Name: Kwantificeren van de bindingsinteracties tussen Cu (II) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Leer de thermodynamica van Cu(II)-binding aan peptiden kwantificeren met elektronische absorptiespectroscopie en isotherme titratiecalorimetrie. Deze orthogonale technieken bieden diepgaand inzicht in metal-peptide interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SC bedankt de Whitehead Summer Research Fellowship. MJS bedankt de Startup Funds en het Faculty Development Fund aan de Universiteit van San Francisco. MCH erkent financiering van de National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) en de National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

1. Elektronische absorptiespectroscopie: directe titratie met bufferconcurrentie
<ol><li>Monstervoorbereiding<ol>
<li>Bereid een gebufferde oplossing van 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propaan-1,3-diol (bisTris) bij pH 7,4 met ultrapuur water (>18 MΩ weerstand). Verwijder sporenmetaalionen door gedurende ten minste 2 uur te broeden met een hars met hoge affiniteit en daaropvolgende filtratie.</li>
		<li>Los een bekende hoeveelheid van het peptide op of verdun het in de metaalvrije buffer. OPMERKING: Bij het monitoren van d-d-banden met kleine extinctiecoëfficiënten21 moeten hogere concentraties peptide worden gebruikt. Hier was de uiteindelijke concentratie van C-peptide in gebufferde oplossing 300 μM (volume hangt af van de grootte van het cuvet). C-peptide werd gesynthetiseerd door vaste-fase peptide synthese en is elders in de literatuur beschreven14.</li>
		<li>Los een bekende massa CuCl2 op in ultrapuur water om een oplossing te maken op 10-15 mM. OPMERKING: Het is belangrijk om het metaalzout in eerste instantie op te lossen in niet-gebufferd water om neerslag te voorkomen. Andere Cu(II)-zouten kunnen worden gebruikt, maar er moet voor worden gezorgd dat het anion zwak coördineert.</li>
	</ol></li>
	<li>Het experiment uitvoeren<ol>
<li>Schakel de elektronische absorptiespectrofotometer in en laat deze voor gebruik ~15-20 min opwarmen. Start de spectrofotometersoftware en configureer de parameters zoals scanbereik (200-900 nm), scansnelheid (200 nm / s) en dubbele bundel baseline-gecorrigeerd (meer parameters worden vermeld in het aanvullende bestand).</li>
		<li>Verzamel een basislijn zonder cuvetten of monsters in de bundelpaden.</li>
		<li>Gebruik twee overeenkomende cuvetten in de dubbelstraalspectrofotometer en laad één cuvette met 115 μL ultrapuur water en de andere cuvette met 115 μL van het peptidemonster. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de cuvetten zitten, omdat deze het signaal zullen verstoren.</li>
		<li>Plaats de cuvette met ultrapuur water in de referentiestraal en de cuvette met peptide in de monsterbundel.</li>
		<li>Verzamel het absorptiespectrum van het metaalvrije (apo) peptide.</li>
		<li>Voeg een sub-stoichiometrische hoeveelheid (0,5 equivalenten, 150 μM) van de Cu(II)-oplossing toe aan het cuvette met het peptidemonster. Zorg ervoor dat het volume cu(II) toegevoegd minder dan 3 μl is en noteer het volume voor analyse later.</li>
		<li>Pipetteer voorzichtig op en neer om de oplossing te mengen en vermijd het genereren van luchtbellen. Laat de oplossing reageren en balanceren gedurende 5 minuten en noteer het absorptiespectrum.</li>
		<li>Herhaal de toevoeging van Cu(II)-aliquots zoals in stap 1.2.6 in de peptideoplossing voor de volgende equivalenten: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 en 5,0 (of een totaal van 300, 450, 600, 900 en 1.500 μM). Zorg ervoor dat u het totale volume van cu(II) toegevoegd en het totale volume van de cuvette noteert. OPMERKING: Als er meer resolutie gewenst is, verkleint u de afstand tussen equivalenten.</li>
		<li>Verwijder de monstercuvette en reinig grondig volgens de aanwijzingen van de fabrikant.</li>
		<li>Voeg de gebufferde oplossing zonder peptide toe en noteer het absorptiespectrum. Herhaal de toevoeging van Cu(II)-aliquots zoals in stap 1.2.5-1.2.8, waarbij het absorptiespectrum voor elk Cu(II)-equivalent wordt geregistreerd.</li>
		<li>Exporteer alle spectra als csv-bestanden voor verwerking. Reinig de cuvetten grondig volgens de instructies van de fabrikant en schakel de spectrofotometer in.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwerking van de gegevens<ol>
<li>Laad alle spectra op een spreadsheetprogramma.</li>
		<li>Trek het buffer-only (0 μM Cu(II)) spectrum af van elk ander spectrum om eventuele absorptiekenmerken uit de buffer zelf te verwijderen.</li>
		<li>Normaliseer elk spectrum om rekening te houden met de verdunning als gevolg van de toevoeging van de Cu(II)-oplossing (stap 1.2.6). Zie het aanvullend bestand, Eq (1)14 voor een voorbeeld van de normalisatie waarbij vinitieel het volume (115 μL) van het aan de cuvette toegevoegde peptide is, vCu(II) het volume Cu(II)-oplossing is dat in stap 1.2.6 is toegevoegd, enAbs-bufferafgetrokken spectrum de gegevens zijn die zijn verkregen in stap 1.2.7.</li>
		<li>Maak alle spectra samen om gebieden van verandering te identificeren. OPMERKING: Typische d-d-banden van Cu (II) -complexen variëren van 500 tot 750 nm. Deze spectrofotometrische titratie kan een uitdaging zijn vanwege de kleine extinctiecoëfficiënt van d-d-banden, die Laporte-verboden overgangen zijn in octaëdrische geometrie21. Als de absorptie te zwak is, is een alternatieve benadering het gebruik van chromofore liganden die resulteren in ladingsoverdrachtsbanden bij binding aan Cu(II) (zie rubriek 2).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Elektronische absorptiespectroscopie: peptideconcurrentie met chromofoor ligand
<ol><li>Monstervoorbereiding<ol>
<li>Los 1,10-fenanthroline (fen) op in ultrapuur water om een uiteindelijke concentratie van ~1 mM te verkrijgen.</li>
		<li>Bereid naast de in rubriek 1.1 beschreven monstervoorbereiding voor het peptide (stap 1.1.2) en Cu(II) (stap 1.1.3) een 10 μM Cu(II) en 40 μM fenoplossing in buffer ([Cu(phen)3]2+). Zorg ervoor dat het volume de cuvette vult.</li>
	</ol></li>
	<li>Het experiment uitvoeren<ol>
<li>Start de elektronische absorptiespectrofotometer zoals in stap 1.2.1 en 1.2.2, maar stel het scanbereik in op 200-400 nm.</li>
		<li>Laad in twee gematchte cuvetten één cuvette met 115 μL ultrapuur water en de andere cuvette met 115 μL van de [Cu(phen)3]2+ oplossing. Plaats de cuvette met water in de referentiebalk en de cuvette met [Cu(phen)3]2+ oplossing in de monsterbundel.</li>
		<li>Verzamel het absorptiespectrum van het metaal-ligandcomplex.</li>
		<li>Voeg een stoichiometrische hoeveelheid (≈1 equivalenten, ≈10 μM) peptide toe aan de [Cu(phen)3]2+ oplossing. Pipetteer voorzichtig op en neer om grondig te mengen, maar pas op dat u geen luchtbellen introduceert. Noteer het volume van het toegevoegde peptide voor toekomstige analyse. OPMERKING: Met behulp van cuvetten die 115 μL bevatten, levert het toevoegen van 3,83 μL van 300 μM peptide een uiteindelijke peptideconcentratie van 9,7 μM op.</li>
		<li>Incubeer de oplossing gedurende 5 minuten om een evenwicht te bereiken. Noteer het absorptiespectrum. OPMERKING: Als de bindingsaffiniteit van het metaal-peptide en metaal-ligand vergelijkbaar zijn, zal de concentratie van toegevoegd peptide in grote overmaat moeten zijn. Zorg ervoor dat u rekening houdt met het totale volume van het toegevoegde peptide voor normalisatie.</li>
		<li>Herhaal de toevoeging van peptide aliquots in de [Cu(phen)3]2+ oplossing voor de volgende geschatte equivalenten: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 en 26. Noteer het volume van het toegevoegde peptide zodat de verdunde concentratie kan worden bepaald.</li>
		<li>Verwijder het monster en reinig de cuvette grondig volgens de instructies van de fabrikant. Verzamel een spectrum van de buffer. Verzamel een spectrum van 50 μM peptide in de buffer.</li>
		<li>Exporteer alle gegevens als csv-bestanden voor verwerking en reinig de cuvetten volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwerking van de gegevens<ol>
<li>Laad de spectra op een spreadsheetprogramma en trek het bufferspectrum af van de andere spectra.</li>
		<li>Normaliseer de spectra na Supplemental File, Eq (2)14.</li>
		<li>Gebruik de extinctiecoëfficiënt voor [Cu(phen)3]2+ bij 265 nm (εmax = 90.000 M-1 cm-1)22, bepaal de concentratie van [Cu(phen)3]2+ bij elke toevoeging van het peptide.</li>
		<li>Bepaal voor elke toevoeging van het peptide de concentratie van het Cu(II)-peptidecomplex door de resterende concentratie van [Cu(phen)3]2+, zoals bepaald in stap 2.3.2, af te trekken van de beginconcentratie van [Cu(phen)3]2+ (bij 0 μM peptide).</li>
		<li>Bereken de concentratie van vrijphenligand met de vergelijking in Supplemental File, Eq (3)14.</li>
		<li>Bereken de concentratie van vrij peptide met behulp van Supplemental File, Eq (4) 14, waarbij [peptide] voorraad het onverdunde peptide vertegenwoordigt dat in het cuvette is getitreerd, V1 het volume van het toegevoegde voorraadpeptide vertegenwoordigt, V2 het totale volume van het cuvet en [Cu2 +-peptide] wordt bepaald in stap 2.3.4.</li>
		<li>Bereken de experimentele bindingsaffiniteit (Kex) met behulp van Eq (5) in aanvullend bestand23.</li>
		<li>Relateer de dissociatieconstante van Cu(II)-peptide aan Kex door Eq (6)23 in Supplemental File, waarbij Kd,Cu(II)-phen = 1,0 × 10-9 (zie 22). Bepaal de gemiddelde en standaarddeviatie van alle bepaalde dissociatieconstanten. OPMERKING: Onder een 4:1 verhouding van fen:Cu(II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(phen)2]2+, en [Cu(phen)]2+ bestaan in de oplossing, en het peptide zal Cu(II) weg van de soort ([Cu(phen)]2+) met de zwakste binding22 chelate.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isotherme titratiecalorimetrie
<ol><li>Monstervoorbereiding<ol>
<li>Bereid een gebufferde oplossing van 15 mM 3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS) bij pH 7,4 met ultrapuur water (>18 MΩ weerstand). Verwijder sporenmetaalionen door gedurende ten minste 2 uur te broeden met een hars met hoge affiniteit met daaropvolgende vacuümfiltratie door een membraan van 0,45 μm op fles.</li>
		<li>Los een bekende massa CuCl2 op in ultrapuur water om een oplossing van ≈50-100 mM te bereiden. Verdun deze Cu(II)-oplossing tot buffer om een oplossing van 1,0 ml met een eindconcentratie van 1,4 mM Cu(II) te verkrijgen. Noteer het exacte volume van de gebruikte CuCl2-oplossing .</li>
		<li>Los de peptideoplossing op of verdun deze in buffer om 450 μL van een 154 μM peptide-oplossing te maken. Zorg ervoor dat hetzelfde aandeel extra ultrapuur water uit stap 3.1.2 aan de peptideoplossing wordt toegevoegd, waardoor de verdunningswarmte wordt verminderd en het signaal-naar-ruis toeneemt.</li>
		<li>Zorg er na de bereiding van de monsters voor dat de oplossingen op dezelfde pH staan en pas deze indien nodig dienovereenkomstig aan.</li>
		<li>Optionele stap: Ontgas de oplossingen om microbubbels te minimaliseren die in de ITC zijn geladen.</li>
	</ol></li>
	<li>Het experiment uitvoeren<ol><li>Schakel de ITC in. Start de ITC-software om het instrument uit te voeren. Wacht op de eerste initialisatie, die zal vragen om de buret opnieuw te huisvesten; volg vervolgens de instructies op het scherm.</li>
		<li>Verwijder de klep uit de referentiecel. Verwijder al het water uit de referentiecel en spoel driemaal met 450 μL ontgast ultrapuur water.</li>
		<li>Zuig langzaam ultrapuur water op tot de 450 μL-markering van een oplaadspuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit worden gebracht. Steek de doseerspuit in de referentiecel totdat deze ≈1 mm van de bodem is en injecteer langzaam een deel van de oplossing totdat er 150 μL in de doseerspuit achterblijft. Beweeg de zuiger van de laadspuit meerdere keren snel op en neer met ≈25 μL om eventuele bellen op het celoppervlak los te maken. Injecteer langzaam totdat de zuiger de 100 μL-markering op de laadspuit bereikt, waardoor in totaal 350 μL ultrapuur water in de referentiecel wordt afgegeven en vervang het referentieceldeksel.</li>
		<li>Verwijder eventuele restoplossing uit de monstercel en laad met 450 μL ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met behulp van een doseerspuit. Laat 10 minuten weken om ervoor te zorgen dat sporenmetaalionen worden verwijderd, omdat de EDTA sporenmetalen bindt.</li>
		<li>Verwijder de EDTA-oplossing (met gebonden sporenmetaalionen) en spoel de laadspuit grondig af met grote hoeveelheden ultrapuur water.</li>
		<li>Reinig de ITC in overeenstemming met de aanwijzingen van de fabrikant en spoel de monstercel met ultrapuur water.</li>
		<li>Conditioneer de monstercel door ten minste driemaal te spoelen met 450 μL buffer.</li>
		<li>Verwijder de buffer die de monstercel conditioneert. Laad de peptide-oplossing in de monstercel met behulp van de oplaadspuit (volg stap 3.2.3).</li>
		<li>Spoel de titratiespuit af met 200 μL gebufferde oplossing. Verwijder hiervoor de zuiger en gebruik een micropipette om de buffer door het gat aan de bovenkant van de glazen titratiespuit, door de spuit en uit de naald eronder te pipetteren.</li>
		<li>Steek de zuiger volledig in de titratiespuit.</li>
		<li>Dompel de punt van de naald van de titratiespuit in de metalen oplossing en trek de zuiger langzaam omhoog, waardoor de metalen oplossing de spuit vult en resulteert in een leeg volume aan de bovenkant van het glazen deel van de titratiespuit. Verwijder het grootste deel van het lege volume door de titratiespuit parallel aan de vloer te draaien, verwijder de zuiger en kantel het glazen deel enigszins naar de vloer. Geef de titratiespuit een zachte shake zodat de oplossing naar het einde van het glazen deel van de titratiespuit beweegt en het grootste deel van het lege volume opvult, maar zorg ervoor dat er 2-3 μL leegtevolume overblijft. Terwijl u de spuit evenwijdig aan de vloer houdt, plaatst u de zuiger opnieuw.</li>
		<li>Houd de titratiespuit rechtop, dompel de punt van de naald terug in de metalen oplossing en duw de zuiger naar beneden totdat er geen lucht meer uit de naald komt. Laad de titratiespuit door de zuiger langzaam omhoog te trekken tot net boven de 50 μL-markering terwijl de punt van de naald in de oplossing blijft.</li>
		<li>Steek voorzichtig het glazen deel van de titratiespuit in de buret en schroef tot het vingervast is. Wanneer een kleine hoeveelheid oplossing uit de titratiespuit komt als gevolg van compressie van de zuiger, gebruik dan een lichte delicate ruitenwisser om de oplossing zorgvuldig te absorberen zonder de punt van de naald aan te raken.</li>
		<li>Steek de buret met titratiespuit in de monstercel en bevestig deze stevig.</li>
		<li>Stel de parameters op de ITC-software in. Begin met Instrument Control en stel de roersnelheid in (typische roersnelheden variëren van 150 tot 350 RPM) en de temperatuur waarbij het experiment zal worden uitgevoerd (meestal 25 ° C). Voer de spuit - en celconcentraties in millimolaire eenheden in onder Experimentdetails.</li>
		<li>Selecteer in de sectie Experimentmethode de optie Incrementele titratie. Klik op Setup en geef 20 injecties van 2,5 μL op. Als er meer resolutie nodig is om de bindingsgebeurtenis te observeren, verhoogt u het aantal injecties en verlaagt u het volume per injectie. Voer de tijdsafstand tussen elke injectie in, zodat deze lang genoeg is om het signaal in evenwicht te brengen en terug te keren naar de basislijn, meestal 300 s.</li>
		<li>Klik op de knop Uitvoeren om het experiment te starten en op te geven waar de gegevens worden opgeslagen.</li>
		<li>Na voltooiing van het experiment reinigt u de monstercel en de titratiespuit.</li>
		<li>Voer alle experimenten ten minste in drievoud uit om nauwkeurige gegevensverzameling te garanderen.</li>
		<li>Voer een controle-experiment uit waarbij de metaaloplossing wordt getitreerd in de gebufferde oplossing (in afwezigheid van peptide) om ervoor te zorgen dat de verdunningswarmte van het metaalion klein is en dat er geen onverklaarde evenwichten zijn. Als de verdunningswarmte groot is, overweeg dan indien mogelijk een ander buffersysteem.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwerking van de gegevens<ol>
<li>Start de ITC-analysesoftware en laad het gegevensbestand voor analyse.</li>
		<li>Navigeer naar het tabblad Basislijn en inspecteer het thermogram. Let op alle exogene warmte die is geëvolueerd of geabsorbeerd uit luchtbellen of andere artefacten in het thermogram. Zoek naar spikes die niet te wijten zijn aan injectie van de metalen oplossing.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de basislijn die door de analysesoftware wordt gegenereerd, het gedeelte van de gegevens na injectie en equilibratie volgt. Als deze afwijkt, gebruikt u basislijndraaipunten om de basislijn aan te passen. Zorg ervoor dat de integratieregio's de piek bevatten die wordt gegenereerd door injectie van het metaal, maar sluit alle luchtbellen of artefacten in het thermogram uit die in stap 2 zijn gevonden. Trek de basislijn af van het thermogram. OPMERKING: Dit type manipulatie wordt alleen aanbevolen nadat meerdere thermogrammen zijn verzameld, zodat de experimentator weet wat echte gegevens zijn en wat een artefact is, omdat het aanpassen van de basislijn en integratieregio's de gegevens drastisch kan beïnvloeden.</li>
		<li>Navigeer naar het venster Modellering om te beginnen met het aanpassen van de gegevens waarin de analysesoftware de geïntegreerde en concentratiegenormaliseerde gegevens voor elke injectie weergeeft.</li>
		<li>Klik met de linkermuisknop op de datum van de eerste injectie om deze uit het aanpassingsalgoritme te verwijderen. OPMERKING: Dit komt vaak voor omdat er een kleine menging zal zijn tussen de titrant en de monsterceloplossing, wat leidt tot onnauwkeurige molaire afgifte van de eerste injectie.</li>
		<li>Selecteer in de sectie Modellen de optie Leeg (constant) in het vervolgkeuzemenu Stijl, dat is gebaseerd op de uiteindelijke injectie-enthalpie en wordt afgetrokken van elk gegevenspunt, rekening houdend met de verdunningswarmte. Selecteer bovendien Onafhankelijk (of het beste model voor het systeem) in het tweede vervolgkeuzemenu Stijl om de gegevens te passen. OPMERKING: Voor standaard 1:1 bindingsinteracties is het meest voorkomende model Onafhankelijk.</li>
		<li>Pas de gegevens aan met behulp van de twee modellen door op de groene afspeelknop te drukken met een Σ. OPMERKING: Een andere software om ITC-gegevens te verwerken is SEDPHAT24.</li>
		<li>Houd rekening met alle concurrerende evenwichten in post-hocanalyse die eerder door Grossoehme et al. is gerapporteerd. 20.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li>
<li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li>
<li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+structure%2C+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li>
<li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+transport+in+mammalian+cells%3A+Special+care+for+a+metal+with+special+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li>
<li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+binding+of+Cu%28II%29+ions+to+a+fragment+of+the+A%CE%B2+%281-42%29+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy%2C+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li>
<li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li>
<li>García, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper%28II%29+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106%E2%88%92115%3A+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li>
<li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper%28II%29+by+CD+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li>
<li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li>
<li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li>
<li>Żamojć, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper%28II%29+ions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li>
<li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-%CE%B2+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li>
<li>Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper%28II%29+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li>
<li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li>
<li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li>
<li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites%3A+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li>
<li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Un%29suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological%2C+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li>
<li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteins+containing+cytochrome%2C+iron-sulfur%2C+or+copper+redox+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366(2014).</li>
<li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li>
<li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiessler%2C+GL+%22Inorganic+Chemistry%22">Inorganic Chemistry</a>. , Pearson. (2014).</li>
<li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+direct+red+81+dye%2Fcopper%28II%29-phenanthroline+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li>
<li>Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li>
<li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li>
<li>NIST. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Critically+Selected+Stability+Constants+of+Metal+Complexes%2C+Version+8.0%22">Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0</a>. , (2004).</li>
<li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman%27s+reagent+and+with+4%2C4%E2%80%B2-dithiodipyridine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dit artikel biedt een robuuste methode voor het kwantificeren van de affiniteit en thermodynamica van Cu(II) binding aan peptiden. Complexen met Cu(II) zijn door de d9 elektronenconfiguratie bij uitstek geschikt om de d-d absorptieband op de metaallocatie te bewaken. Hoewel de extinctiecoëfficiënt klein is, waardoor grotere concentraties van het complex nodig zijn om een betrouwbaar signaal te leveren, kunnen titraties van Cu(II) in peptide snel inzicht geven in de bindingsstoomometrie en de geschatte bindings...

De biologie is geëvolueerd om gebruik te maken van de diverse chemie van metaalionen die nodig zijn voor het leven om zich aan te passen en te overleven in de omgeving. Naar schatting 25%-50% van de eiwitten gebruikt metaalionen voor structuur en functie1. De specifieke rol en redoxtoestand van het metaalion is direct gerelateerd aan de samenstelling en geometrie van de biologische liganden die het coördineren. Bovendien moeten redox-actieve metaalionen zoals Cu (II) strak worden gereguleerd, zodat ze niet interageren met oxidatiemiddelen via Fenton-achtige chemie om reactieve zuurstofsoorten (ROS) te vormen 2,3,4. Het begrijpen van de bindingsmodi en affiniteit die de biochemie aansturen, zou moeten helpen de biologische rol van het metaalion op te helderen.
Veel technieken worden gebruikt om de bindingsinteracties van metalen en peptiden te bestuderen. Dit zijn meestal spectroscopische technieken, maar omvatten ook computersimulaties met behulp van moleculaire dynamica, zoals gezien door Cu(II) interacties met een fragment van amyloïde bèta (Aβ)5. Een veelgebruikte spectroscopische techniek die voor veel universiteiten toegankelijk is, is kernspinresonantie (NMR). Door gebruik te maken van de paramagnetische aard van Cu(II) konden Gaggelli et al. aantonen waar het metaalion zich bindt aan een petide door ontspanning van nabijgelegen kernen6. Elektron paramagnetische resonantie (EPR) kan ook worden gebruikt om de locatie en modus van de paramagnetische metaalionbindingte onderzoeken 7. Andere spectroscopische technieken zoals circulair dichroïsme (CD) kunnen de coördinatie over Cu(II) in systemen zoals tripeptidesystemen8 beschrijven, en massaspectrometrie kan stoichiometrie aantonen en op welke residuen het metaalion wordt gecoördineerd door fragmentatiepatronen 9,10.
Sommige van deze technieken, zoals NMR, zijn labelvrij, maar vereisen grote concentraties peptide, wat uitdagingen vormt voor studie. Een andere veel voorkomende techniek genaamd fluorescentiespectroscopie is gebruikt om de positie van een tyrosine of tryptofaan te relateren aan het blussen van een Cu (II) 11,12. Evenzo kan deze techniek structurele veranderingen vertonen als gevolg van Cu(II)-binding13. Uitdagingen met deze metaal-peptidebindingsstudies zijn echter dat ze chromofoor aminozuren zoals tyrosine onderzoeken die niet alle systemen hebben, dat het metaalion bindt onder een klassiek model en dat de techniek mogelijk niet bevorderlijk is onder fysiologische omstandigheden. Er zijn inderdaad verschillende peptiden in opkomst die dergelijke chromofoor aminozuren niet bevatten of binden onder klassieke modellen, waardoor het gebruik van deze technieken wordt uitgesloten14,15. Dit artikel beschrijft benaderingen voor het beoordelen van bindende eigenschappen in deze scenario's onder fysiologisch relevante omstandigheden.
Biologische liganden kunnen verschillende protonatietoestanden aannemen die de metaalionbinding kunnen beïnvloeden, zoals de imidazoolring op histidine. Als de pH niet consistent wordt gehandhaafd, kunnen de resultaten ingewikkeld of tegenstrijdig zijn. Om deze reden zijn buffers een essentieel onderdeel in de studie van metaal-eiwit/peptide interacties. Van veel buffers is echter aangetoond dat ze gunstig interageren met metaalionen16,17. Naast het concurreren met het biologische molecuul van belang, kan de buffer vergelijkbare coördinerende atomen hebben die moeilijk te onderscheiden zijn van de coördinerende atomen van het peptide of eiwit. In deze studie ligt de focus op elektronische absorptiespectroscopie en isothermische titratiecalorimetrie (ITC) als twee complementaire technieken voor het bestuderen van Cu(II)-peptide-interacties, met speciale overwegingen met betrekking tot bufferkeuze.
Elektronische absorptiespectroscopie is een snelle, breed toegankelijke techniek voor het bestuderen van metaalbindingsinteracties. Bestraling met licht in de ultraviolette (UV) of zichtbare golflengten kan leiden tot absorptie van metaalgecentreerde d-d-banden, die waardevolle informatie opleveren over ligandclassificatie, metaalgeometrieën en schijnbare bindingsaffiniteiten18,19. Voor deze complexen kunnen directe titraties van metaalionen in eiwit- of peptideoplossingen bindende stoichiometrieën en schijnbare bindingsaffiniteiten kwantificeren. In sommige gevallen, zoals d5 of d10 elektronenconfiguraties, absorbeert het complex geen licht (d.w.z. is spectroscopisch stil). In deze spectroscopisch stille overgangsmetaalcomplexen kunnen deze beperkingen worden omzeild door een concurrerend ligand te gebruiken dat, bij coördinatie met het metaalion, detecteerbare ladingsoverdrachtsbanden oplevert. In beide gevallen is deze benadering beperkt tot het kwantificeren van alleen stoichiometrie en schijnbare bindingsaffiniteit, en wordt er geen inzicht in bindingsenthalpie gegeven zonder benaderingen.
Als aanvulling op informatie verkregen uit elektronische absorptiespectroscopie, is ITC een aantrekkelijke techniek voor directe en rigoureuze kwantificering van de bindende enthalpie20. ITC meet direct de warmte die vrijkomt of wordt verbruikt tijdens een bindingsgebeurtenis en aangezien de titratie plaatsvindt bij constante druk, is de gemeten warmte de enthalpie van alle evenwichten (ΔHITC). Daarnaast worden de stoichiometrie van de bindingsgebeurtenis (n) en de schijnbare bindingsaffiniteit (KITC) gekwantificeerd. Uit deze parameters worden de vrije energie (ΔGITC) en entropie (ΔSITC) bepaald, waardoor een thermodynamische momentopname van de bindingsgebeurtenis ontstaat. Omdat het niet afhankelijk is van lichtabsorptie, is ITC een ideale techniek voor spectroscopisch stille soorten, bijvoorbeeld d5 of d10 metaalionencomplexen. Aangezien calorimetrie echter warmte meet, kunnen niet-overeenkomende buffersystemen en niet-geregistreerde evenwichten de analyse nadelig beïnvloeden om de metaalionenbindende thermodynamica nauwkeurig te bepalen, en er moet grote zorg worden besteed aan het aanpakken van deze factoren20. Indien uitgevoerd met de juiste striktheid, is ITC een robuuste techniek voor het bepalen van de thermodynamica van metaal-eiwit / peptidecomplexen.
Hier wordt een chromoforisch stil koperbindend peptide, C-peptide, gebruikt om het complementaire gebruik van de twee technieken te demonstreren. C-peptide is een 31 residu splitsingsproduct (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) gevormd tijdens insulinerijping; het mist chromofore residuen, maar het is aangetoond dat het Cu(II) bindt met fysiologisch relevante affiniteit 14,15. De Cu(II)-bindingsplaats bestaat uit de zijketens van een glutamaat en een aspartaat en de N-terminus van het peptide14,15. Deze coördinerende atomen lijken sterk op die van veel gebruikte gebufferde systemen. Hier wordt het tandemgebruik van de d-d- en ladingsoverdrachtsbanden in elektronische absorptiespectroscopie en ITC getoond bij het kwantificeren van de Cu (II) bindende thermodynamica aan C-peptide. De benadering van het bestuderen van Cu (II) binding aan C-peptide kan worden toegepast op andere metaalionen en eiwit / peptide systemen.

<table><tbody><tr><td>1,10-fenantroline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>131377-25G</td><td></td></tr><tr><td>bis-Tris buffer</td><td>Fisher</td><td>BP301-100</td><td></td></tr><tr><td>Fles-top 0.45 micron membraan</td><td>Nalgene</td><td>296-4545</td><td>Elk filtratiesysteem dat de hars verwijdert zonder verontreinigingen te introduceren, is acceptabel</td></tr><tr><td>Koper(II)chloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>12458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Elektronische absorptiespectrofotometer</td><td>Varian</td><td>Cary 5000</td><td>Een andere geschikte gevoelige spectrofotometer is acceptabel</td></tr><tr><td>Hoge affiniteitshars</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7901-25G</td><td></td></tr><tr><td>Isotherme titratiecalorimeter (ITC)</td><td>TA Instruments</td><td>Nano ITC Low Volume</td><td></td></tr><tr><td>ITC-analysesoftware</td><td>TA Instruments</td><td>NanoAnalyze</td><td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&ndash;148) kan ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>ITC-software</td><td>TA Instruments</td><td>ITCRun</td><td></td></tr><tr><td>Lichte delicaatdoek</td><td>Kimwipe</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Injectiespuit</td><td>Hamilton</td><td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td><td></td></tr><tr><td>Gematchte cuvettes</td><td>Starna Cells, Inc</td><td>16.100-Q-10/Z20</td><td>Zorg ervoor dat het venster voor de cuvette met klein volume overeenkomt met de straalhoogte van de spectrofotometer</td></tr><tr><td>MOPS-buffer</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12914</td><td></td></tr><tr><td>spectrofotometersoftware</td><td>Cary</td><td>WinUV Scan</td><td></td></tr><tr><td>spreadsheetprogramma</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td>Elk geschikt spreadsheetprogramma werkt</td></tr><tr><td>Titratiespuit</td><td>TA Instruments</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuur water</td><td>Millipore Sigma</td><td>Milli-Q</td><td>Elk water is oké zolang >18 M&Omega; weerstand</td></tr></tbody></table>

kwantificeren van de bindingsinteracties tussen cu (ii) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Koper (II) is een essentieel metaal in biologische systemen en verleent unieke chemische eigenschappen aan de biomoleculen waarmee het interageert. Er is gemeld dat het zich direct bindt aan een verscheidenheid aan peptiden en zowel noodzakelijke als pathologische rollen speelt, variërend van de bemiddelende structuur tot elektronenoverdrachtseigenschappen tot het geven van katalytische functie. Het kwantificeren van de bindingsaffiniteit en thermodynamica van deze Cu(II)-peptidecomplexen in vitro geeft inzicht in de thermodynamische drijvende kracht van binding, potentiële competities tussen verschillende metaalionen voor het peptide of tussen verschillende peptiden voor Cu(II), en de prevalentie van het Cu(II)-peptidecomplex in vivo. Het kwantificeren van de bindende thermodynamica kan echter een uitdaging zijn vanwege een groot aantal factoren, waaronder het verantwoorden van alle concurrerende evenwichten binnen een titratie-experiment, vooral in gevallen waarin er een gebrek is aan discrete spectroscopische handgrepen die het peptide, het d-blokmetaalion en hun interacties vertegenwoordigen.
Hier wordt een robuuste reeks experimenten geleverd voor de nauwkeurige kwantificering van Cu (II) -peptide thermodynamica. Dit artikel richt zich op het gebruik van elektronische absorptiespectroscopie in de aan- en afwezigheid van chromofoor liganden om de benodigde spectroscopische handgreep op Cu(II) te bieden en het gebruik van labelvrije isothermische titratiecalorimetrie. In beide experimentele technieken wordt een proces beschreven om rekening te houden met alle concurrerende evenwichten. Hoewel de focus van dit artikel ligt op Cu (II), kan de beschreven reeks experimenten van toepassing zijn buiten Cu (II) -peptide-interacties en een kader bieden voor nauwkeurige kwantificering van andere metaalpeptidesystemen onder fysiologisch relevante omstandigheden.

Het doel was om de thermodynamica van Cu(II) binding aan C-peptide te kwantificeren en te bevestigen met behulp van de complementaire technieken van elektronische absorptiespectroscopie en ITC. Vanwege de robuuste aard van elektronische absorptiespectroscopie werd een directe titratie van Cu(II) in 300 μM C-peptide uitgevoerd (figuur 1). Toevoeging van 150 μM Cu(II) veroorzaakte een onmiddellijke toename van de band bij 600 nm, toegeschreven aan de d-d-band van Cu(II), en bleef toenemen totd...

Dit artikel richt zich op het gebruik van elektronische absorptiespectroscopie en isothermische titratiecalorimetrie om de thermodynamica van Cu (II) binding aan peptiden en eiwitten te onderzoeken en te kwantificeren.

Kwantificeren van de bindingsinteracties tussen Cu (II) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Deze methode stelt de onderzoeker in staat om moeilijk te bestuderen systemen te onderzoeken, zoals peptiden en eerste rij overgangsmetaalionen, die beide over het algemeen een uitdaging vormen met behulp van meer standaardtoepassingen. Het grote voordeel hierbij is het gebruik van orthogonale technieken omdat ze elkaar goed aanvullen, en dat kan meer inzicht geven in het systeem en ons helpen om geen enkel fenomeen te missen. De methode die in deze video wordt beschreven, is zeer geschikt voor het bestuderen van andere systemen.Hoewel we het laten zien met Cu (II) en een peptide, kan het worden gebruikt voor veel verschillende metaalpeptide- en metaaleiwitinteracties. Ik denk dat het moeilijkste deel zal zijn om een goede bufferkeuze te vinden voor je metaalion en peptide. Ik zou literatuur raadplegen om te zien welke buffers eerder door anderen zijn gebruikt.het aantonen van de procedure zal Sohee Choi zijn, een afgestudeerde student in mijn onderzoekslaboratorium. Schakel om te beginnen de elektronische absorptiespectrofotometer in en laat deze ongeveer 15 tot 20 minuten opwarmen voor gebruik. Start vervolgens de spectrofotometersoftware en configureer de parameters, zoals het scanbereik van 200 tot 900 nanometer, het scanbereik van 200 nanometer per seconde en de gecorrigeerde basislijn voor dubbele bundels.Verzamel vervolgens een basislijn zonder cuvetten of monsters in de balkpaden. Gebruik twee bijpassende cuvetten in de dubbelstraalspectrofotometer en laad één cuvette met 115 microliter ultrapuur water en de andere cuvette met 115 microliter van het peptidemonster terwijl u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen in de cuvetten zitten, omdat deze het signaal zullen verstoren. Plaats daarna de cuvette met ultrapuur water in de referentiestraal en de cuvette met peptide in de monsterbundel.Verzamel vervolgens het absorptiespectrum van het metaalvrije peptide. Voeg een substoichiometrische hoeveelheid van de Cu(II)-oplossing toe aan het cuvet met het peptidemonster en noteer het volume voor analyse later. Pipeer dat voorzichtig op en neer om de oplossing te mengen en vermijd het genereren van luchtbellen.Na vijf minuten balanceren plaatst u de cuvette terug in de monstercelhouder en registreert u het absorptiespectrum. Herhaal vervolgens de toevoeging van Cu(II)aliquots aan de peptideoplossing voor verschillende equivalenten en noteer het totale volume Cu(II)toegevoegd aan de cuvette. Na het initialiseren van de software zoals eerder beschreven in twee gematchte cuvetten laadt u één cuvette met 115 microliter ultrazuiver water en andere cuvette met 115 microliter van de koper-fen complexe oplossing.Plaats de cuvette met water in de referentiebalk en de cuvette met koper-fen complexe oplossing in de monsterbundel. Verzamel vervolgens het absorptiespectrum van het metaalligandcomplex. Voeg daarna een stoichiometrische hoeveelheid peptide toe aan de koper-fen complexe oplossing en pijp dat voorzichtig op en neer om grondig te mengen, terwijl je voorzichtig bent om geen luchtbellen te introduceren.Incubeer vervolgens de oplossing gedurende vijf minuten om een evenwicht te bereiken. Plaats de cuvette terug in de monstercelhouder en noteer het absorptiespectrum. Herhaal later de toevoeging van peptide-aliquots aan de koper-fen-complexoplossing voor verschillende equivalenten en noteer het volume toegevoegd peptide zodat de verdunde concentratie kan worden bepaald.Schakel eerst de ITC in en start de ITC-software om het instrument uit te voeren. Na de eerste initialisatie, herplaats de buret en volg de instructies op het scherm. Verwijder vervolgens de buret en het deksel uit de referentiecel.Verwijder vervolgens al het water uit de referentiecel en spoel drie keer met 450 microliter ontgast ultrazuiver water. Zuig langzaam ultrazuiver water op tot de 450 microliter markering van een laadspuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit komen. Steek vervolgens de laadspuit in de referentiecel totdat deze zich ongeveer een millimeter van de bodem bevindt en injecteer langzaam een deel van de oplossing totdat er 150 microliter in de laadspuit achterblijft.Beweeg daarna de zuiger van de laadspuit snel op en neer met ongeveer 25 microliter meerdere keren om eventuele bellen op het celoppervlak los te maken. Injecteer vervolgens langzaam totdat de zuiger de markering van 100 microliter op de laadspuit bereikt, waardoor in totaal 350 microliter ultrazuiver water in de referentiecel wordt gedoseerd en de referentiecelafdekking wordt vervangen. Nadat u een restoplossing uit de monstercel hebt verwijderd, laadt u 450 microliter 10 millimol EDTA met behulp van een laadspuit en weekt u gedurende 10 minuten om ervoor te zorgen dat sporenmetaalionen worden verwijderd omdat de EDTA sporenmetalen bindt.Spoel na het verwijderen van de EDTA-oplossing de laadspuit grondig af met overvloedige hoeveelheden ultrazuiver water. Reinig de ITC in overeenstemming met de aanwijzingen van de fabrikant door de monstercel te spoelen met ultrazuiver water. Verwijder eventueel restwater uit de monstercel en conditioneer de monstercel door ten minste driemaal met 450 microliter buffer te spoelen.Verwijder vervolgens de resterende buffer die de monstercel conditionert en laad de peptideoplossing in de monstercel met behulp van de oplaadspuit. Spoel vervolgens de titratiespuit met 200 microliter van de gebufferde oplossing door eerst de zuiger te verwijderen. Pipetteer met behulp van een micropipet de bufferoplossing door het gat aan de bovenkant van de glazen titratiespuit door de spuit en uit de naald eronder.Steek de zuiger later volledig in de titratiespuit. Dompel vervolgens de punt van de naald van de titratiespuit in de metalen oplossing en trek de zuiger langzaam omhoog, waardoor de metalen oplossing de spuit vult en resulteert in een leeg volume aan de bovenkant van het glazen deel van de titratiespuit. Om het leegtevolume te verwijderen, draait u de titratiespuit parallel aan de vloer.Verwijder vervolgens de zuiger en kantel het glazen deel iets naar de vloer. Schud de titratiespuit voorzichtig zodat de oplossing naar het glazen deel van de titratiespuit gaat en het grootste deel van het lege volume opvult. Maar zorg ervoor dat er twee tot drie microliter leeg volume overblijft.Terwijl u de spuit parallel aan de vloer houdt, plaatst u de zuiger opnieuw. Houd vervolgens de titratiespuit rechtop en dompel de punt van de naald terug in de metalen oplossing. Duw vervolgens de zuiger naar beneden totdat er geen lucht meer uit de naald komt en laad de titratiespuit door de zuiger langzaam omhoog te trekken tot net boven de 50 microlitermarkering terwijl de punt van de naald in de oplossing blijft.Steek voorzichtig het glazen deel van de titratiespuit in de buret en schroef tot de vinger strak zit. Absorbeer daarna met behulp van een lichte delicate ruitenwisser de oplossing die uit de titratiespuit komt als gevolg van compressie van de zuiger zonder de punt van de naald aan te raken. Steek vervolgens de buret met een titratiespuit in de monstercel en bevestig deze stevig.Als u de parameters van de ITC-software wilt instellen, selecteert u Instrument Control. Stel de roersnelheid en de temperatuur in. Voer vervolgens onder Experimentdetails de spuit- en celconcentraties in millimolaire eenheden in.Selecteer vervolgens in de sectie Experimentmethode de optie Incrementele titratie. Klik op Instellen en geef 20 injecties van 2,5 microliter op en als er meer resolutie nodig is om de bindingsgebeurtenis waar te nemen, verhoog dan het aantal injecties en verlaag het volume per injectie. Voer daarna de tijdsafstand tussen elke injectie in, zodat deze lang genoeg is om het signaal in evenwicht te brengen en terug te keren naar de basislijn, meestal 300 seconden.Klik vervolgens op de knop Uitvoeren om het experiment te starten en op te geven waar de gegevens worden opgeslagen. Titratie van Cu(II)werd uitgevoerd in C-Peptide waaruit bleek dat de toevoeging van 150 micromolaire Cu(II)een onmiddellijke toename veroorzaakte bij de band op 600 nanometer toegeschreven aan de d-d band van Cu(II) en bleef toenemen totdat 300 millimol Cu(II)werd toegevoegd. Verdere toevoeging boven 300 micromolaire Cu(II) verhoogde de absorptie van het d-d-verbod niet, wat wijst op verzadiging en dat Cu(II)bindt aan C-Peptide in een 1:1-complex met een log K-waarde van meer dan zes.C-Peptide werd getitreerd in ongeveer 10 micromolaire koper-fen complex en de absorptie van de ladingsoverdrachtsband op 265 nanometer nam af, wat aangeeft dat het C-Peptide cu (II) uit het fenanthroline ligand kon cheleren met een log K-waarde van 7,4 tot 7,8. Het ITC thermogram toont de titratie van 1,4 millimol Cu(II)in 154 micromolair C-Peptide in 15 millimol MOPS buffer. De bindingsaffiniteit bleek een log K-waarde van acht te hebben met verandering in enthalpie als 8 kilojoule per mol.Gibbs vrije energie als min 46 kilojoule per mol, en verandering in entropie als 120 joule per mol per kelvin. Een gecontroleerde titratie van 1,4 millimol Cu(II)in 15 millimol MOPS-buffer bij afwezigheid van C-Peptide vertoont geen binding in het thermogram. Ik zou zeggen zorg ervoor dat alles schoon is.Als er metaalionen of peptiden overblijven van eerdere experimenten, kan dit de stoichiometrie drastisch beïnvloeden en onbekende concurrentie bieden in de bindingsexperimenten. Circulair dichroïsme is een andere methode om metaalpeptide- of metaaleiwitinteracties te bestuderen omdat het kijkt naar chiraliteit. Massaspectrometrie kan deze complexen ook ondervragen door te kijken naar veranderingen in massa.Deze reeks technieken is gebruikt door veel laboratoria die metaalionen bestuderen die interageren met peptiden of eiwitten.

quantifying-binding-interactions-between-cu-ii-peptide-residues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De NMR-oplossingsstructuur van een metallochaperone modelpeptide met Cu (I) werd bepaald, en een gedetailleerd protocol van monstersvoorbereiding en 1D en 2D dataverzameling tot een driedimensionale structuur wordt beschreven.

Structuur- en coördinatiebepaling van peptide-metaalcomplexen met behulp van 1D en 2D 1H NMR

Peptide array screening is een hoogdoorlaattest voor het identificeren van interactieplaatsen tussen eiwitten. Dit maakt het mogelijk om meerdere interacties van een doeleiwit in kaart te brengen en kan dienen als een methode voor het identificeren van plaatsen voor remmers die een eiwit aanspreken. Hier beschrijven we een protocol voor het screenen en analyseren van peptide arrays.

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Dit manuscript beschrijft hoe (enkele molecuul) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde assays uit te voeren om de bindingsdynamiek tussen T-cel antigeen receptor (TCR) en antigeen peptide-geladen MHC-moleculen te meten zoals ze optreden binnen de immunologische synaps van een T-cel in contact met een gefunctionaliseerde planaire ondersteunde lipide bilayer.

Het meten van TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Met een FRET-gebaseerde Microscopie Assay

Dit protocol geeft de belangrijkste stappen voor de bioconjugatie van een cysteïne bevattend eiwit een maleïmide, zoals zuivering reagens, reactieomstandigheden, bioconjugaat zuivering en karakterisering bioconjugaat.

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

We beschrijven hier een methode voor de identificatie van klein molecuul-bindende eiwitten met behulp van fotoaffiniteitslabeling. Het voordeel van deze techniek is dat binding en covalente labeling van de doeleiwitten plaatsvindt binnen de levende cellulaire omgeving, waardoor het risico van verstoring van de native eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt geëlimineerd.

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

De interactie tussen HCN kanalen en hun ondersteunende subunit is geïdentificeerd als een therapeutisch doel in depressieve stoornis. Hier wordt een fluorescentie-polarisatie- methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van dit eiwit-eiwit interactie, gepresenteerd.

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Ophoping van koper-ionen in een oplossing in een model experiment en een analyse op basis van kwantitatieve metingen plating kopersulfaat worden hier beschreven. Dit experiment reproduceert het accumulatieproces van koper-ionen in de plating-bad.

Accumulatie en analyse van koper-ionen in een oplossing Plating kopersulfaat

Ion Mobility-massaspectrometrie en moleculaire modelleringstechnieken kunnen de selectieve metaal chelerende werking van ontworpen metaal bindende peptiden en de koper bindende peptide methanobactin karakteriseren. Ontwikkeling van nieuwe klassen van metaal chelerende peptiden zal helpen leiden tot therapieën voor ziekten in verband met metaalionen misbalans.

Ion Mobility-massaspectrometrie technieken voor het bepalen van de structuur en de mechanismen van metaalionen herkenning en redox activiteit van metaal bindende Oligopeptides

Dit artikel beschrijft een experimenteel protocol met behulp van elektrospray-ion mobiliteit-massaspectrometrie, semi-empirische kwantumberekeningen en energie-opgeloste drempelbotsing-geïnduceerde dissociatie om de relatieve thermochemie van de dissociatie van gerelateerde ternaire metaalcomplexen te meten.

Thermochemische studies van Ni (II) en Zn (II) Ternaire complexen met behulp van ionenmobiliteit-massaspectrometrie

Leer de thermodynamica van Cu(II)-binding aan peptiden kwantificeren met elektronische absorptiespectroscopie en isotherme titratiecalorimetrie. Deze orthogonale technieken bieden diepgaand inzicht in metal-peptide interacties.

Kwantificeren van de bindingsinteracties tussen Cu (II) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen

Meer video's verkennen