Name: Myosine Ensemble Mechanics onderzoeken in Actin Filament Bundles met behulp van optische pincetten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Leer myosine-ensemblemechanica meten in actinebundels via optische pincetten. Deze modulaire methode maakt precieze krachtmetingen mogelijk en ondersteunt onderzoek naar motorproteïnedynamica in hiërarchische cytoskeletstructuren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), het Mississippi Space Grant Consortium onder subsidienummer NNX15AH78H (JCW, DNR) en de American Heart Association onder subsidienummer 848586 (DNR).

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Een in vitro studie met behulp van een optisch pincet in combinatie met fluorescentie beeldvorming werd uitgevoerd om de dynamiek van myosine ensembles interactie met actine filamenten te onderzoeken. Actine-myosine-actinebundels werden geassembleerd met behulp van spiermyosine II, rhodamine-actine aan de onderkant van de bundel en op het coverslipoppervlak en 488-gelabelde, gebiotinyleerde actinefilamenten aan de bovenkant van de bundel. Actine-eiwit uit konijnenspier werd gepolymeriseerd en gestabiliseerd met ...

Motoreiwitten zijn essentieel voor het leven en zetten chemische energie om in mechanisch werk 1,2,3. Myosinemotoren interageren met actinefilamenten door stappen te zetten langs de filamenten die vergelijkbaar zijn met een spoor, en de dynamiek van actine-myosinenetwerken voert spiercontractie, celmotiliteit, de contractiele ring tijdens cytokinese en beweging van lading in de cel uit, naast andere essentiële taken 3,4,5,6,7,8 . Omdat myosines zoveel essentiële rollen hebben, kan falen in de functionaliteit van het myosine-actinenetwerk leiden tot ziekteontwikkeling, zoals mutaties in de myosine-zware keten die harthypercontractiliteit veroorzaken bij hypertrofische cardiomyopathie (HCM)9,10,11,12,13,14 . Bij spiercontractie werken individuele myosinemotoren met elkaar samen door als een ensemble te werken om de vereiste mechanische energie te leveren die het relatieve glijden van AFs 4,15,16,17,18 uitvoert. Myosinemotoren vormen dwarsbruggen tussen AFs en gebruiken conformatieveranderingen als gevolg van de mechanochemische cyclus om collectief naar het prikkeldraadeinde van de uitgelijnde filamenten te bewegen 17,18,19,20,21.
De ontwikkeling van kwantitatieve in vitro motiliteitstests op SM-niveau met behulp van technieken zoals optische vallen heeft het verzamelen van ongekende details over hoe individuele myosinemotoren functioneren vergemakkelijkt, inclusief het meten van SM-krachtgeneratie en stapgroottes 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. ontwikkelden de "three-bead" of "dumbbell" optische trapping assay om de krachtgeneratiemechanica van enkele myosine II-motorente onderzoeken 23,31. Omdat spiermyosine II in teams werkt om AFs te contracteren, maar niet-processief is op SM-niveau, moest de optische vangtestoriëntatie worden herschikt van de klassieke motorgebonden kraalbenadering32. Om de dumbbell-assay te vormen, werden twee optische vallen gebruikt om een AF over een myosinemotor te houden die gebonden was aan een aan coverslip bevestigde kraal, en de krachtafgifte door de enkele motor werd gemeten door bewegingen van de AF binnen de val23.
SM-krachten en het gebruik van een enkele motor / single filament assay oriëntatie geven echter geen volledig beeld over het genereren van kracht op systeemniveau, omdat veel motoreiwitten, waaronder myosine II, niet geïsoleerd werken en vaak niet functioneren als een som van hun delen 15,16,17,32,33,34,35,36 . Complexere structuren die meer dan één motor omvatten die interageert met meer dan één filament zijn nodig om de synergie van de netwerken van myosine- en actinefilamenten beter te begrijpen15,32. De dumbbell assay oriëntatie is gebruikt om kleine ensemblekrachtgeneratie te onderzoeken door meerdere myosines aan een kraal te bevestigen of een myosine-dik filament aan een oppervlak te bevestigen en de motoren in staat te stellen te interageren met de gesuspendeerde AF 4,23,34,37,38,39,40.
Andere kleine ensemble-assays omvatten een in vitro filamentglijdende assay waarbij myosinemotoren op een coverslipoppervlak worden gecoat en een kraal gebonden aan een AF wordt gebruikt om de kracht te onderzoeken die wordt gegenereerd door het team van motoren 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . In beide gevallen zijn de myosinen gebonden aan een stijf oppervlak - kraal of coverslip - en gebruiken ze één AF. In deze gevallen zijn de motoren niet in staat om vrij te bewegen of met elkaar te communiceren, noch weerspiegelt het rigide gebonden hebben van myosinen de conforme, hiërarchische omgeving waarin de motoren zouden samenwerken in het sarcomeer32. Eerdere studies hebben gesuggereerd dat myosine II zijn omgeving kan voelen en zich dienovereenkomstig kan aanpassen aan veranderende visco-elastische of motorische concentratieomstandigheden door kenmerken zoals krachtgeneratie en duty ratio 41,44,45 te veranderen. Er is dus behoefte aan het ontwikkelen van een optische vangtest die motorische communicatie en systeemcompliancy bevordert en vastlegt om een realistischer beeld te schetsen van de mechanistische onderbouwing van myosine II ensemblekrachtgeneratie.
Hier ontwikkelden we een methode om hiërarchische structuur in vitro te koppelen aan optische vangst door actomyosinebundels of sandwiches te vormen die bestaan uit meerdere myosinemotoren die interageren tussen twee actinefilamenten. Deze modulaire testgeometrie heeft de mogelijkheid om direct te onderzoeken hoe moleculaire en omgevingsfactoren de generatie van myosinekrachten beïnvloeden. Verder heeft het onderzoeken van krachtgeneratiemechanismen via deze actine-myosine-ensembles het potentieel om te helpen bij het modelleren en begrijpen hoe grootschalige cellulaire taken, zoals spiercontractie, zich voortplanten vanaf het moleculaire niveau 9,10,13.

<table><tbody><tr><td>Actine-eiwit (biotine): skeletspier</td><td>Cytoskelet</td><td>AB07-A</td><td>Gebiotiniseerd actine-eiwit</td></tr><tr><td>Actine-eiwit, konijnskeletspier</td><td>Cytoskelet</td><td>AKL99-A</td><td>Actine-eiwit</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ftaloidine</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Actinestabilisator en Alexa Fluor 488-kleurstof</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher scientific</td><td>BP413-25</td><td>Vereist voor actine-assemblage en myosine-mobiliteit</td></tr><tr><td>Beta-D-glucose</td><td>Fisher scientific</td><td>MP218069110</td><td>Onderdeel van zuurstofverwijderingssysteem dat wordt gebruikt om fotobleking tijdens fluorescentiebeeldvorming te verminderen</td></tr><tr><td>Blotting Grade Blocker (caseïne)</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>Wordt gebruikt om het oppervlak te blokkeren tegen niet-specifieke binding</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>C79500</td><td>Calciumchloride, biedt de noodzakelijke controle over de dynamica van het actine-myosinenetwerk</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Fisher scientific</td><td>ICN10040280</td><td>Onderdeel van zuurstofverwijderingssysteem dat wordt gebruikt om fotobleking tijdens fluorescentiebeeldvorming te verminderen</td></tr><tr><td>Dekvlakken</td><td>Fisher scientific</td><td>12544C</td><td>Worden gebruikt om flowcellen te maken</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher scientific</td><td>AC327190010</td><td>Wordt gebruikt voor buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher scientific</td><td>A4094</td><td>Reagens dat wordt gebruikt voor het schoonmaken van dekvlakken</td></tr><tr><td>Glucose-oxidase</td><td>Fisher scientific</td><td>34-538-610KU</td><td>Onderdeel van zuurstofverwijderingssysteem dat wordt gebruikt om fotobleking tijdens fluorescentiebeeldvorming te verminderen</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher scientific</td><td>P217-500</td><td>Wordt gebruikt voor buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher scientific</td><td>P250-1</td><td>Wordt gebruikt om dekvlakken te etch en buffer-pH aan te passen</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td>Wordt gebruikt voor buffervoorbereiding</td></tr><tr><td>Microscoopglazen</td><td>Fisher scientific</td><td>12-544-2</td><td>Worden gebruikt om flowcellen te maken</td></tr><tr><td>Myosine II-eiwit: konijnskeletspier</td><td>Cytoskelet</td><td>MY02</td><td>Volledige lengte myosine motor-eiwit geïsoleerd uit konijnskeletspier</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker/JPK</td><td>NT2</td><td>Optisch vanginstrument</td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Maakt hechting van actinefilamenten op het glazen oppervlak van het dekglas mogelijk</td></tr><tr><td>Rodamine Ftaloidine</td><td>Cytoskelet</td><td>PHDR1</td><td>Actinestabilisator en rodamine fluorescente kleurstof</td></tr><tr><td>Streptavidine kralen, 1 μm</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>Optisch vanghandvat</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher scientific</td><td>PR H5121</td><td>Wordt gebruikt voor buffervoorbereiding</td></tr></tbody></table>

myosine ensemble mechanics onderzoeken in actin filament bundles met behulp van optische pincetten

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Myosines zijn motoreiwitten die ATP hydrolyseren om langs actinefilament (AF) tracks te stappen en zijn essentieel in cellulaire processen zoals motiliteit en spiercontractie. Om hun krachtgenererende mechanismen te begrijpen, is myosine II zowel op het niveau van één molecuul (SM) als als teams van motoren in vitro onderzocht met behulp van biofysische methoden zoals optische vangmethoden.
Deze studies toonden aan dat myosinekrachtgenererend gedrag sterk kan verschillen bij het verplaatsen van het niveau van één molecuul in een opstelling met drie kralen naar groepen motoren die samenwerken op een stijve kraal of een bedekkend oppervlak in een glijdende opstelling. Deze testconstructies laten echter niet toe om de groepsdynamiek van myosine binnen de visco-elastische structurele hiërarchie te evalueren zoals ze dat binnen een cel zouden doen. We hebben een methode ontwikkeld met behulp van optische pincetten om de mechanica van krachtgeneratie door myosine-ensembles te onderzoeken die interageren met meerdere actinefilamenten.
Deze actomyosinebundels vergemakkelijken onderzoek in een hiërarchische en conforme omgeving die motorische communicatie en ensemblekrachtoutput vastlegt. De aanpasbare aard van de test maakt het mogelijk om experimentele omstandigheden te wijzigen om te begrijpen hoe wijzigingen in het myosine-ensemble, de actinefilamentbundel of de omgeving resulteren in verschillende krachtoutputs.

Stromingscellen die de actomyosinebundelsystemen bevatten, hebben een standaardontwerp, bestaande uit een microscoopglaasje en een geëtste coverslip gescheiden door een kanaal gemaakt van dubbelzijdig plakband (figuur 1). De test wordt vervolgens opgebouwd uit de coverslip-up met behulp van gefaseerde introducties zoals beschreven in het protocol. De laatste test bestaat uit sjabloon rhodamine-gelabelde actinefilamenten; de gewenste myosineconcentratie (1 μM werd gebruikt voor de representat...

Vorming van actomyosinebundels in vitro en het meten van myosine ensemblekrachtgeneratie met behulp van een optisch pincet wordt gepresenteerd en besproken.

Myosine Ensemble Mechanics onderzoeken in Actin Filament Bundles met behulp van optische pincetten

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

Het onderzoeken van actinegedrag met behulp van dit protocol is belangrijk omdat het de gebruiker in staat stelt om de dynamiek van het motoreiwitensemble te onderzoeken met behulp van de precisie van optische vallen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om myosinemechanica te meten binnen de actine structurele hiërarchie, in tegenstelling tot de traditionele single-motor single-filament oriëntatie die wordt gebruikt in veel optische vangexperimenten. Een ander voordeel van dit protocol is het modulaire karakter, waarmee de gebruiker de test kan aanpassen aan het hiërarchische cytoskeletsysteem van zijn keuze.Breng om te beginnen twee stukjes dubbelzijdig plakband aan op het midden van een microscoopglaasje dat drie tot vier millimeter van elkaar verwijderd is. Scheur of knip vervolgens de overtollige tape af die aan de rand van de dia hangt. Voeg vervolgens de PLL-gecoate afdekslip toe bovenop de tape loodrecht op de lange as van de microscoopglaasje om een kanaal te vormen.Gebruik een kleine buis om de afdekselglijder op de tape en microscoop te comprimeren, schuif grondig totdat de tape transparant is en zorg ervoor dat er geen bellen in de tape zitten, omdat dit lekkage uit het stroomkanaal kan veroorzaken. Voeg 15 microliter van de verdunde rhodamine-actine toe aan de PLL-stroomcel en laat de overtollige oplossing door de stroomcel stromen, maar laat het stroomkanaal niet droog worden. Incubeer vervolgens gedurende 10 minuten in een vochtigheidskamer.Bereid vervolgens een caseïneoplossing van één milligram per milliliter in actinepolymerisatiebuffer en voeg 15 microliter van de oplossing toe om niet-specifieke binding van de volgende componenten te voorkomen. Incubeer vervolgens gedurende vijf minuten in een vochtigheidskamer. Voeg daarna de gewenste concentratie myosine toe aan de bereide gebiotinyleerde actine en kralensuspensie en roer voorzichtig met een pipetpunt.Voeg vervolgens onmiddellijk 15 microliter van de suspensie samen met de gewenste myosineconcentratie toe aan de stroomcel en incubeer gedurende 20 minuten. Sluit vervolgens de open uiteinden van de stroomcel af met nagellak om verdamping tijdens beeldvormings- en optische vangexperimenten te voorkomen. Zodra het systeem klaar is, schakelt u de laser in met behulp van de aan / uit-laserknop in de linkerbenedenhoek van het scherm tot 50 milliwatt en laat u deze gedurende 30 minuten stabiliseren.Klik achtereenvolgens op de knoppen verlichting, camera, objectief en podiumbeweging in de software om die vensters te openen voor weergave en manipulatie tijdens het experiment. Schakel de microscoopverlichting in door op de aan/ uit-knop te klikken en deze in te stellen op maximaal vermogen door op de balk helemaal naar rechts te klikken en te slepen. Open het monstergebied en verwijder de monsterhouder uit het microscoopstadium.Voeg vervolgens de stroomcel toe en bevestig deze met de metalen monsterhouders, zodat de afdekslip zich aan de onderkant bevindt. Voeg daarna 30 microliter RO-water toe aan het midden van het onderste objectief en plaats het monsterstadium opnieuw. Verhoog vervolgens het onderste doel met behulp van de L2 op de afstandsbediening totdat de kraal water de afdekslip raakt.Verlaag vervolgens het bovenste doel totdat ongeveer de helft van de afstand tot de stroomcel is bereikt met behulp van de R2 op de afstandsbediening. Voeg vervolgens 170 microliter RO-water toe aan de bovenkant van de stroomcel direct onder het bovenste objectief en verlaag het bovenste objectief totdat het de oppervlaktespanning van het water breekt en een meniscus vormt. Verplaats vervolgens het microscoopstadium met behulp van het pijlpunt op de afstandsbediening totdat de rand van de tape naast het stroomkanaal is bereikt en sluit vervolgens de monsterdeur.Gebruik het doelvenster in het scherm om de rand van de tape te brengen en scherp te stellen door het onderste objectief met de naam Laser Objective omhoog te brengen door op de bovenste pijl te klikken en het bovenste objectief door op de onderste pijl te klikken met behulp van de bedieningselementen op het scherm. Zoek een zwevende kraal en vang deze door op de sluiterknop te klikken, waardoor de sluiter wordt geopend en de vanglaser het monster kan raken. Klik vervolgens op de trapcursor op het scherm en sleep deze om de locatie van de vanglaser te verplaatsen.Eenmaal gevangen, kalibreer de kraal door op de kalibratieknop te klikken. Klik vervolgens op Instellingen en typ de diameter van de kraal en de temperatuur van het podium linksonder in het softwarevenster. Klik vervolgens op Trap 1, vervolgens op X Signal en voer de hoekfrequentie uit door op Uitvoeren te klikken.Klik en sleep vervolgens in het venster om de functie te optimaliseren. Klik daarna op Gebruik het voor gevoeligheids- en stijfheidswaarden en accepteer vervolgens waarden. Sluit hierna het venster.Vind een actomyosinebundel door te zoeken naar kralen gebonden aan AFs op het oppervlak van de cover slip en door te zoeken naar beide fluorescerende AFs co-gelokaliseerd. Schakel de witte lichtbron in en gebruik de juiste filterkubus om elk actinefilament in beeld te brengen door aan het torentje te draaien. Eenmaal geverifieerd, vang de kraal die aan de bovenste gloeidraad van de bundel is bevestigd door op de sluiterknop te klikken.Leg vervolgens de gegevens vast door op de oscilloscoopknop te klikken met behulp van de bedieningselementen op het scherm. Om metingen te visualiseren zonder de gegevens te registreren, klikt u op Start en vervolgens op Automatisch opslaan om alle gegevens op te slaan. Om metingen op te nemen, klikt u op Record starten en kiest u welke gegevens in realtime moeten worden gevisualiseerd door te kiezen uit het vervolgkeuzemenu X Signal of Y Signal.Het krachtspoor van skeletmyosinemotoren die kracht genereren binnen de geconstrueerde in vitro actine structurele hiërarchie vertonen een gestage opmars in kracht totdat een plateau gedurende twee tot vijf minuten wordt bereikt. Er wordt echter ook opgemerkt dat sommige actomyosinebundels die geen nettokracht en de krachtsporen genereren, verschijnen als basisgeluid of geen substantiële netto toename van de kracht vertonen gedurende 90 seconden als gevolg van een lage concentratie motor of een ongunstige parallelle oriëntatie van de filamenten. Deze protocolontwikkeling zal de weg vrijmaken voor het bouwen van complexere in vitro cytoskeletale assays die verder zullen helpen bij het modelleren van grootschalige cellulaire taken, zoals celdeling en spiercontractie van onderop.

probing-myosin-ensemble-mechanics-actin-filament-bundles-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit is een stap-voor-stap handleiding toont het doel, de werking, en representatieve resultaten van de roman zwaartekracht spectrometer.

Demonstratie van het gebruik van de Novel zwaartekracht Spectrometer te rekken en te meten Stapel-eiwitten

Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Hier wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren, die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar de studie van andere klassen processieve motoren. Het protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen, van de opstelling van het experimentele apparaat tot monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse.

Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie

Dit protocol presenteert een complete experimentele workflow voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties met behulp van optische pincetten. Verschillende mogelijke experimentele opstellingen worden geschetst, waaronder de combinatie van een optisch pincet met confocale microscopie.

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.

Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

Dit artikel presenteert protocollen voor het engineeren en karakteriseren van afstembare driedimensionale composietnetwerken van co-verstrengelde actinefilamenten en microtubuli. Composieten ondergaan actieve herstructurering en ballistische beweging, aangedreven door myosine II- en kinesinemotoren, en worden afgestemd op de relatieve concentraties actine, microtubuli, motoreiwitten en passieve crosslinkers.

Reconstitueren en karakteriseren van Actin-Microtubule Composieten met instelbare motoraangedreven dynamica en mechanica

In dit werk wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de poro-elasticiteit van actomyosinegels onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen. De dynamiek van de actomyosinegel en het ingebedde oplosmiddel worden gekwantificeerd, waardoor de netwerkporo-elasticiteit wordt aangetoond. We bespreken ook de experimentele uitdagingen, veelvoorkomende valkuilen en relevantie voor celcytoskeletmechanica.

De mechanica van (poro-)elastische contractiele actomyosinenetwerken als modelsysteem van het celcytoskelet

Hier presenteren we methoden voor het bereiden van quasi-tweedimensionale (2D) verstrengelde, verknoopte en vloeibare kristalactine-assemblages van gezuiverde eiwitten.

Het afstemmen van de contractiliteit en vervormingsmodi van actieve op actine gebaseerde assemblages in vitro: van tweedimensionale actieve netwerken tot druppels van vloeibare kristallen

Leer myosine-ensemblemechanica meten in actinebundels via optische pincetten. Deze modulaire methode maakt precieze krachtmetingen mogelijk en ondersteunt onderzoek naar motorproteïnedynamica in hiërarchische cytoskeletstructuren.

Myosine Ensemble Mechanics onderzoeken in Actin Filament Bundles met behulp van optische pincetten

Meer video's verkennen