Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

Dit protocol vergelijkt de twee meest gebruikte hyperspectrale coherente Raman-verstrooiingstechnieken, waaronder de coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing en de gestimuleerde Raman-verstrooiingsprocessen en dit stelt de biologen in staat om de beste beeldvormingsmodaliteit voor hun biologische toepassingen te kiezen. Met behulp van de intrinsieke trillingshandtekeningen is coherente Raman-spectroscopie in staat om chemische informatie en biologische monsters in kaart te brengen zonder dat exogene etikettering nodig is. Coherente Raman-microscopie heeft ons begrip van cellulair metabolisme, mapping, medicijndistributies, ziektediagnostiek en het kwantificeren van chemische veranderingen uitgebreid.

Dit is een techniek die voldoende training vereist in zowel optica als spectroscopie. Ik zou aanraden om een paar overzichtsartikelen te lezen en getraind te worden door een expert voordat je deze techniek gebruikt. Bereid om te beginnen de beelddia's voor door een stuk dubbelzijdige tape op een afdekslip te plaatsen en een kleine rechthoekige vorm van de tape uit het midden van de tape te snijden om een open gebied te creëren voor het monster dat moet worden geplaatst.

Pipetteer 1 tot 2 microliter pure DMSO en doseer de druppel in het midden van de vacature. Plaats de bovenste afdekselslip voorzichtig en plaats voorzichtig de randen van de afdekslips om de kamer af te dichten, terwijl u ervoor zorgt dat het DMSO-monster geen contact maakt met de randen van de tape. Bereid voor gevoeligheidsexperimenten seriële verdunningen van DMSO in deuteriumoxide om een concentratiebereik van 50 tot 0% te geven Neem 1 tot 2 microliter van elke oplossing en bereid geperste monsters zoals eerder aangetoond.

Plaats het monster op het microscoopstadium en voeg indien nodig water of dompelolie toe voor de objectieflens of condensor. Beweeg de rand van de DMSO-druppel op de juiste manier in het gezichtsveld en pas de objectieflens aan voor de beste scherpstelling, centreer vervolgens de condensor met behulp van de Kohler-verlichtingsmethode en open het membraan op de condensor volledig. Stem vervolgens de golflengte van de pompbundel af op 800 nanometer om het 2913-golfnummer CH3-piek te richten en stel het vermogen van zowel de pomp als de Stokes-bundel in op ongeveer 30 milliwatt vóór de microscoop door de halve golfplaat aan te passen.

Stel voor SRS de versterking van de lock-in-versterker in op ongeveer 10 met een tijdconstante van 7 microseconden, zodat de tijdconstante kleiner is dan de pixel dwell-tijd. Stel de parameters voor beeldacquisitie en de acquisitiesoftware in met een pixelgetal van 200 bij 200 met de scangrootte van ongeveer 100 bij 100 vierkante micrometer, zorg ervoor dat het beeld zowel de DMSO-druppel als een leeg gebied bevat, scan vervolgens het monster en controleer het beeld op het computerscherm. Scan vervolgens het gemotoriseerde vertragingsbeeld in de Stokes-pompbundel terwijl u de realtime beelden bewaakt en scant de vertraging totdat het signaal is gemaximaliseerd.

Verplaats de DMSO-druppel om het hele gezichtsveld te bedekken en controleer of het DC-signaalmaximum in het beeld is gecentreerd, omdat het signaal afhankelijk is van de pompbundel. Pas de positie van de pompbundel aan via een spiegel of de spanningsverschuiving in de beeldbewerkingssoftware. Pas na DC-optimalisatie de Stokes-straalspiegels aan totdat het AC-signaal is gemaximaliseerd door de drempelwaarde aan te passen om ongeveer 50% verzadiging weer te geven terwijl wordt gecontroleerd of de verzadiging in het beeld is gecentreerd.

Zo niet, verfijn de spiegels dan alleen in de Stokes-bundel en controleer het signaal tijdens de uitlijning als realtime feedback over de kwaliteit van de uitlijning. Voor SNR-analyse opent u de ImageJ-software en importeert u het opgeslagen DMSO-voorbeeldtekstbestand door te klikken op Bestand en vervolgens op Importeren, gevolgd door de opties Tekstafbeelding en Openen in het vervolgkeuzemenu. Zodra de afbeelding is geïmporteerd, drukt u op Control Shift C om de functie Helderheid en contrast weer te geven en drukt u vervolgens op de knop Automatisch in de functie Helderheid en contrast totdat het gebied van het DMSO-monster verzadigd lijkt om het maximale monstersignaal te vinden.

Klik vervolgens op de ovale selectietool op de ImageJ-interface en markeer een klein gebied van het verzadigde DMSO-gebied. Druk na het markeren op M om het gemiddelde en de standaarddeviatie van het geselecteerde gebied te meten. Voor het meten van de achtergrond past u de balken in de functie Helderheid en contrast aan totdat het signaal van het lege gebied kan worden waargenomen, klikt u vervolgens op de selectie Ovaal en markeert u een gebied van de achtergrond, zodat het geselecteerde gebied geen DMSO bevat.

Druk daarna op M om de statistieken van het geselecteerde gebied te meten. Bereken vervolgens de SNR zoals eerder aangetoond door de ruisgemiddelde waarde en signaalgemiddelde waarde samen met de standaarddeviatie te meten. Als u de hyperspectrale CRS-afbeeldingen wilt verwerken, importeert u het tekstbestand door te klikken op de opties Bestand en vervolgens op Importeren, Tekstafbeelding en Openen in het vervolgkeuzemenu.

Eenmaal geïmporteerd, klikt u op Afbeelding, vervolgens stapels, gevolgd door Tools en Montage to Stack-opties om het bestand naar een afbeeldingsstapel te converteren en bladert u vervolgens door de montage totdat de eerste DMSO-piek zichtbaar is. Selecteer een gebied op de DMSO en klik op Afbeelding, gevolgd door Stack en Plot Z-as Profiel opties om de intensiteit versus frame nummer spectrum te plotten. Klik vervolgens op Lijst en kopieer de profielgegevens om de onbewerkte spectrale gegevens te extraheren.

Om het herstelde spectrum om te zetten in frequentie-eenheden, voert u een lineaire regressie uit met behulp van de symmetrische en asymmetrische CH-uitrekking van DMSO en hun bijbehorende framenummers. De spectrale resolutie van de DMSO werd gemeten met behulp van een hyperspectrale SRS- en CARS-microscopie, die een resolutie van respectievelijk 14,6 en 17,1 golfnummer laten zien, wat aangeeft dat SRS een betere spectrale resolutie heeft. De DMSO SRS-spectra werden verkregen bij concentraties van 0,1 en 0,01%, waarbij de piek bij 2913-golfnummer kan worden opgelost in de eerste, maar niet in de laatste, wat aangeeft dat de detectielimiet tussen 0,1 en 0,01% DMSO ligt.

De fase-opgehaalde CARS-spectra laten zien dat de DMSO 2913-golfnummerpiek duidelijk kan worden opgelost voor de 0,1% DMSO, maar niet de 0,01% die een detectiegrens tussen deze twee concentraties aangeeft. SRS- en CARS-intensiteitsprofielen van een MIA PaCA-2-cel toonden aan dat het SRS-signaal een resolutie van 398,6 nanometer gaf, terwijl het CARS-signaal een 1,2 keer betere resolutie van 330,3 nanometer gaf. De SRS- en CARS-beelden van MIA PaCa-2-cellen op verschillende optische vertragingsposities tonen de sterkste signalen met lipidedruppels als heldere stippen voor SRS, terwijl CARS veel lagere contrasten hebben.

Een rode verschuiving van 37 golfnummers in spectrale focus verbeterde echter de lipidencontrasten voor zowel SRS als CARS. De SRS-spectra tonen een veel sterker signaal op 2850 golfnummer voor lipidedruppels dan andere organellen, terwijl de CARS-spectra een kleine rode verschuiving vertonen. Om het coherente Raman-verstrooiingssignaal te optimaliseren, zoekt u eerst de samplefocus, stemt u vervolgens de optische vertraging af en ten slotte stemt u de spiegels af totdat een maximum is bereikt.

Andere pomp-sondetechnologieën, zoals transiënte absorptie, zijn inherent geïntegreerd in het CRS-platform. Deze technologie is zeer krachtig voor het meten van de absorptiekinetiek van sterke lichtabsorberende niet-fluorescerende moleculen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om kleine moleculen op een labelvrije manier te bekijken met een hoge chemische celactiviteit.

Het stelt onderzoekers ook in staat om veranderingen in lipidemetabolisme, intracellulaire dynamica en medicijndistributies te bekijken.