Name: Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Leer CARS en SRS microscopie vergelijken voor chemische beeldvorming in biologische monsters. Deze methoden gebruiken intrinsieke vibratiesignaturen zonder exogene labeling en helpen onderzoekers bij het kiezen van de optimale beeldvormingstechniek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door het start-upfonds van de Purdue University Department of Chemistry.

1. Instrumentele setup voor hyperspectrale CRS-beeldvorming
OPMERKING: Het genereren van CRS-signaal vereist het gebruik van krachtige (d.w.z. klasse 3B of klasse 4) lasers. Veiligheidsprotocollen moeten worden aangepakt en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) moeten te allen tijde worden gedragen bij het werken met dergelijke hoge piekvermogens. Raadpleeg de juiste documentatie voordat u gaat experimenteren. Dit protocol richt zich op het ontwerpen van het bundelpad, het tsjilpen van de femtosecondepulsen en het optimaliseren van de beeldvormingsomstandigheden. Een algemene optische lay-out van deze hyperspectrale CRS-microscoop is weergegeven in figuur 1. De hier getoonde configuratie is een van de vele bestaande configuraties voor CRS-microscopie. Het CRS-microscopiesysteem dat in dit protocol wordt gebruikt, is gebouwd op een femtoseconde laserbron met dubbele uitgang en een laserscanmicroscoop.
<ol><li>Zorg ervoor dat de laserbron twee femtoseconde pulstreinen (120 fs breedte) levert met een herhalingsfrequentie van 80 MHz, inclusief een vaste golflengte bij 1.045 nm die wordt gebruikt als de Stokes-bundel en een instelbare golflengte van 680 tot 1.300 nm die als pompstraal wordt gebruikt. Synchroniseer de uitgangspulsen met een optisch vertragingsverschil. Gebruik een microscoopframe om het beeldvormingsplatform te construeren.</li>
	<li>Het balkpad ontwerpen<ol>
<li>Om het laservermogen op het monster te regelen, gebruikt u een combinatie van een halve golfplaat en polarisatiestraalsplitter (PBS) voor elke laserstraal.</li>
		<li>Installeer een acousto-optische modulator (AOM) in het Stokes laserstraalpad. Focus de bundel met een 150 mm brandpuntsafstand lens in de AOM en recollimatiseer de 0e orde output met een 400 mm brandpuntsafstand lens.</li>
		<li>Gebruik hetzelfde lenspaar (brandpuntsafstanden van 150 mm en 400 mm) om de pompstraal uit te breiden zodat deze overeenkomt met de laserstraalgrootte met de Stokes.</li>
		<li>Plaats de 400 mm brandpuntsafstandlenzen in zowel de pomp- als de Stokes-bundelpaden op afzonderlijke eendimensionale translatiefasen voor het verfijnen van de bundel divergentie en het optimaliseren van de bundelgrootte voordat u de microscoop betreedt.</li>
		<li>Richt de pompbundel met een haakse reflecterende spiegel gemonteerd op een gemotoriseerde translatietrap voor optische vertragingsafstemming. Als de Stokes-bundel optische vertraging nodig heeft, plaatst u deze componenten in plaats daarvan in het bundelpad.</li>
		<li>Laat beide bundels worden gecombineerd op een dichroïsche spiegel met een cutoff-golflengte op ~ 1.000 nm (tussen de pomp- en Stokes-golflengten), zodat de Stokes-straal door de dichroïsche spiegel wordt verzonden terwijl de pompstraal wordt gereflecteerd door de dichroïsche spiegel. Stuur de collineair gecombineerde laserstralen naar de microscoop.</li>
		<li>Om de pomp en Stokes-balken te tsjilpen, plaatst u glazen staven in hun balkpaden. Zie stap 1.5 voor meer informatie.</li>
		<li>Om de juiste uitlijning en straalgrootte te bevestigen, gebruikt u irismembranen na de dichroïsche spiegel en vóór de microscoop. Installeer er in het bijzonder een op een positie dicht bij en de andere op een afstand van de dichroïsche spiegel om een goede uitlijning en bundeloverlapping te bevestigen. Gebruik een IR-weergavekaart of IR-viewer om de bundel tijdens de uitlijning te visualiseren.</li>
		<li>Gebruik een snelle PD en een oscilloscoop om ongeveer de optische vertraging tussen de pomp en Stokes pulsen te meten. Activeer de oscilloscoop door de laserpulstrein te bemonsteren.</li>
		<li>Blokkeer de pompbalk en bemonster de Stokes-balk. Zoom in op een van de pulsen en plaats er een verticale cursor op om de tijdelijke locatie op de oscilloscoop te markeren.</li>
		<li>Deblokkeer de pompbalk en blokkeer de Stokes-balk. Vertaal de vertragingsfase totdat de pulsen van de monsterpomp tijdelijk zijn uitgelijnd met de gemarkeerde positie.</li>
	</ol></li>
	<li>De laserscanmicroscoop<ol>
<li>Voor een rechtopstaande microscoopconfiguratie stuurt u de gecombineerde laserstralen door een periscoop om naar een geschikt niveau te klimmen voordat u de 2D galvo-scanspiegels bereikt.</li>
		<li>Meet de grootte van de laserstraal vóór de microscoop en stel het juiste lenspaar in na de galvo-spiegels om de laserstraal uit te breiden zodat deze het beste overeenkomt met de grootte van de ingangspupil van de objectieflens.</li>
		<li>Construeer een 4-f-systeem met behulp van de twee lenzen, waarbij de achteropening van de objectieflens en het midden van de twee galvo-spiegels geconjugeerde vlakken zijn. U kunt ook twee afzonderlijke 1D-galvospiegels gebruiken met twee 4-f-lenssystemen voor laserscanning.</li>
		<li>Ontwerp na de condensor een 2-in-klapspiegel om de laserstralen te reflecteren voor signaalverzameling. Plaats een lens met een diameter van 2 in het verzonden bundelpad om transmissiesignalen naar de detectoren volledig te verzamelen en te focussen.</li>
		<li>Leid de CARS-signalen naar de PMT met een dichroïsche spiegel met een cutoff bij 776 nm en laat de verzonden SRS-signalen detecteren door de PD. Gebruik een bandpass-filter (655/30 nm) vóór de PMT om resterende excitatielaserpulsen te weigeren. Gebruik een kortdoorlaatfilter (980 nm korte doorgang) vóór de PD om te voorkomen dat de Stokes-straal de detector binnendringt.</li>
		<li>Voor CARS-signaaldetectie sluit u een voorversterker en een stroomspanningsomvormer aan na de PMT en voordat u het signaal naar het data-acquisitiesysteem stuurt. Pas de PMT-spanning aan om het signaal- en beeldcontrast te optimaliseren.</li>
		<li>Gebruik een functiegenerator om de AOM op 1-10 MHz te moduleren en gebruik dezelfde frequentie als de referentie voor de lock-in demodulatie. Gebruik een lock-in versterker om SRS-signalen te extraheren voordat gegevens worden verzameld.</li>
	</ol></li>
	<li>Data-acquisitie en -weergave<ol>
<li>Voer gegevensverzameling uit met behulp van een DAQ-kaart (Digital Data Acquisition) in combinatie met een klemmenblok.</li>
		<li>Gebruik de analoge uitgangen van de DAQ om de galvospiegels en de analoge ingangen voor signaalacquisitie te bedienen.</li>
		<li>Gebruik lab-geschreven software op basis van LabVIEW met een gelijktijdige meerkanaalsweergave voor het in realtime bekijken en opslaan van afbeeldingen (zie Aanvullend bestand).</li>
	</ol></li>
	<li>Het tsjilpen van de femtosecondebron en het meten van de spectrale resolutie OPMERKING: Om een goede spectrale resolutie te bereiken met behulp van spectrale focus, worden glazen staafjes gebruikt om dispersies te introduceren en laserpulsen van femtoseconde tot picoseconde te introduceren. Om de beste spectrale resolutie te bereiken, moet de tjilpsnelheid van de pompbundel gelijk zijn aan die van de Stokes-bundel. Voor dit lasersysteem kan de beste spectrale resolutie worden bereikt door de ~120 fs uitgangslaserpulsen te laten piepen tot 3,4 ps voor de pomp en 1,8 ps voor de Stokes. Dit getjilp wordt bereikt door gebruik te maken van een 4+1 combinatie (vier in de gecombineerde bundel, één alleen in de Stokes balk) van 150 mm glazen staaf (SF-57) combinatie, zoals hieronder beschreven, en zou een spectrale resolutie van 15 cm-1 moeten bereiken. De pulsduur kan worden gemeten met behulp van een autocorrelator.<ol>
<li>Steek een glazen staaf van 150 mm in alleen het Stokes-balkpad.</li>
		<li>Steek twee glazen staven van 150 mm in het gecombineerde pomp/Stokes-balkpad na de dichroïsche bundelsplitser. Om het getjilp te verhogen, laat u de gecombineerde laserstralen de twee glazen staven dubbel passeren door een diëlektrische spiegel aan het ene uiteinde van de staven te plaatsen.</li>
		<li>Om de spectrale resolutie te meten, bereidt u een standaard chemisch (bijv. dimethylsulfoxide [DMSO]) monster dat tussen twee glazen afdekplaten wordt geperst en scant u de vertragingsfase totdat het maximale signaal is bereikt.</li>
		<li>Verplaats de optische vertraging 1.000 μm in de rode schakelrichting. Voer vervolgens 200 frames uit op 10 μm / stap in de richting van blauwverschuiving om de hyperspectrale afbeeldingsstack te verzamelen.</li>
		<li>Om de framenummers om te zetten in golfnummers, voert u een lineaire regressie uit met behulp van de symmetrische (2.913 cm-1) en asymmetrische (2.994 cm-1) C-H-strekken van DMSO en de bijbehorende framenummers40.</li>
		<li>Gebruik het XPM-signaal voor het meten van het spectrale focusintensiteitsprofiel. Sluit het membraan op de condensor half en verplaats de focus naar een lege coverslip. Verzamel hetzelfde aantal stappen als voor hyperspectrale SRS. Om de cars nonresonante achtergrond te meten, richt u zich op de glazen afdekplaat en verzamelt u hetzelfde aantal stappen voor de hyperspectrale CARS-metingen.</li>
	</ol></li>
	<li>Optimaliseren van de signaal-ruisverhouding (SNR) van beelden<ol>
<li>Bereid een chemisch monster voor op uitlijning van het systeem. Volg de procedure beschreven in stap 3.1 voor monstervoorbereiding. OPMERKING: DMSO is een goede keuze omdat het een veel voorkomende laboratoriumstof is met sterke Raman-signalen en goed gescheiden C-H symmetrische en asymmetrische pieken.</li>
		<li>Plaats het monster op het microscoopstadium en voeg indien nodig water of dompelolie toe voor de objectieflens of condensor. Beweeg de rand van de DMSO-druppel goed in het gezichtsveld en pas de objectieflens aan voor de beste scherpstelling. Centreer de condensor met behulp van de Köhler-verlichtingsmethode41. Open het membraan op de condensor volledig.</li>
		<li>Stem de golflengte van de pompbundel af op 800 nm (1.045 nm Stokes) om de piek van 2.913 cm-1 CH3 te bereiken. Stel het vermogen van zowel de pomp als de Stokes-straal in op ~ 30 mW vóór de microscoop door de halve golfplaat aan te passen (~ 10 mW vermogen op het monstervlak).</li>
		<li>Stel voor SRS de versterking van de lock-in-versterker in op ~10 met een tijdconstante van 7 μs (bij gebruik van een 10 μs pixel dwell time). Zorg ervoor dat de tijdconstante kleiner is dan de pixel dwell-tijd. Gebruik Demod R voor de AUX-uitgang voor SRS-signalen.</li>
		<li>Voor CARS stuurt u de PMT-uitgang naar de voorversterker en stroomspanningsomvormer. Gebruik de DAQ om de uitvoer van de converter te verkrijgen.</li>
		<li>Stel de parameters voor beeldacquisitie in de acquisitiesoftware in. Gebruik een pixelgetal van 200 x 200 met een scangrootte van ~100 x 100 μm2. Zorg ervoor dat de afbeelding zowel de DMSO-druppel als een leeg gebied bevat.</li>
		<li>Scan het voorbeeld en controleer de afbeelding op het computerscherm. Scan de gemotoriseerde vertragingsfase in de Stokes/pompbundel terwijl u de real-time beelden bewaakt. Scan de vertraging totdat het signaal is gemaximaliseerd.</li>
		<li>Verplaats de DMSO-druppel om het hele gezichtsveld te bedekken en controleer of het dc-signaalmaximum in het beeld is gecentreerd (signaal is afhankelijk van de pompbundel). Pas de positie van de pompbundel aan via een spiegel of de spanningsverschuiving in de beeldbewerkingssoftware.</li>
		<li>Pas na DC-optimalisatie de Stokes-straalspiegels aan totdat het AC-signaal is gemaximaliseerd door de drempelwaarde aan te passen om ~ 50% verzadiging weer te geven. Controleer of de verzadiging is gecentreerd in de afbeelding. Zo niet, verfijn de spiegels dan alleen in de Stokes-straal. Bewaak het signaal tijdens de uitlijning als real-time feedback over de kwaliteit van de uitlijning.</li>
		<li>Om de SNR te bepalen, selecteert u een klein gebied van de DMSO-afbeelding en meet u de gemiddelde waarde. Selecteer voor de ruis een klein gebied in het lege gebied van de afbeelding en bepaal zowel de gemiddelde waarde als de standaarddeviatie. Trek de ruisgemiddelde waarde af van de signaalgemiddelde waarde en deel de resultaten door de standaarddeviatie van het lege gebied.</li>
		<li>Als de berekende SNR niet hoog genoeg is (typisch 800-1.000 voor SRS en > 10.000 voor CARS bij een PMT-spanning van 0,4 V met deze vermogenscombinatie), controleert en optimaliseert u de bundeloverlapping, bundelgroottes en vertragingsfasepositie, verfijnt u de AOM en wijzigt u de modulatiefrequentie van de functiegenerator totdat de verwachte SNR is verkregen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Beeldanalyse en gegevensverwerking
<ol><li>SNR analyse<ol>
<li>Open de ImageJ-software. Als u het opgeslagen DMSO-voorbeeld .txt bestand wilt importeren, klikt u op Bestand | | importeren | Open.</li>
		<li>Zodra de afbeelding is geïmporteerd, drukt u op CTRL+shift+C om de helderheids- en contrastfunctie (B&C) weer te geven. Om het maximale monstersignaal te vinden, drukt u op de automatische knop in de B&C totdat een gebied van het DMSO-monster verzadigd lijkt.</li>
		<li>Klik op het ovale selectiegereedschap op de ImageJ-interface en markeer een klein gebied van het verzadigde DMSO-gebied. Druk na het markeren op M om het gemiddelde en de standaarddeviatie van het geselecteerde gebied te meten.</li>
		<li>Pas voor het meten van de achtergrond de balken in de B&C-functie aan totdat het signaal van het lege gebied kan worden waargenomen. Klik op de ovale selectie en markeer een gebied van de achtergrond dat dezelfde grootte heeft als voor stap 2.1.3. Zorg ervoor dat de geselecteerde regio geen DMSO bevat. Druk op M om de statistieken van het geselecteerde gebied te meten.</li>
		<li>Bereken de SNR volgens stap 1.6.10.</li>
	</ol></li>
	<li>Hyperspectrale CRS-beelden verwerken<ol>
<li>Importeer het .txt bestand volgens stap 2.1.1. Eenmaal geïmporteerd, klikt u op Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Montage naar Stack... om het bestand te converteren naar een afbeeldingsstapel.</li>
		<li>Blader door de montage totdat de eerste DMSO-piek zichtbaar is. Selecteer een regio op de DMSO en klik op Afbeelding | | stapelen Plot Z-asprofiel om het spectrum intensiteit versus framenummer te plotten. Om de ruwe spectrale gegevens te extraheren, klikt u op de lijst en kopieert u de profielgegevens.</li>
		<li>Om het herstelde spectrum om te zetten in golfnummereenheden, voert u een lineaire regressie uit zoals beschreven in stap 1.5.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Fitting voor het meten van spectrale resolutie OPMERKING: Lorentziaanse functies worden gebruikt om de SRS- en CARS-spectra28 te passen.<ol>
<li>Open de aanpassingssoftware en kopieer en plak de lineaire regressiegegevens in het programma. Voor het aanpassen van de SRS-gegevens markeert u de gegevens en plot u de gegevens vervolgens als een spreidingsdiagram.</li>
		<li>Trek de scatter plot omhoog. Klik op Analyse | Pieken en basislijn | Meerdere Peak Fit | Open Dialoogvenster om de piekanalysator weer te geven. Controleer bij het optrekken of de ingang de huidige plot is en wijzig de piekfunctie in Lorentzian (Lorentz).</li>
		<li>Dubbelklik op elk van de twee DMSO-pieken in de grafiek om de aan te passen regio's te markeren. Klik vervolgens op Open NLfit om het pasvenster te openen. Klik op de knop Passen tot geconvergeerd en vervolgens op OK om een samenvatting in tabelvorm van de aanpassingscoëfficiënten te zien (zie Eq (3)). OPMERKING: De onderstaande vergelijking toont het Lorentziaanse functieformaat in de software. Een1/2 zijn de amplitudes van de passende pieken, w1/2 zijn de breedtes van de gemonteerde pieken en de x01/02 waarden zijn de middelpunten van de gemonteerde pieken. De onafhankelijke variabele is x en de afhankelijke variabele is y. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq3v2.png" style="margin: auto;"> (3)</li>
		<li>Voor CARS spectrale aanpassing, klik op Analyse | Montage | Niet-lineaire curve past | Dialoogvenster openen. Selecteer categorie: nieuw om een nieuwe functie voor CARS te definiëren. Gebruik een autofittingsfunctie met twee pieken die hieronder is gedefinieerd (zie Eq (4)) voor spectrale cars-fittingen. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq4v2.png" style="margin: auto;"> (4)</li>
	</ol></li>
	<li>Bepalen van de ruimtelijke resolutie OPMERKING: Vóór deze stap is het belangrijk om de conversie te kennen tussen de pixelgrootte bij een specifieke vergroting, pixelnummer en de stapgrootte in μm. Dit kan worden uitgevoerd door een monster te gebruiken met een bekende diameter die groter is dan de verwachte beeldresolutie, het lijnprofiel te meten en een Gaussiaanse functie aan te passen om de volledige breedte bij de half maximale (FWHM) waarde te bepalen. Resolutiedoelen of uniforme monsters zoals polymere kralen kunnen worden gebruikt.<ol>
<li>Verkrijg een beeld van cellen of polymeerdeeltjes met een diameter van minder dan 200 nm.</li>
		<li>Gebruik ImageJ om een lijn te tekenen over het kleinste deeltje in de afbeelding.</li>
		<li>Druk op K om het intensiteitsprofiel uit te zetten.</li>
		<li>Klik op de lijst in het pop-upvenster en kopieer de informatie naar de geschikte software.</li>
		<li>Plot het profiel in de aanpassoftware en gebruik Gaussisch passen (klik op Analyse | Montage | Niet-lineaire curve past | Dialoogvenster openen | Categorie: Basisfuncties; Functie: Gauss).</li>
		<li>Lees de piekbreedte na het monteren. Gebruik de conversie van pixel naar grootte om de werkelijke resolutie van de microscoop te verkrijgen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Voorbereiding van monsters voor hyperspectrale CRS-beeldvorming
<ol><li>Voorbereiding van beelddia's en chemische monsters<ol>
<li>Plaats een stuk dubbelzijdige tape op een coverslip en knip een kleine rechthoekige vorm van de tape uit het midden van de geplaatste tape om een open gebied te creëren voor het monster dat moet worden geplaatst.</li>
		<li>Pipetteer 1-2 μL pure DMSO en doseer de druppel in het midden van de vacature.</li>
		<li>Plaats de bovenste coverslip voorzichtig en druk voorzichtig op de randen van de coverslips om de kamer af te dichten, terwijl u ervoor zorgt dat het DMSO-monster geen contact maakt met de randen van de tape.</li>
		<li>Bereid voor gevoeligheidsexperimenten seriële verdunningen van DMSO in deuteriumoxide (D2O) om een concentratiebereik van 50%-0% te geven. Neem 1-2 μL van elke oplossing en bereid geperste monsters zoals hierboven beschreven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Celvoorbereiding<ol>
<li>Zaai de cellen in een schaal met glazen bodem van 35 mm (of groter) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine.</li>
		<li>Incubeer de cellen in een incubatiekamer bij 37 °C met een CO2-atmosfeer van 5% 's nachts of langer totdat ~50%-80% confluency is bereikt.</li>
		<li>Beeld de levende cellen direct af of fixeer de cellen met een 10% formaline-oplossing voor beeldvorming.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de constructie van een multimodale CRS-microscoop en de directe vergelijking tussen CARS- en SRS-beeldvorming. Voor de microscoopconstructie zijn de kritieke stappen ruimtelijke en temporele bundeloverlapping en optimalisatie van de bundelgrootte. Het wordt aanbevolen om een standaardmonster zoals DMSO te gebruiken vóór de biologische beeldvorming voor het optimaliseren van SNR en het kalibreren van Raman-verschuivingen. Directe vergelijking tussen CARS- en SRS-beelden laat zie...

Het Raman-verstrooiingsfenomeen werd voor het eerst waargenomen in 1928 door C. V. Raman1. Wanneer een invallend foton interageert met een monster, kan spontaan een inelastische verstrooiingsgebeurtenis optreden, waarbij de energieverandering van het foton overeenkomt met een vibrationele overgang van de geanalyseerde chemische soort. Dit proces vereist geen gebruik van een chemische tag, waardoor het een veelzijdig, labelvrij hulpmiddel is voor chemische analyse en tegelijkertijd de verstoring van monsters minimaliseert. Ondanks de voordelen lijdt spontane Raman-verstrooiing aan een lage verstrooiingsdoorsnede (meestal 1011 lager dan de infrarood [IR] absorptiedoorsnede), wat lange acquisitietijden vereist voor analyse2. De zoektocht naar het verhogen van de gevoeligheid van het Raman-verstrooiingsproces is dus essentieel bij het pushen van Raman-technologieën voor realtime beeldvorming.
Een effectieve manier om de gevoeligheid van Raman-verstrooiing aanzienlijk te verbeteren, is door middel van coherente Raman-verstrooiingsprocessen (CRS), waarvoor meestal twee laserpulsen worden gebruikt om moleculaire trillingsovergangen te exciteren 3,4. Wanneer het fotonenergieverschil tussen de twee lasers overeenkomt met de trillingsmodi van monstermoleculen, worden sterke Raman-signalen gegenereerd. De twee meest gebruikte CRS-processen voor beeldvorming zijn coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) en gestimuleerde Raman scattering (SRS)5. In de afgelopen twee decennia hebben technologische ontwikkelingen CARS- en SRS-microscopietechnieken verbeterd om krachtige hulpmiddelen te worden voor labelvrije kwantificering en opheldering van chemische veranderingen in biologische monsters.
Chemische beeldvorming door CARS-microscopie kan worden gedateerd op 1982 toen laserscanning voor het eerst werd toegepast om CARS-beelden te verkrijgen, gedemonstreerd door Duncan et al6. De modernisering van CARS-microscopie werd sterk versneld na de brede toepassingen van laserscanning multifotonenfluorescentiemicroscopie7. Vroeg werk van de Xie-groep met behulp van lasers met een hoge herhalingssnelheid heeft CARS omgevormd tot een snel, labelvrij, chemisch beeldvormingsplatform voor de karakterisering van moleculen in biologische monsters 8,9,10. Een van de belangrijkste problemen voor CARS-beeldvorming is de aanwezigheid van een niet-resonante achtergrond, die het beeldcontrast vermindert en het Raman-spectrum vervormt. Er zijn veel inspanningen geleverd om ofwel de niet-resonante achtergrond11,12,13,14,15 te verminderen of om resonante Raman-signalen uit de CARS-spectra16,17 te halen. Een andere vooruitgang die het veld enorm heeft verbeterd, is hyperspectrale CARS-beeldvorming, die spectrale mapping mogelijk maakt bij elke beeldpixel met verbeterde chemische selectiviteit 18,19,20,21.
Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) is een jongere beeldvormingstechnologie dan CARS, hoewel het eerder werd ontdekt22. In 2007 werd SRS-microscopie gerapporteerd met behulp van een laserbron met lage herhalingssnelheid23. Al snel demonstreerden verschillende groepen high-speed SRS-beeldvorming met behulp van lasers met hoge herhalingssnelheid 24,25,26. Een van de belangrijkste voordelen van SRS-microscopie ten opzichte van CARS is de afwezigheid van de niet-resonante achtergrond27, hoewel andere achtergronden zoals cross-phase modulatie (XPM), transiënte absorptie (TA), twee-fotonenabsorptie (TPA) en fotothermisch (PT) effect, kunnen optreden met SRS28. Bovendien hebben het SRS-signaal en de monsterconcentratie lineaire relaties, in tegenstelling tot CARS, dat een kwadratische signaalconcentratieafhankelijkheid heeft29. Dit vereenvoudigt chemische kwantificering en spectrale ontmenging. Multicolor en hyperspectrale SRS is geëvolueerd in verschillende vormen 30,31,32,33,34,35,36, waarbij spectrale focus een van de meest populaire benaderingen is voor chemische beeldvorming 37,38.
Zowel CARS als SRS vereisen de focus van de pomp en Stokes laserstralen op het monster om de trillingsovergang van de moleculen voor signaalexcitatie te matchen. CARS en SRS microscopen hebben ook veel gemeen. De fysica die ten grondslag ligt aan deze twee processen en signaaldetecties die betrokken zijn bij deze microscopietechnologieën hebben echter verschillen 3,39. CARS is een parametrisch proces dat geen netto foton-molecuul energiekoppelingheeft 3. SRS is echter een niet-parametrisch proces en draagt bij aan de energieoverdracht tussen fotonen en moleculaire systemen27. In CARS wordt een nieuw signaal met anti-Stokes-frequentie gegenereerd, terwijl SRS zich manifesteert als de energieoverdracht tussen de pomp en Stokes-laserstralen.
CARS-signaal voldoet aan Eq (1)28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq1v2.png" style="margin: auto;"> (1)
Ondertussen kan het SRS-signaal worden geschreven als Eq (2) 28.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63677/63677eq2v2.png" style="margin: auto;">(2)
Hier zijn Ip, Is, ICARS en ΔISRS de intensiteiten van respectievelijk de pompbundel, Stokes-bundel, CARS-signaal en SRS-signalen. χ(3) is de derde-orde niet-lineaire optische gevoeligheid van het monster en is een complexe waarde die bestaat uit reële en imaginaire delen.
Deze vergelijkingen drukken de spectrale profielen en signaalconcentratieafhankelijkheid van CARS en SRS uit. Verschillen in fysica resulteren in ongelijksoortige detectieschema's voor deze twee microscopietechnologieën. Signaaldetectie in CARS omvat meestal spectrale scheiding van nieuw gegenereerde fotonen en detectie met behulp van een fotomultiplicatorbuis (PMT) of charge-coupled device (CCD); voor SRS wordt de energie-uitwisseling tussen de pomp en stokesbundels meestal gemeten door intensiteitsmodulatie met hoge snelheid met behulp van een optische modulator en demodulatie met behulp van een fotodiode (PD) in combinatie met een lock-in versterker.
Hoewel er de afgelopen jaren veel technologische ontwikkelingen en toepassingen zijn gepubliceerd op zowel CARS- als SRS-gebieden, zijn er geen systematische vergelijkingen van de twee CRS-technieken op hetzelfde platform uitgevoerd, vooral voor hyperspectrale CARS- en SRS-microscopie. Directe vergelijkingen in gevoeligheid, ruimtelijke resolutie, spectrale resolutie en chemische scheidingsmogelijkheden zouden biologen in staat stellen om de beste modaliteit voor chemische kwantificering te selecteren. In dit protocol worden gedetailleerde stappen beschreven om een multimodaal beeldvormingsplatform te bouwen met zowel hyperspectrale CARS- als SRS-modaliteiten op basis van een femtosecondelasersysteem en spectrale focus. De twee technieken zijn vergeleken in de voorwaartse richting voor spectrale resolutie, detectiegevoeligheid, ruimtelijke resolutie en beeldcontrasten van cellen.

<table><tbody><tr><td>2D galvo scanner set</td><td>Thorlabs</td><td>GVS002</td><td></td></tr><tr><td>Acousto-optic modulator</td><td>Isomet</td><td>M1205-P80L-0.5</td><td></td></tr><tr><td>AOM driver</td><td>Isomet</td><td>532B-2</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition card</td><td>National Instruments</td><td>PCle 6363</td><td>Aangepaste bestelfilter (980 sp)</td></tr><tr><td>Delay stage</td><td>Zaber</td><td>X-LSM050A</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Millipore Sigma</td><td>151882-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror voor bundelcombinatie</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP1000</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror voor signaalscheiding</td><td>Semrock</td><td>FF776-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MiliporeSigma</td><td>200-664-3</td><td></td></tr><tr><td>MIA PaCa 2 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1420</td><td></td></tr><tr><td>Femtosecond laser systeem</td><td>Spectral Physics</td><td>InSightX3+</td><td></td></tr><tr><td>Filter voor CARS</td><td>Chroma</td><td>AT655/30m</td><td></td></tr><tr><td>Filter voor SRS</td><td>Chroma</td><td>ET980sp</td><td></td></tr><tr><td>Functiegenerator</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Glas staven</td><td>Lattice Electro Optics</td><td>SF-57</td><td></td></tr><tr><td>Halve-golfplaat</td><td>Newport</td><td>10RP02-51; 10RP02-46</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 2020</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Dit is de software voor beeldverwerving</td></tr><tr><td>Lock-in versterker</td><td>Zurich Instrument</td><td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td>Microscoophis</td><td>Olympus</td><td>BX51W1</td><td></td></tr><tr><td>Objectieflens</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Origin Pro 2019b</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>Dit is de software voor spectraal fitting</td></tr><tr><td>Oscilloscoop</td><td>Tektronix</td><td>TBS2204B</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiode</td><td>Hamamatsu</td><td>S3994-01</td><td></td></tr><tr><td>PMT-detector</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>PMT-spanningsversterker</td><td>Advanced Research Instrument Corp.</td><td>PMT4V3</td><td></td></tr><tr><td>Polariserende beamsplitter cube</td><td>Thorlabs</td><td>PBS255</td><td></td></tr><tr><td>Aansluitblok</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr></tbody></table>

directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde raman-verstrooiing en coherente anti-stokes raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie zijn de meest gebruikte coherente Raman-verstrooiingsbeeldvormingstechnologieën. Hyperspectrale SRS- en CARS-beeldvorming bieden Raman spectrale informatie op elke pixel, wat een betere scheiding van verschillende chemische samenstellingen mogelijk maakt. Hoewel beide technieken twee excitatielasers vereisen, zijn hun signaaldetectieschema's en spectrale eigenschappen heel verschillend. Het doel van dit protocol is om zowel hyperspectrale SRS- als CARS-beeldvorming op één platform uit te voeren en de twee microscopietechnieken voor het afbeelden van verschillende biologische monsters te vergelijken. De spectrale focusmethode wordt gebruikt om spectrale informatie te verkrijgen met behulp van femtosecondelasers. Door standaard chemische monsters te gebruiken, worden de gevoeligheid, ruimtelijke resolutie en spectrale resolutie van SRS en CARS in dezelfde excitatieomstandigheden (d.w.z. vermogen bij het monster, pixel dwell-tijd, objectieve lens, pulsenergie) vergeleken. De beeldcontrasten van CARS en SRS voor biologische monsters worden naast elkaar geplaatst en vergeleken. De directe vergelijking van CARS- en SRS-prestaties zou een optimale selectie van de modaliteit voor chemische beeldvorming mogelijk maken.

Vergelijkingen van de spectrale resolutie Figuur 2 vergelijkt de spectrale resolutie van hyperspectrale SRS (figuur 2A) en CARS (figuur 2B) microscopie met behulp van een DMSO-monster. Voor het SRS-spectrum werden twee Lorentziaanse functies (zie protocol stap 2.3) toegepast om in het spectrum te passen, en een resolutie van 14,6 cm-1 werd verkregen met behulp van de 2.913 cm-1 piek. Voor CA...

Dit artikel vergelijkt direct de resolutie, gevoeligheid en beeldcontrasten van gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) geïntegreerd in hetzelfde microscoopplatform. De resultaten laten zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, SRS betere contrasten en spectrale resolutie geeft, en beide methoden hebben een vergelijkbare gevoeligheid.

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging ...

Dit protocol vergelijkt de twee meest gebruikte hyperspectrale coherente Raman-verstrooiingstechnieken, waaronder de coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing en de gestimuleerde Raman-verstrooiingsprocessen en dit stelt de biologen in staat om de beste beeldvormingsmodaliteit voor hun biologische toepassingen te kiezen. Met behulp van de intrinsieke trillingshandtekeningen is coherente Raman-spectroscopie in staat om chemische informatie en biologische monsters in kaart te brengen zonder dat exogene etikettering nodig is. Coherente Raman-microscopie heeft ons begrip van cellulair metabolisme, mapping, medicijndistributies, ziektediagnostiek en het kwantificeren van chemische veranderingen uitgebreid.Dit is een techniek die voldoende training vereist in zowel optica als spectroscopie. Ik zou aanraden om een paar overzichtsartikelen te lezen en getraind te worden door een expert voordat je deze techniek gebruikt. Bereid om te beginnen de beelddia's voor door een stuk dubbelzijdige tape op een afdekslip te plaatsen en een kleine rechthoekige vorm van de tape uit het midden van de tape te snijden om een open gebied te creëren voor het monster dat moet worden geplaatst.Pipetteer 1 tot 2 microliter pure DMSO en doseer de druppel in het midden van de vacature. Plaats de bovenste afdekselslip voorzichtig en plaats voorzichtig de randen van de afdekslips om de kamer af te dichten, terwijl u ervoor zorgt dat het DMSO-monster geen contact maakt met de randen van de tape. Bereid voor gevoeligheidsexperimenten seriële verdunningen van DMSO in deuteriumoxide om een concentratiebereik van 50 tot 0% te geven Neem 1 tot 2 microliter van elke oplossing en bereid geperste monsters zoals eerder aangetoond.Plaats het monster op het microscoopstadium en voeg indien nodig water of dompelolie toe voor de objectieflens of condensor. Beweeg de rand van de DMSO-druppel op de juiste manier in het gezichtsveld en pas de objectieflens aan voor de beste scherpstelling, centreer vervolgens de condensor met behulp van de Kohler-verlichtingsmethode en open het membraan op de condensor volledig. Stem vervolgens de golflengte van de pompbundel af op 800 nanometer om het 2913-golfnummer CH3-piek te richten en stel het vermogen van zowel de pomp als de Stokes-bundel in op ongeveer 30 milliwatt vóór de microscoop door de halve golfplaat aan te passen.Stel voor SRS de versterking van de lock-in-versterker in op ongeveer 10 met een tijdconstante van 7 microseconden, zodat de tijdconstante kleiner is dan de pixel dwell-tijd. Stel de parameters voor beeldacquisitie en de acquisitiesoftware in met een pixelgetal van 200 bij 200 met de scangrootte van ongeveer 100 bij 100 vierkante micrometer, zorg ervoor dat het beeld zowel de DMSO-druppel als een leeg gebied bevat, scan vervolgens het monster en controleer het beeld op het computerscherm. Scan vervolgens het gemotoriseerde vertragingsbeeld in de Stokes-pompbundel terwijl u de realtime beelden bewaakt en scant de vertraging totdat het signaal is gemaximaliseerd.Verplaats de DMSO-druppel om het hele gezichtsveld te bedekken en controleer of het DC-signaalmaximum in het beeld is gecentreerd, omdat het signaal afhankelijk is van de pompbundel. Pas de positie van de pompbundel aan via een spiegel of de spanningsverschuiving in de beeldbewerkingssoftware. Pas na DC-optimalisatie de Stokes-straalspiegels aan totdat het AC-signaal is gemaximaliseerd door de drempelwaarde aan te passen om ongeveer 50% verzadiging weer te geven terwijl wordt gecontroleerd of de verzadiging in het beeld is gecentreerd.Zo niet, verfijn de spiegels dan alleen in de Stokes-bundel en controleer het signaal tijdens de uitlijning als realtime feedback over de kwaliteit van de uitlijning. Voor SNR-analyse opent u de ImageJ-software en importeert u het opgeslagen DMSO-voorbeeldtekstbestand door te klikken op Bestand en vervolgens op Importeren, gevolgd door de opties Tekstafbeelding en Openen in het vervolgkeuzemenu. Zodra de afbeelding is geïmporteerd, drukt u op Control Shift C om de functie Helderheid en contrast weer te geven en drukt u vervolgens op de knop Automatisch in de functie Helderheid en contrast totdat het gebied van het DMSO-monster verzadigd lijkt om het maximale monstersignaal te vinden.Klik vervolgens op de ovale selectietool op de ImageJ-interface en markeer een klein gebied van het verzadigde DMSO-gebied. Druk na het markeren op M om het gemiddelde en de standaarddeviatie van het geselecteerde gebied te meten. Voor het meten van de achtergrond past u de balken in de functie Helderheid en contrast aan totdat het signaal van het lege gebied kan worden waargenomen, klikt u vervolgens op de selectie Ovaal en markeert u een gebied van de achtergrond, zodat het geselecteerde gebied geen DMSO bevat.Druk daarna op M om de statistieken van het geselecteerde gebied te meten. Bereken vervolgens de SNR zoals eerder aangetoond door de ruisgemiddelde waarde en signaalgemiddelde waarde samen met de standaarddeviatie te meten. Als u de hyperspectrale CRS-afbeeldingen wilt verwerken, importeert u het tekstbestand door te klikken op de opties Bestand en vervolgens op Importeren, Tekstafbeelding en Openen in het vervolgkeuzemenu.Eenmaal geïmporteerd, klikt u op Afbeelding, vervolgens stapels, gevolgd door Tools en Montage to Stack-opties om het bestand naar een afbeeldingsstapel te converteren en bladert u vervolgens door de montage totdat de eerste DMSO-piek zichtbaar is. Selecteer een gebied op de DMSO en klik op Afbeelding, gevolgd door Stack en Plot Z-as Profiel opties om de intensiteit versus frame nummer spectrum te plotten. Klik vervolgens op Lijst en kopieer de profielgegevens om de onbewerkte spectrale gegevens te extraheren.Om het herstelde spectrum om te zetten in frequentie-eenheden, voert u een lineaire regressie uit met behulp van de symmetrische en asymmetrische CH-uitrekking van DMSO en hun bijbehorende framenummers. De spectrale resolutie van de DMSO werd gemeten met behulp van een hyperspectrale SRS- en CARS-microscopie, die een resolutie van respectievelijk 14,6 en 17,1 golfnummer laten zien, wat aangeeft dat SRS een betere spectrale resolutie heeft. De DMSO SRS-spectra werden verkregen bij concentraties van 0,1 en 0,01%, waarbij de piek bij 2913-golfnummer kan worden opgelost in de eerste, maar niet in de laatste, wat aangeeft dat de detectielimiet tussen 0,1 en 0,01% DMSO ligt.De fase-opgehaalde CARS-spectra laten zien dat de DMSO 2913-golfnummerpiek duidelijk kan worden opgelost voor de 0,1% DMSO, maar niet de 0,01% die een detectiegrens tussen deze twee concentraties aangeeft. SRS- en CARS-intensiteitsprofielen van een MIA PaCA-2-cel toonden aan dat het SRS-signaal een resolutie van 398,6 nanometer gaf, terwijl het CARS-signaal een 1,2 keer betere resolutie van 330,3 nanometer gaf. De SRS- en CARS-beelden van MIA PaCa-2-cellen op verschillende optische vertragingsposities tonen de sterkste signalen met lipidedruppels als heldere stippen voor SRS, terwijl CARS veel lagere contrasten hebben.Een rode verschuiving van 37 golfnummers in spectrale focus verbeterde echter de lipidencontrasten voor zowel SRS als CARS. De SRS-spectra tonen een veel sterker signaal op 2850 golfnummer voor lipidedruppels dan andere organellen, terwijl de CARS-spectra een kleine rode verschuiving vertonen. Om het coherente Raman-verstrooiingssignaal te optimaliseren, zoekt u eerst de samplefocus, stemt u vervolgens de optische vertraging af en ten slotte stemt u de spiegels af totdat een maximum is bereikt.Andere pomp-sondetechnologieën, zoals transiënte absorptie, zijn inherent geïntegreerd in het CRS-platform. Deze technologie is zeer krachtig voor het meten van de absorptiekinetiek van sterke lichtabsorberende niet-fluorescerende moleculen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om kleine moleculen op een labelvrije manier te bekijken met een hoge chemische celactiviteit.Het stelt onderzoekers ook in staat om veranderingen in lipidemetabolisme, intracellulaire dynamica en medicijndistributies te bekijken.

direct-comparison-hyperspectral-stimulated-raman-scattering-coherent

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Een combinatie van drie enkele golflengte korte gepulste lasers wordt gebruikt om coherent anti-Stokes Raman scattering (auto's) en dubbel-resonante CARS (DR-CARS) te genereren. Het verschil tussen deze signalen zorgt voor een verbeterde gevoeligheid voor anders moeilijk te coherent Raman signalen te detecteren, waardoor beeldvorming van zwakke Raman scatterers.

Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

In dit manuscript wordt de implementatie beschreven van een gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) Microscoop, verkregen door de integratie van een SRS experimentele opstelling met een laser scanning microscoop. De SRS-Microscoop is gebaseerd op twee femtosecondelaser (FS) laserbronnen, een TI-Sapphire (TI: SA) en gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (OPO).

Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

Dit artikel presenteert de integratie van een spectrale focusmodule en een dual-output pulslaser, waardoor snelle hyperspectrale beeldvorming van gouden nanodeeltjes en kankercellen mogelijk wordt. Dit werk is bedoeld om de details van multimodale niet-lineaire optische technieken te demonstreren op een standaard laserscanmicroscoop.

Biomoleculaire beeldvorming van cellulaire opname van nanodeeltjes met behulp van multimodale niet-lineaire optische microscopie

We presenteren een protocol om chemische beelden te verkrijgen met breedband gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie. Gebaseerd op een SRS-microscoop die werkt met differentiële meerkanaals-lock-in detectie, beschrijft het protocol de monstervoorbereiding, aanpassing van het SRS-apparaat en chemometrie om verschillende bestanddelen van chemisch heterogene monsters te ontwarren.

Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Het visualiseren van myelinisatie is een belangrijk doel voor veel onderzoekers die het zenuwstelsel bestuderen. CARS is een techniek die compatibel is met immunofluorescentie die lipiden in weefsel zoals de hersenen die gespecialiseerde structuren zoals myeline verlichten, native in beeld kan brengen.

Coherente Anti-Stokes Raman Spectroscopie (CARS) Toepassing voor Imaging Myelinisatie in Brain Slices

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

Leer CARS en SRS microscopie vergelijken voor chemische beeldvorming in biologische monsters. Deze methoden gebruiken intrinsieke vibratiesignaturen zonder exogene labeling en helpen onderzoekers bij het kiezen van de optimale beeldvormingstechniek.

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming (Video) | JoVE Journal

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

Meer video's verkennen