soorten en celtypen, is de focus op zeer ontoegankelijke cellen van de vrouwelijke kiemlijn die belangrijk zijn voor seksuele en apomictische reproductie in het kruisbloemigengeslacht Boechera.

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Dit protocol beschrijft een high-throughput workflow voor kunstmatige intelligentie-gedreven segmentatie van pathologie-bevestigde gebieden van belang van gekleurde, dunne weefselsectiebeelden voor verrijking van histologie-opgeloste celpopulaties met behulp van lasermicrodissectie. Deze strategie omvat een nieuw algoritme dat de overdracht van afbakeningen die interessante celpopulaties aangeven, rechtstreeks naar lasermicroscopen mogelijk maakt.

Geïndustrialiseerde, kunstmatige intelligentie-geleide lasermicrodissectie voor proteomische analyse op microschaal van de tumormicro-omgeving

Laseropname van microdissectie van orale submuceuze fibroseweefsels maakt nauwkeurige extractie van cellen mogelijk uit histologische regio's die van belang zijn voor de analyse van multi-omics-gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie.

Isolatie van cellen met morfologische en ruimtelijke informatie uit orale submuceuze fibrosemonsters door middel van microdissectie met laseropname

Dit protocol beschrijft een methode om RNA te isoleren uit gedefinieerde histologische gebieden van paraformaldehydegebonden, Optimal Cutting Temperature-verbinding-ingebedde muizenleverweefsel met behulp van lasercapture-microdissectie, waardoor gerichte downstream genexpressie-analyse mogelijk is.

Laservangstmicrodissectie van paraformaldehyde-gefixeerd muizenleverweefsel voor RNA-analyse

Leer laser microdissectie voor transcriptoomanalyse van individuele weefsels met CEL-Seq2. Deze methode werkt voor C. elegans en is geschikt voor niet-modelsoorten zonder specifieke genetische tools.

Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen

Meer video's verkennen