Kwantificeren van de bindingsinteracties tussen Cu (II) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen

Deze methode stelt de onderzoeker in staat om moeilijk te bestuderen systemen te onderzoeken, zoals peptiden en eerste rij overgangsmetaalionen, die beide over het algemeen een uitdaging vormen met behulp van meer standaardtoepassingen. Het grote voordeel hierbij is het gebruik van orthogonale technieken omdat ze elkaar goed aanvullen, en dat kan meer inzicht geven in het systeem en ons helpen om geen enkel fenomeen te missen. De methode die in deze video wordt beschreven, is zeer geschikt voor het bestuderen van andere systemen.

Hoewel we het laten zien met Cu (II) en een peptide, kan het worden gebruikt voor veel verschillende metaalpeptide- en metaaleiwitinteracties. Ik denk dat het moeilijkste deel zal zijn om een goede bufferkeuze te vinden voor je metaalion en peptide. Ik zou literatuur raadplegen om te zien welke buffers eerder door anderen zijn gebruikt.

het aantonen van de procedure zal Sohee Choi zijn, een afgestudeerde student in mijn onderzoekslaboratorium. Schakel om te beginnen de elektronische absorptiespectrofotometer in en laat deze ongeveer 15 tot 20 minuten opwarmen voor gebruik. Start vervolgens de spectrofotometersoftware en configureer de parameters, zoals het scanbereik van 200 tot 900 nanometer, het scanbereik van 200 nanometer per seconde en de gecorrigeerde basislijn voor dubbele bundels.

Verzamel vervolgens een basislijn zonder cuvetten of monsters in de balkpaden. Gebruik twee bijpassende cuvetten in de dubbelstraalspectrofotometer en laad één cuvette met 115 microliter ultrapuur water en de andere cuvette met 115 microliter van het peptidemonster terwijl u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen in de cuvetten zitten, omdat deze het signaal zullen verstoren. Plaats daarna de cuvette met ultrapuur water in de referentiestraal en de cuvette met peptide in de monsterbundel.

Verzamel vervolgens het absorptiespectrum van het metaalvrije peptide. Voeg een substoichiometrische hoeveelheid van de Cu(II)-oplossing toe aan het cuvet met het peptidemonster en noteer het volume voor analyse later. Pipeer dat voorzichtig op en neer om de oplossing te mengen en vermijd het genereren van luchtbellen.

Na vijf minuten balanceren plaatst u de cuvette terug in de monstercelhouder en registreert u het absorptiespectrum. Herhaal vervolgens de toevoeging van Cu(II)aliquots aan de peptideoplossing voor verschillende equivalenten en noteer het totale volume Cu(II)toegevoegd aan de cuvette. Na het initialiseren van de software zoals eerder beschreven in twee gematchte cuvetten laadt u één cuvette met 115 microliter ultrazuiver water en andere cuvette met 115 microliter van de koper-fen complexe oplossing.

Plaats de cuvette met water in de referentiebalk en de cuvette met koper-fen complexe oplossing in de monsterbundel. Verzamel vervolgens het absorptiespectrum van het metaalligandcomplex. Voeg daarna een stoichiometrische hoeveelheid peptide toe aan de koper-fen complexe oplossing en pijp dat voorzichtig op en neer om grondig te mengen, terwijl je voorzichtig bent om geen luchtbellen te introduceren.

Incubeer vervolgens de oplossing gedurende vijf minuten om een evenwicht te bereiken. Plaats de cuvette terug in de monstercelhouder en noteer het absorptiespectrum. Herhaal later de toevoeging van peptide-aliquots aan de koper-fen-complexoplossing voor verschillende equivalenten en noteer het volume toegevoegd peptide zodat de verdunde concentratie kan worden bepaald.

Schakel eerst de ITC in en start de ITC-software om het instrument uit te voeren. Na de eerste initialisatie, herplaats de buret en volg de instructies op het scherm. Verwijder vervolgens de buret en het deksel uit de referentiecel.

Verwijder vervolgens al het water uit de referentiecel en spoel drie keer met 450 microliter ontgast ultrazuiver water. Zuig langzaam ultrazuiver water op tot de 450 microliter markering van een laadspuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit komen. Steek vervolgens de laadspuit in de referentiecel totdat deze zich ongeveer een millimeter van de bodem bevindt en injecteer langzaam een deel van de oplossing totdat er 150 microliter in de laadspuit achterblijft.

Beweeg daarna de zuiger van de laadspuit snel op en neer met ongeveer 25 microliter meerdere keren om eventuele bellen op het celoppervlak los te maken. Injecteer vervolgens langzaam totdat de zuiger de markering van 100 microliter op de laadspuit bereikt, waardoor in totaal 350 microliter ultrazuiver water in de referentiecel wordt gedoseerd en de referentiecelafdekking wordt vervangen. Nadat u een restoplossing uit de monstercel hebt verwijderd, laadt u 450 microliter 10 millimol EDTA met behulp van een laadspuit en weekt u gedurende 10 minuten om ervoor te zorgen dat sporenmetaalionen worden verwijderd omdat de EDTA sporenmetalen bindt.

Spoel na het verwijderen van de EDTA-oplossing de laadspuit grondig af met overvloedige hoeveelheden ultrazuiver water. Reinig de ITC in overeenstemming met de aanwijzingen van de fabrikant door de monstercel te spoelen met ultrazuiver water. Verwijder eventueel restwater uit de monstercel en conditioneer de monstercel door ten minste driemaal met 450 microliter buffer te spoelen.

Verwijder vervolgens de resterende buffer die de monstercel conditionert en laad de peptideoplossing in de monstercel met behulp van de oplaadspuit. Spoel vervolgens de titratiespuit met 200 microliter van de gebufferde oplossing door eerst de zuiger te verwijderen. Pipetteer met behulp van een micropipet de bufferoplossing door het gat aan de bovenkant van de glazen titratiespuit door de spuit en uit de naald eronder.

Steek de zuiger later volledig in de titratiespuit. Dompel vervolgens de punt van de naald van de titratiespuit in de metalen oplossing en trek de zuiger langzaam omhoog, waardoor de metalen oplossing de spuit vult en resulteert in een leeg volume aan de bovenkant van het glazen deel van de titratiespuit. Om het leegtevolume te verwijderen, draait u de titratiespuit parallel aan de vloer.

Verwijder vervolgens de zuiger en kantel het glazen deel iets naar de vloer. Schud de titratiespuit voorzichtig zodat de oplossing naar het glazen deel van de titratiespuit gaat en het grootste deel van het lege volume opvult. Maar zorg ervoor dat er twee tot drie microliter leeg volume overblijft.

Terwijl u de spuit parallel aan de vloer houdt, plaatst u de zuiger opnieuw. Houd vervolgens de titratiespuit rechtop en dompel de punt van de naald terug in de metalen oplossing. Duw vervolgens de zuiger naar beneden totdat er geen lucht meer uit de naald komt en laad de titratiespuit door de zuiger langzaam omhoog te trekken tot net boven de 50 microlitermarkering terwijl de punt van de naald in de oplossing blijft.

Steek voorzichtig het glazen deel van de titratiespuit in de buret en schroef tot de vinger strak zit. Absorbeer daarna met behulp van een lichte delicate ruitenwisser de oplossing die uit de titratiespuit komt als gevolg van compressie van de zuiger zonder de punt van de naald aan te raken. Steek vervolgens de buret met een titratiespuit in de monstercel en bevestig deze stevig.

Als u de parameters van de ITC-software wilt instellen, selecteert u Instrument Control. Stel de roersnelheid en de temperatuur in. Voer vervolgens onder Experimentdetails de spuit- en celconcentraties in millimolaire eenheden in.

Selecteer vervolgens in de sectie Experimentmethode de optie Incrementele titratie. Klik op Instellen en geef 20 injecties van 2,5 microliter op en als er meer resolutie nodig is om de bindingsgebeurtenis waar te nemen, verhoog dan het aantal injecties en verlaag het volume per injectie. Voer daarna de tijdsafstand tussen elke injectie in, zodat deze lang genoeg is om het signaal in evenwicht te brengen en terug te keren naar de basislijn, meestal 300 seconden.

Klik vervolgens op de knop Uitvoeren om het experiment te starten en op te geven waar de gegevens worden opgeslagen. Titratie van Cu(II)werd uitgevoerd in C-Peptide waaruit bleek dat de toevoeging van 150 micromolaire Cu(II)een onmiddellijke toename veroorzaakte bij de band op 600 nanometer toegeschreven aan de d-d band van Cu(II) en bleef toenemen totdat 300 millimol Cu(II)werd toegevoegd. Verdere toevoeging boven 300 micromolaire Cu(II) verhoogde de absorptie van het d-d-verbod niet, wat wijst op verzadiging en dat Cu(II)bindt aan C-Peptide in een 1:1-complex met een log K-waarde van meer dan zes.

C-Peptide werd getitreerd in ongeveer 10 micromolaire koper-fen complex en de absorptie van de ladingsoverdrachtsband op 265 nanometer nam af, wat aangeeft dat het C-Peptide cu (II) uit het fenanthroline ligand kon cheleren met een log K-waarde van 7,4 tot 7,8. Het ITC thermogram toont de titratie van 1,4 millimol Cu(II)in 154 micromolair C-Peptide in 15 millimol MOPS buffer. De bindingsaffiniteit bleek een log K-waarde van acht te hebben met verandering in enthalpie als 8 kilojoule per mol.

Gibbs vrije energie als min 46 kilojoule per mol, en verandering in entropie als 120 joule per mol per kelvin. Een gecontroleerde titratie van 1,4 millimol Cu(II)in 15 millimol MOPS-buffer bij afwezigheid van C-Peptide vertoont geen binding in het thermogram. Ik zou zeggen zorg ervoor dat alles schoon is.

Als er metaalionen of peptiden overblijven van eerdere experimenten, kan dit de stoichiometrie drastisch beïnvloeden en onbekende concurrentie bieden in de bindingsexperimenten. Circulair dichroïsme is een andere methode om metaalpeptide- of metaaleiwitinteracties te bestuderen omdat het kijkt naar chiraliteit. Massaspectrometrie kan deze complexen ook ondervragen door te kijken naar veranderingen in massa.

Deze reeks technieken is gebruikt door veel laboratoria die metaalionen bestuderen die interageren met peptiden of eiwitten.