Volledige versus subregionale kwantificering van amyloïde-bètabelasting op hersensecties van muizen
19 mei 2022
Het huidige protocol beschrijft en vergelijkt de procedure om een volledige regio of subregio van belang analyse uit te voeren van sagittale muishersensecties om amyloïde-bètabelasting te kwantificeren in het APP / PS1 transgene muismodel van de ziekte van Alzheimer.
Dit protocol vergelijkt de belasting van amyloïde-bèta-plaque in volledige secties van belang en subregio's van belang in hersensecties van APP / PS1 transgene muizen. De methode en resultaten die in dit specifieke protocol worden gepresenteerd, stellen de lezers of onderzoekers in staat om te kiezen tussen de volledige interesseregio of subregio van belanganalyse om een bètabelasting in muizenhersensecties te bepalen. Download om te beginnen de beeldanalysesoftware.
Start na de installatie de software en klik op het bestand, open en kies de afbeelding die u wilt analyseren. Selecteer in de softwarewerkbalk het rechte gereedschap en teken een rechte lijn over de lengte van de schaalbalk. Klik op de analyse en klik vervolgens op de ingestelde schaaltabbladen.
Klik nogmaals op de analyse en meet vervolgens tabbladen om de lengte of afstand van de schaalbalk in pixels te noteren. Voer in het pop-upvenster de afstand in pixels in, de bekende afstand van de schaalbalk en voer de lengte-eenheid in als een micrometer. Schakel vervolgens het globale vakje in om de nieuwe schaalinstelling toe te passen op alle volgende afbeeldingen, als er meerdere afbeeldingen worden verwerkt.
Klik op OK om de instellingen toe te passen. Als u de gewenste meting wilt instellen op het gebied van de sectie, gaat u naar analyseren, stelt u vervolgens metingen in en selecteert u het gebied en geeft u labelvakken weer. Zorg ervoor dat de afbeelding die wordt geanalyseerd is geselecteerd op het tabblad Omleiden naar.
Voor het gemak van hippocampus- of cortexvisualisatie gaat u naar de afbeelding en past u de helderheid of het contrast aan. Sleep de maximale schuifbalk geleidelijk naar links om de helderheid van het weefsel te vergroten totdat de hersengebieden van belang of ROI identificeerbaar zijn. Gebruik de polygoon of het selectiegereedschap uit de vrije hand om het hippocampusgebied te schetsen.
Zodra het gebied is geschetst, klikt u op de resetoptie van de helderheids- of contrastinstellingen om terug te keren naar de oorspronkelijke helderheid. Om het totale weefseloppervlak van het geselecteerde gebied te meten, klikt u op de bewerking en wist u de buitenkant. Zodra het geselecteerde gebied de enige afbeelding op het scherm is, klikt u op analyseren en meet u vervolgens tabbladen om het totale weefselgebied te verkrijgen dat in een pop-upvenster is geanalyseerd.
Sla de gegevens vervolgens op in een Excel-bestand. Als u het positieve gebied met 6-E10 wilt meten, gaat u naar de tabbladen afbeelding, past u de kleurdrempel aan en kleurt u deze in volgorde. Een vooraf gemaakt filter onder de drempelmethode biedt gewenste resultaten die de sterkste signalen in rood markeren.
Nadat u de juiste drempel hebt geselecteerd, controleert u de donkere achtergrond om de amyloïde bètavlekken op een zwarte achtergrond te markeren. Klik op de selecteren, vervolgens origineel en opnieuw selecteren, waardoor de donkere signalen van amyloïde bètaafzettingen op een witte achtergrond worden gegeven. Wanneer het pop-upvenster wordt gegenereerd, klikt u op het tabblad Deeltjes analyseren en analyseren en drukt u op OK. Kopieer de samenvattingsuitvoer die door de software wordt gegenereerd door op de knoppen Bewerken en Kopiëren te klikken.
Plak vervolgens in het eerder gestarte Excel-bestand met de respectieve labels. Bereken het procentuele 6E-10 positieve gebied met behulp van de formule Na het downloaden van de beeldanalysesoftware voert u de stappen uit totdat de ROI van de hersenen identificeerbaar is, zoals eerder aangetoond. Selecteer vervolgens met behulp van het rechthoekige gereedschap de ROI in de cortex of de hippocampus.
Klik in de werkbalk op bewerken, selecteer vervolgens en geef het tabblad op dat de hoogte en breedte wijzigt in een vooraf gedefinieerde waarde. Pas de doos zo aan dat deze volledig bedekt is door het weefsel. Stel de helderheid of het contrast opnieuw in op de oorspronkelijke helderheid.
Dupliceer de geselecteerde ROI door met de rechtermuisknop op het vak te klikken en op het duplicaat te klikken. Er wordt een nieuw venster geopend met de geselecteerde regio. Wijzig de naam van de gedupliceerde afbeelding om het gebied weer te geven waarin deze zich bevindt.
Pas het gedupliceerde afbeeldingstype aan door de werkbalk te gebruiken en op de afbeelding te klikken en typ vervolgens 8-bits toetsen om de gedupliceerde RGB-afbeelding naar 8-bits te converteren, om de plaques zo goed mogelijk te analyseren. Keer de afbeelding om door op bewerken te klikken en vervolgens om te keren. Om het positieve gebied van 6E-10 te meten, gaat u naar de afbeelding en past u deze aan en zet u de drempel in.
Een vooraf gedefinieerd filter onder de drempelmethode levert de gewenste resultaten op, waarbij de sterkste signalen rood worden gemarkeerd. Nadat u de juiste drempel hebt geselecteerd, drukt u op toepassen. Om het positieve gebied van 6E-10 te analyseren, gebruikt u de werkbalk en klikt u op de tabbladen deeltjes analyseren en analyseren, zodat de samengevatte resultaten worden gecontroleerd.
Kopieer de overzichtsuitvoer met het percentagegebied door op de tabbladen bewerken en kopiëren te klikken. Plak vervolgens de samenvattingsuitvoer in het eerder gestarte Excel-bestand met de respectieve labels. Herhaal de procedure voor de verschillende regio's in het weefsel en zorg ervoor dat de plaatsing van elk vak om de ROI te schetsen consistent is tussen elke afbeelding.
In deze representatieve beoordeling worden volledige en sub-ROI-analysemethoden vergeleken om het 6E-10-positieve gebied in de cortex en de hersenweefsels van de hippocampus te kwantificeren. De volledige ROI-analyse omvat het schetsen van de volledige ROI. Sub-ROI-analyse daarentegen omvat het selecteren van een vooraf gedefinieerde regio binnen de ROI.
De stapsgewijze procedure voor volledige en sub ROI 6E-10 positieve gebiedskwantificering, met ROI-rotatie voor sub-ROI-kwantificering, wordt hier weergegeven. De correlatie tussen de volledige en sub ROI analyses wordt hier aangetoond. Een significante positieve correlatie werd waargenomen tussen het 6E-10 positieve gebied gerapporteerd door de twee lezers die de sub ROI-analyse voor de cortex en de hippocampus uitvoerden.
Verder deelde het gemiddelde sub ROI 6E-10 positieve gebied een sterke, significante positieve correlatie met het gebied dat werd verkregen met behulp van de volledige ROI. Voor het gemiddelde 6E-10 positieve gebied door het volledige in de sub ROI-analyses, werd geen significant verschil waargenomen in de cortex en de hippocampus. Een significante correlatie werd waargenomen tussen homogene en oplosbare amyloïde bèta 1-42 metingen, door Eliza, en volledige ROI-analyse van de studie Drempelselectie is de sleutel tot het verkrijgen van nauwkeurige gegevenskwantificering.
Tussenkomst van de gebruiker is vereist om ervoor te zorgen dat de positieve vlekken nauwkeurig worden geselecteerd met het geselecteerde filter. Afgezien van amyloïde beta kwantificering, kan deze methode worden gebruikt voor andere fluorescerende immunovlekken. Bijvoorbeeld Iba-1, van microgliale positieve gebiedskwantificering.
Overzicht
Dit protocol biedt een gedetailleerde vergelijking van volledige regio- en subregio-analyses van sagittale muisbreinsecties om de amyloid-beta-belasting in het APP/PS1 transgene muismodel van de ziekte van Alzheimer te kwantificeren. Het stelt onderzoekers in staat om effectief hun methodologie voor het beoordelen van beta-belasting te selecteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Alzheimer's Ziekte Onderzoek
- Beeldanalysetechnieken
Achtergrond
- Amyloid-beta plaque accumulatie is een kenmerk van de ziekte van Alzheimer.
- Het APP/PS1 muismodel wordt veel gebruikt om deze aandoening te bestuderen.
- Het begrijpen van de methodologie voor plaque kwantificering is cruciaal voor onderzoek.
- Dit protocol draagt bij aan het standaardiseren van benaderingen in Alzheimer-onderzoek.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van volledige regio versus subregio-analyse in amyloid-beta kwantificering te vergelijken.
- Om een stapsgewijze procedure te bieden die onderzoekers kunnen repliceren.
- Om de correlatie en verschillen tussen de twee analytische benaderingen te verduidelijken.
Gebruikte methoden
- Beeldanalysesoftware wordt gebruikt om amyloid-beta belastingen te kwantificeren.
- Analyse wordt uitgevoerd op breinsecties van de APP/PS1 transgene muizen.
- Procedures omvatten het instellen van metingen voor gebiedsanalyse en het toepassen van filters voor nauwkeurige drempelwaarden.
- Meerdere afbeeldingen kunnen worden verwerkt met toegepaste globale schaalinstellingen.
Belangrijkste resultaten
- Vergelijkende analyse toonde sterke positieve correlaties aan tussen volledige en subregio-analyses.
- Er werden geen significante verschillen in gekwantificeerde amyloid-beta-oppervlakte tussen de twee methoden waargenomen.
- Drempelselectie bleek cruciaal voor nauwkeurige kwantificeringsuitkomsten.
- Resultaten demonstreren toepasbaarheid bij het kwantificeren van andere fluorescente immunokleuringen buiten amyloid-beta.
Conclusies
- De studie stelt onderzoekers in staat om geschikte methodologieën voor amyloid-beta kwantificering te kiezen.
- Het benadrukt het belang van nauwkeurige drempelwaarden en meettechnieken.
- Inzichten die worden verkregen, kunnen de begrip van de pathologie van Alzheimer en gerelateerde neurale mechanismen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of amyloid-beta plaque load in transgenic mouse brain sections is critical for target validation and mechanistic de-risking in Alzheimer's disease research. This protocol enables standardized comparison of full-region versus sub-region quantification, supporting predictive confidence in preclinical model selection and assay development. Reliable measurement of amyloid-beta burden informs early discovery decisions and portfolio triage for neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of amyloid-beta pathology in disease-relevant mouse models.
- Supports functional target validation by quantifying plaque burden across brain regions.
- Facilitates mechanistic de-risking by correlating full and sub-regional quantification outputs.
- Improves predictive confidence for advancing Alzheimer's disease targets.
Screening & Assay Development
- Standardizes image analysis workflows for reproducible quantification of immunostained brain sections.
- Provides quantitative outputs suitable for assay benchmarking and cross-study comparisons.
- Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening.
- Supports scalability and platform reuse for other fluorescent immuno-stains.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantification methods with translational biomarker strategies in Alzheimer's models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by correlating ELISA and image-based readouts.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by providing reliable plaque load metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This quantification protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neurodegenerative disease research, supporting both early hypothesis testing and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise amyloid-beta measurement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs and correlation analyses to compare full and sub-regional measurements.
- Translational Research: Connects image-based quantification with biochemical assays for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to other immuno-stains and neurodegenerative targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in Alzheimer's disease models.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of plaque quantification workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing reliable target engagement metrics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegenerative disease assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and immunostaining interpretation.
- Depends on access to validated image analysis software and quantitative data infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of region-of-interest selection and thresholding parameters.
- Adaptable to various brain regions and fluorescent markers with consistent methodology.
- Accuracy is contingent on user intervention for threshold selection and region delineation.
