Name: Onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Ontdek de CLARITY-methode voor het visualiseren van astrocyten en neuronen in de hippocampus van muizen. Deze techniek maakt hersenweefsel transparant voor celresolutiebeeldvorming en helpt onderzoekers ruimtelijke relaties tussen cellen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project heeft financiering ontvangen van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 803589), de Israel Science Foundation (ISF-subsidie nr. 1815/18) en de Canada-Israël-subsidies (CIHR-ISF, subsidie nr. 2591/18). We bedanken Nechama Novick voor het becommentariëren van het hele manuscript.

Experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Hebrew University Animal Care and Use Committee en voldeden aan de richtlijnen van het National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Virale vectortransductie
OPMERKING: Virale vectortransductie wordt gebruikt om fluoroforen in de hersenen tot expressie te brengen.
<ol><li>Gebruik een atlas (bijv. Allen Brain Atlas) om de relevante coördinatie van het doelgebied te lokaliseren. OPMERKING: 3D-atlassen zijn online te vinden (bijv. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).</li>
	<li>Injecteer met behulp van stereotactische chirurgie de virale vectoren in de relevante hersenstructuur. Zie9 voor een gedetailleerd protocol.</li>
	<li>Wacht 3-6 weken op fluorofoorexpressie. OPMERKING: Een korte periode is voldoende als alleen cellichamen moeten worden gemarkeerd. Een lange periode van tijd zal nodig zijn als de axonale projecties relevant zijn voor de vraag, omdat het langer duurt voordat de fluoroforen zich uitdrukken in axonen, die enkele millimeters lang kunnen zijn.</li>
	<li>Valideer vooraf de specificiteit en penetrantie van fluorofoorexpressie (zowel van virale expressie als van TG-dieren) (figuur 1A). Voordat u doorgaat met de CLARITY-procedure, wijst u ten minste één brein aan voor dunne plakjes en zorgt u ervoor dat de fluorofoorexpressie zowel sterk als specifiek is voor het doelcelkenmerk.</li>
</ol>2. DUIDELIJKHEID
OPMERKING: Deze methode maakt de hersenen binnen 2-6 weken transparant.
<ol><li>Voer transcraniële perfusie uit op dieren met behulp van koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Verwijder de hersenen en bewaar het in PFA 's nachts bij 4 ° C in een buis van 50 ml of een vergelijkbare container. OPMERKING: Voordat transcraniële perfusie wordt uitgevoerd, moet het dier diep worden verdoofd. In de voorbeelden in dit protocol werden alle dieren verdoofd met Ketamine en Xylazine (respectievelijk 90% en 10%).</li>
	<li>Vervang PFA door Hydrogel Solution (HS; zie tabel 1) gedurende 48 uur bij 4 °C. OPMERKING: Laat de materialen in dit stadium niet warmer worden dan de koeltemperatuur (4-8 °C), anders zal de Hydrogel polymeriseren. Het GS dat in dit protocol wordt gebruikt, bevat 2% acrylamide, in tegenstelling tot eerdere protocollen die 4% 22 of 1% 17 suggereren. Het voordeel van 2% wordt gedetailleerd beschreven in de discussiesectie. Werk bij het voorbereiden van de HS op een ijskoud oppervlak. Bewaren bij -20 °C.</li>
	<li>Ontgassing OPMERKING: Het doel van deze fase is om alle vrije zuurstof uit het weefsel te verwijderen, omdat O2 het polymerisatieproces verstoort. Elkniet-O 2-gas kan worden gebruikt (bijv. N2, CO2); N2 wordt aanbevolen.<ol>
<li>Breng de N2 uit de tank over via een 5 mm (interne) flexibele buis, aangesloten op een naald van 19 G aan het uiteinde (figuur 1B).</li>
		<li>Maak twee kleine gaatjes (naaldbreed) in de dop van de buis: een om het gas in te brengen en de andere om de lucht de buis te laten verlaten (figuur 1C).</li>
		<li>Bevestig de buis van het N2-gas aan de buis en vervang de gassen gedurende ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Verwijder de buis en sluit de gaten onmiddellijk af met modelleerklei op elke buis (figuur 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de ontgaste verzegelde buizen gedurende 3,5 uur over in een bad van 37 °C om het HS te polymeriseren, dat een gel wordt. Zorg ervoor dat u de buizen niet schudt (figuur 1E).</li>
	<li>Haal de hersenen uit de buis en verwijder voorzichtig de gepolymeriseerde gel eromheen met behulp van laboratoriumdoekjes. Zorg ervoor dat er geen resterende gel aan het oppervlak van het weefsel vastzit, omdat deze in de volgende stappen met de oplossing kan reageren, waardoor het weefselverwijderingsproces wordt geremd (figuur 1F). OPMERKING: Omdat de gel PFA bevatte, moet de extractie onder een zuurkast worden gedaan.</li>
	<li>Snijd de hersenen als de vraag bij de hand slechts een deel ervan vereist. Verdeel het in tweeën of in zeer dikke plakken die alle interessegebieden bevatten (figuur 1G).</li>
	<li>Plaats de plakjes in de First Clearing Solution (CS1, zie tabel 2) in een nieuwe container en schud gedurende 24 uur bij 37 °C bij 70 tpm.</li>
	<li>Volg de hieronder beschreven stappen om de hersenen over te brengen van CS1 naar de tweede Clearing Solution (CS2, zie tabel 2).<ol>
<li>Bereid van tevoren een geperforeerde buis voor de hersenen voor (figuur 1H).</li>
		<li>Verwarm CS2 voor op 40-45 °C in een bekerglas dat groot genoeg is om de buis te bevatten. Doe dit op een kookplaat met een roerstaaf. Zorg ervoor dat de temperatuur niet 55 °C bereikt om het bleken van de tot expressie gebrachte eiwitten te voorkomen.</li>
		<li>Plaats het met CS2 gevulde bekerglas en de geperforeerde buis op een roerinrichting (een bekerglas van 2 L in figuur 1I). Stel een gematigde roersnelheid in die ervoor zorgt dat de vloeistof stroomt zonder het weefsel te vervormen. OPMERKING: Binnen 2-6 weken wordt het weefsel transparant (het proces begint aan de periferie en beweegt naar binnen in de richting van de centrale hersenstructuren). De beslissing wanneer het weefsel "helder genoeg" is, is aan persoonlijk oordeel. De hersenen moeten voldoende transparant zijn voor beeldvorming onder de microscoop zonder interferentie (figuur 1J niet duidelijk genoeg; Figuur 1K duidelijk genoeg). Het overschrijden van het punt waarop het weefsel helder genoeg is, kan verlies van weefselstijfheid veroorzaken.</li>
	</ol></li>
	<li>Overdracht van CS2 naar PBST (0,5% Triton X-100 in PBS, zie tabel 2) in een nieuwe container bij 37 °C met licht schudden (70 rpm) gedurende 24 uur. OPMERKING: In de PBST wordt het weefsel witachtig (figuur 1L). De helderheid zal terugkeren (en verbeteren) wanneer deze is ingebed in de refractieve indexvergelijkingsoplossing (RIMS, zie stap 2.14).</li>
	<li>Vervang de PBST door de nieuwe PBST. Nog 24 uur onder dezelfde omstandigheden (37 °C met licht schudden) bewaren.</li>
	<li>Vervang PBST opnieuw door nieuwe PBST en houd 24 uur op RT.</li>
	<li>Transfer naar PBS bij RT gedurende 24 uur.</li>
	<li>Vervang de PBS en vertrek bij RT voor nog eens 24 uur.</li>
	<li>Verwijder de hersenen van PBS en breng het 's nachts over naar RIMS bij 37 °C. OPMERKING: Aanvankelijk kunnen rimpelingen in de RIMS de hersenen omringen. Dit protocol is ontworpen en gevalideerd met behulp van twee specifieke commerciële RIMS (zie tabel 3). Het protocol mag echter niet verschillen bij het gebruik van andere RIMS (commercieel of zelfgemaakt).</li>
	<li>Houd het weefsel nog 24 uur op RT of totdat de oplossing volledig in evenwicht is, d.w.z. wanneer het weefsel transparant wordt en de oplossing geen zichtbare rimpelingen meer bevat (figuur 1M).</li>
	<li>Als het weefsel transparant is, gaat u verder met de kamervoorbereiding. Als het weefsel op dit punt wit wordt in plaats van transparant (als gevolg van aggregaten van resterende SDS-moleculen), reinigt u het monster opnieuw door stap 2.9 en 2.10 te herhalen en brengt u het weefsel gedurende enkele dagen over naar CS2 (stap 2.8), gevolgd door alle stappen tot stap 2.15.</li>
</ol>3. Kamervoorbereiding
OPMERKING: Elk monster vereist een dia met een beeldvormingskamer waarin het monster zal worden geplaatst.
<ol><li>Plaats het monster in het midden van de dia.</li>
	<li>Maak met behulp van een heet lijmpistool muren aan de randen van de dia, bijna net zo hoog als het weefsel. Zorg ervoor dat u een kleine opening (ongeveer 5 mm) laat op een van de hoeken (figuur 2A,B).</li>
	<li>Breng 1-2 druppels van de RIMS aan op het monster om het bovenoppervlak vochtig te houden en te voorkomen dat er bubbels ontstaan tussen de coverslip en het weefsel.</li>
	<li>Voeg onmiddellijk na het aanbrengen van de RIMS-druppels de laatste laag hete lijm toe aan de wanden (zodat ze de hoogte van de hersenen / plak bereiken) en ga onmiddellijk (terwijl de hete lijm nog vloeibaar is) naar stap 3.5.</li>
	<li>Sluit de bovenkant af met een afdekplaat en plaats deze zo gelijkmatig mogelijk op de bovenkant van de nog warme hete lijmlaag (figuur 2C).</li>
	<li>Vul de kamer met de RIMS door de opening in de hete lijmwanden (figuur 2D,E).</li>
	<li>Sluit de opening met hete lijm. Laat geen lucht binnen (figuur 2F).</li>
	<li>Als de hete lijmwanden verder reiken dan de randen van de dia, snijdt u de uitschuivende randen (figuur 2G).</li>
	<li>Als het doel dat wordt gebruikt voor beeldvorming is ondergedompeld, voegt u nog eens 2-3 mm lijm toe aan de wanden boven de afdekplaat, zodat de onderdompelingsoplossing langer meegaat (figuur 2H).</li>
</ol>4. Beeldvorming (confocaal of twee-foton)
<ol><li>Controleer of het podium de kamer kan vasthouden, omdat de dikte van de kamer enkele millimeters kan bereiken. OPMERKING: De confocale microscoop (zie de tabel met materialen) die in dit protocol wordt gebruikt, is bijvoorbeeld uitgerust met verschillende fasen (bijvoorbeeld cirkelvormig, rechthoekig). Welke fase ook wordt gekozen om de kamer vast te houden, is niet relevant zolang de parameters overeenkomen met de kamergroottes.</li>
	<li>Werk met een doel met een voldoende werkafstand, d.w.z. een minimale werkafstand ≥3 mm, omdat het hersengebied van belang een paar millimeter diep kan zijn en de coverslip mogelijk niet volledig recht is zoals deze handmatig is geplaatst. OPMERKING: Als demonstratie werden de resultaten in figuur 1, video 1 en video 2 verkregen onder een microscoop met twee fotonen met behulp van een wateronderdompelingsobjectief van 16x met een werkafstand van 3 mm en een vergroting van 2,4 om een gezichtsveld van 652 x 483 μm en een z-stack met intervallen van 0,937 μm tussen de vlakken te verkrijgen.</li>
	<li>Voer beeldvorming met meerdere gebieden uit, wat enkele uren of zelfs dagen kan duren. Zorg ervoor dat er voldoende vrije opslagruimte op de computer is, omdat de grootte van elk beeld kan oplopen tot tientallen gigabits. OPMERKING: CLARITY-beeldvorming kan resulteren in aanzienlijk meer beeldsecties in de diepte. Daarom moeten de intensiteiten die worden gebruikt om de expressie vast te leggen relatief laag zijn om overexpressie tijdens de beeldsomming te voorkomen.</li>
	<li>Voor onderdompelingsdoeleinden controleert u de vloeistof routinematig tijdens het afbeelden en vult u deze indien nodig aan met extra vloeistof. OPMERKING: Tijdens de beeldvorming van de gegevens in video 3 werd elke 6-8 uur water aan het oppervlak van de kamer toegevoegd om verdamping tegen te gaan.</li>
	<li>Nadat het beeld is verkregen, bekijkt en analyseert u het met behulp van verschillende softwarepakketten. OPMERKING: Aanbevolen software omvat Imaris en SyGlass voor zowel visualisatie als analyse. De precieze pijplijn voor geoptimaliseerde reconstructie van astrocyten met behulp van Imaris-software is eerder beschreven9. Kortom, de Imaris-kenmerken die in deze studie werden gebruikt, waren filamenten om celstructuren volledig te reconstrueren en vlekken om de positie in de ruimte van alle somata te extraheren.</li>
</ol>

<ol><li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+astrocytes+process+and+control+synaptic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li>
<li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li>
<li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema%2C+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573(2021).</li>
<li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li>
<li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li>
<li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+in+memory+function%3A+pioneering+findings+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li>
<li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li>
<li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915(2016).</li>
<li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit-specialized+astrocytes%3A+transcriptomic%2C+proteomic%2C+morphological%2C+and+functional+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Weefselverwijderingsmethoden vormen een revolutionair hulpmiddel in hersenonderzoek en nodigen vragen uit die voorheen niet konden worden gesteld. Van het richten op de eigenschappen van een kleine groep cellen, een enkele cel of zelfs een enkele synaps, maakt CLARITY nu het richten van totale celpopulaties of connectiviteitsfuncties op lange afstand mogelijk door relevante fluoroforen te gebruiken.
De uitkomst van de combinatie fluorofoorexpressie en CLARITY-procedure is niet binair; veel fac...

In de afgelopen jaren is de kennis van astrocytenfunctie en hoe ze interageren met neuronale circuits dramatisch toegenomen. Astrocyten kunnen de plasticiteitbeïnvloeden 1,2, helpen bij neuronaal postinjuryherstel 3,4 en zelfs de novo neuronale potentiëring induceren, waarbij recente studies het belang van astrocyten in geheugenverwerving en beloning aantonen, voorheen beschouwd als puur neuronale functies 5,6,7 . Een kenmerk van bijzonder belang in astrocytenonderzoek is de ruimtelijke ordening van de cellen, die unieke ruimtelijke organisaties in de hippocampus en andere hersenstructuren behouden 8,9,10. In tegenstelling tot de neuronale dendrieten die zich verstrengelen tussen cel somata, bewonen hippocampale astrocyten visueel te onderscheiden gebieden met lichte overlap tussen hun processen, waardoor verschillende domeinenontstaan 8,11,12,13. Het bewijs dat de deelname van astrocyten aan neuronale circuits ondersteunt niet het gebrek aan gedetailleerde anatomische beschrijving van dergelijke populaties en de neuronen in hun domeinen14.
Virale vectortransductieprocedures, samen met transgene dieren (TG), zijn gepopulariseerd als een toolset om hersenstructuren, functies en celinteracties te onderzoeken15,16. Het gebruik van verschillende promotors maakt het mogelijk om specifieke cellen te richten op basis van hun genetische eigenschappen, activeringsniveaus17,18 of projectiedoelen. Verschillende virussen kunnen verschillende gekleurde fluoroforen uitdrukken in verschillende populaties. Een virus kan worden gecombineerd met de endogene expressie van fluoroforen in TG, of TG-dieren kunnen worden gebruikt zonder dat er virussen nodig zijn. Deze technieken worden veel gebruikt voor neuronale markering en sommige laboratoria zijn ze gaan gebruiken met modificaties die gespecialiseerd zijn voor het richten op andere celtypen, zoals astrocyten 5,9,19.
De CLARITY-techniek, voor het eerst beschreven in 201320,21, maakt de studie van dikke hersenplakken mogelijk door de hele hersenen transparant te maken terwijl de microscopische structuren intact blijven. Door de combinatie van de twee methoden - virale vectortransductie en weefselverwijdering - is nu de mogelijkheid beschikbaar om de ruimtelijke interacties tussen verschillende celtypepopulaties te onderzoeken. De meeste astrocyten-neuron interactiestudies werden uitgevoerd op dunne hersenplakken, wat resulteerde in afbeeldingen van onvolledige astrocyten vanwege hun grote domeinen, waardoor het aantal geanalyseerde cellen radicaal werd beperkt. Het gebruik van de CLARITY-techniek maakt eencellige resolutiekarakterisering van celpopulaties in grootschalige volumes tegelijkertijd mogelijk. Het afbeelden van fluorescerend gelabelde celpopulaties in heldere hersenen levert geen synaptische resolutie op, maar maakt een grondige karakterisering van de ruimtelijke interacties tussen astrocyten en een verscheidenheid aan neuronale celtypen mogelijk.
Om die reden hebben we deze state-of-the-art technieken gebruikt om de eigenschappen van astrocyten in de dorsale CA1 te onderzoeken, waarbij we alle lamina (Stratum Radiatum, piramidale laag en Stratum Oriens) in beeld brengen. We hebben tienduizenden astrocyten gemeten (met virale penetrantie van >96%5), waarbij we de informatie van de hele astrocytische populatie rond CA1 hebben geanalyseerd. Met efficiënte penetrantie van de neuronale markers konden we de interacties registreren tussen de hele populatie van CA1-astrocyten en de vier soorten neuronale cellen- parvalbumine (PV), somatostatine (SST), VIP-remmende neuronen en exciterende piramidale cellen9.
Verschillende experimenten werden uitgevoerd met behulp van een combinatie van fluorescentie van TG-dieren en verschillend gekleurde virale vectoren (alle remmende cellen), terwijl anderen (exciterend) twee virale vectoren gebruikten die verschillende fluoroforen onder verschillende promotors tot expressie brachten9. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol, inclusief het taggen van de gewenste cellen in de hersenen, het transparant maken van de hersenen met behulp van een aangepaste CLARITY-procedure, evenals beeldvorming en analyse van volledige hersenstructuren, met behulp van verschillende procedures en software.

<table><tbody><tr><td>AAV1-GFAP::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>viraal vector gebruikt om astrocyten te detecteren</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>viraal vector gebruikt om neuronen te detecteren</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>viraal vector gebruikt om neuronale kernen te detecteren</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>viraal vector gebruikt om neuronen te detecteren</td></tr><tr><td>Acryamide (40%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide (2%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Borzuur</td><td>Sigma</td><td>#B7901</td><td>Moleculaire massa - 61,83 g/mol</td></tr><tr><td>Confocale microscoop, scannen, FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td>4x objectief (UPlanSApo, 0,16 NA)</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane, UK</td><td></td><td>Een software die 3D-analyse van beelden mogelijk maakt</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S5881</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA 4%</td><td>EMS</td><td>#15710</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear</td><td>SunJin lab</td><td>#RC147002</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear CS</td><td>SunJin lab</td><td>#RCCS002</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>#L3771</td><td></td></tr><tr><td>SyGlass software</td><td></td><td></td><td>Een software die 3D-analyse van beelden mogelijk maakt met behulp van virtual reality</td></tr><tr><td>Tris base 1 M</td><td>Bio-rad</td><td>#002009239100</td><td>Moleculaire massa - 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ChemCruz</td><td>#sc-29112A</td><td></td></tr><tr><td>Twee foton microscoop</td><td>Neurolabware</td><td></td><td>Ti:saffier laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP foto-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40), bandpass filter (Semrock), water immersie 16x objectief (Nikon, 0,8 NA)&nbsp;</td></tr><tr><td>VA-044 Initiator</td><td>Wako</td><td>#011-19365</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Het combineren van virale vectortransductie en weefselzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd verschillende soorten hersencellen en hun interacties te onderzoeken. Virale vectortransductie maakt het mogelijk om verschillende celtypen in verschillende fluorescentiekleuren binnen hetzelfde weefsel te markeren. Cellen kunnen genetisch worden geïdentificeerd door activiteit of projectie. Met behulp van een aangepast CLARITY-protocol is de potentiële steekproefomvang van astrocyten en neuronen met 2-3 ordes van grootte gegroeid. Het gebruik van CLARITY maakt het mogelijk om volledige astrocyten, die te groot zijn om in hun geheel in plakjes te passen, en het onderzoek van de somata met al hun processen mogelijk. Daarnaast biedt het de mogelijkheid om de ruimtelijke interactie tussen astrocyten en verschillende neuronale celtypen te onderzoeken, namelijk het aantal piramidale neuronen in elk astrocytisch domein of de nabijheid tussen astrocyten en specifieke remmende neuronpopulaties. Dit artikel beschrijft in detail hoe deze methoden moeten worden toegepast.

Succesvolle opruiming van dikke hersenweefselplakken resulteert in een nieuwe reeks vragen die kunnen worden gesteld met betrekking tot de eigenschappen van grote celpopulaties in tegenstelling tot de eigenschappen van afzonderlijke cellen of naburige groepen cellen. Om succesvolle resultaten te bereiken, moet men zich strikt houden aan het CLARITY-protocol, omdat er een breed scala aan parameters is waarmee rekening moet worden gehouden om de variantie tussen monsters te verminderen (bijv. Percentage van de helderheid, ...

Het combineren van virale vectortransductie en hersenzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd een groot aantal neuronen en astrocyten te onderzoeken.

Onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

De helderheidstechniek die voor het eerst werd beschreven in 2013 is een weefselverwijderingstechniek die de bemonstering van grotere hoeveelheden cellen, bloedvaten, dus zelfs eiwitten zoals een enkele celresolutie in dikke hersenplakken mogelijk maakt. Deze techniek maakt de studie van intacte microscopische structuren mogelijk door het hele brein transparant te maken. Dit protocol is een eenvoudige chip en een eenvoudige pijplijn voor het wissen van weefsel.Deze techniek kan worden gebruikt voor het opruimen van weefsels in andere systemen naast hersenweefsels. Om te beginnen sluit u de buis en dop af met parafilm en prikt u twee gaten in de dop. Breng vervolgens stikstofgas uit de tank over met behulp van een flexibele buis met een inwendige diameter van vijf millimeter en een naald van 19 gauge die aan het uiteinde is aangesloten.Begin met ontgassen door de buis aan de buis te bevestigen en gasuitwisseling gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur toe te staan. Maak de pijp los en sluit de gaten onmiddellijk af met modelleerklei. Breng vervolgens de ontgassingsgedichte buizen gedurende 3 1/2 uur over in een bad van 37 graden Celsius om de hydrogeloplossing te polymeriseren.Haal de hersenen uit de buis. Verwijder met behulp van laboratoriumdoekjes de gepolymeriseerde hydrogel rond de hersenen en zorg ervoor dat er geen resterende gel aan het oppervlak van de hersenen blijft vastzitten. Verdeel de hersenen in dikke plakken die alle interessegebieden bevatten.Doe de plakjes in de eerste opruimoplossing en incubeer bij 37 graden Celsius met rotatie bij 70 RPM gedurende 24 uur. Bereid ondertussen een geperforeerde buis voor om de hersenen te plaatsen. Doe de geperforeerde buis in een bekerglas gevuld met tweede reinigingsoplossing op een roerinrichting.Plaats vervolgens de hersenen in het bekerglas en sluit het af met aluminiumfolie om bleken te voorkomen. Nadat het weefsel transparant is geworden, brengen de hersenen over in PBST in incubaat bij 37 graden Celsius met rotatie bij 70 RPM gedurende 24 uur. Vervang de oplossing door verse PBST en zet de incubatie nog 24 uur voort.Breng vervolgens de hersenen over naar PBS bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Verwijder na 24 uur de hersenen van PBS en breng deze over naar een refractieve index matching oplossing. Incubeer de hersenen 's nachts bij 37 graden Celsius.Plaats het monster eerst in het midden van de dia. Maak met behulp van hete lijm muren aan de randen van de dia, bijna net zo hoog als het weefsel. Zorg ervoor dat je een kleine opening laat op een van de hoeken.Naarmate de hete lijmlaag de hoogte van de hersenschijf nadert, brengt u één tot twee druppels van de brekingsindex-overeenkomende oplossing op het monster aan om het bovenoppervlak te bevochtigen en bubbelvorming te voorkomen. Terwijl de hete lijm nog vloeibaar is, sluit u de bovenkant af met een afdekslip, plaatst u deze zo gelijkmatig mogelijk en vult u de kamer met de oplossing voor brekingsindex. Sluit de opening met hete lijm.Als de hete lijmwanden verder reiken dan de randen van de dia, snijdt u de uitschuivende randen. Als een olie-onderdompelingsobjectief wordt gebruikt voor beeldvorming, voegt u nog eens twee tot drie millimeter lijm toe aan de wanden boven de afdekslip om de dompeloplossing te behouden. Na dit protocol wordt het hersenweefsel opgeruimd.Duidelijke hersenplakken werden bereid met behulp van dit protocol om populaties van astrocyten en neuronen in het CA1-gebied van de hippocampus van muizen te visualiseren. Alle astrocyten drukten tdTomato uit en exciterende neuronen drukten H2B-GFP uit in hun kernen. De kamer die was voorbereid voor het geklaarde weefsel was optimaal voor beeldvorming onder een twee foton of confocale microscoop.Met behulp van een microscoop van twee fotonen werden meer dan 300 astrocyten waargenomen in een vrijgemaakt gedeelte van het CA1-gebied van de hippocampus van de muis. De hippocampale astrocyten in rode en piramidale cellen, somata in groen waren zichtbaar en dik, transparant weefsel dat de ruimtelijke nabijheid tussen deze twee celtypen vertegenwoordigde. Met behulp van een scanning laser confocale microscoop werden axonale bundels van exciterende neuronen over een hele hemisfeer getraceerd.Groene bundels werden getraceerd van de dorsale hippocampus naar de super mamillaire lichamen. De rode bundels werden getraceerd van de mamillaire lichamen naar hun oorsprong bij de vent hippocampus. Factoren, zoals temperatuur, concentraties en incubatietijd beïnvloedden de uitkomst van de duidelijkheidsprocedure.Daarom is nauwkeurigheid in elke stap van het protocol van vitaal belang voor het succes van het bereiken van helder weefsel. Met behulp van deze techniek meten we de afstanden tussen neuronen en astrocyten in verschillende hersenstructuren. Dit protocol maakte analyse van twee tot drie ordes van grootte meer cellen mogelijk dan in eerdere studies.

investigation-spatial-interaction-between-astrocytes-neurons-cleared

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

This video illustrates a method for establishing an indirect neuron-astrocyte co-culture using a compartmentalized approach. In this setup, neurons and astrocytes are spatially separated but share a conditioned medium. Neurotrophic factors released by astrocytes promote neuron differentiation and the formation of synaptic connections, suggesting neuron-glia interactions.

An Indirect Neuron-Astrocyte Co-Culture Technique for Studying Neuron-Glia Interactions

Source: Refaeli, R., et al., Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains. J. Vis. Exp. (2022) The video demonstrates the preparation of a chamber and the neuroimaging of cleared mouse hippocampal tissue using two-photon microscopy to visualize the spatial interactions between fluorescently labeled astrocytes and excitatory neurons.

Two-Photon Microscopy of Astrocytes and Excitatory Neurons in a Cleared Mouse Hippocampal Tissue

Astrocyten in het CZS veranderen hun functionele en structurele eigenschappen als reactie op schadelijke stimuli. Dit rapport presenteert een protocol voor de beoordeling van de driedimensionale morfologie van astrocyten in zieke toestanden of na therapeutische interventies.

Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes

Dit protocol beschrijft de indirecte neuron-astrocyten co-cultuur voor verzuilde analyse van neuron-glia interacties.

De indirecte Neuron-astrocyten Coculture Assay: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up voor het gedetailleerd onderzoek van het neuron-glia interacties

Wij demonstreren de ontwikkeling van zelf geassembleerde, driedimensionale bundels van lengterichting uitgelijnde astrocytic waarin en processen binnen het omhulsel van een roman biomaterial. Deze "levende steigers", het tentoonstellen van micron-schaal diameter nog uitbreiding centimeter lengte, kan dienen als proefnetwerken neurologische mechanismen bestuderen of vergemakkelijken van neuroregeneration door leiding neuronale migratie en/of axonale ontworpen vastloper.

Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de organisatie van de astrocytic netwerken. De beschreven methode minimaliseert bias om beschrijvende maatregelen van deze netwerken zoals cellen, grootte, ruimte en positie binnen een kern. Anisotropie is beoordeeld met een vectoriële analyse.

Analyseren van de grootte, de vorm en de directionaliteit van netwerken van gekoppelde astrocyten

De beschreven pijplijn is ontworpen voor de segmentatie van elektronenmicroscopie datasets groter dan gigabytes, om hele celmorfologieën te extraheren. Zodra de cellen zijn gereconstrueerd in 3D, kan aangepaste software die is ontworpen rond individuele behoeften worden gebruikt om een kwalitatieve en kwantitatieve analyse rechtstreeks in 3D uit te voeren, ook met behulp van Virtual Reality om de zicht occlusie te overwinnen.

Een methode voor 3D reconstructie en Virtual Reality analyse van gliale en neuronale cellen

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Dit protocol beschrijft methoden voor het doorsnijden, kleuren en afbeelden van vrij zwevende weefselsecties van de muizenhersenen, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van de analyse van het astrocytengebiedvolume en astrocytengebied overlap of tegels.

Analyse van astrocytengebiedvolume en tegels in dikke vrij zwevende weefselsecties

Ontdek de CLARITY-methode voor het visualiseren van astrocyten en neuronen in de hippocampus van muizen. Deze techniek maakt hersenweefsel transparant voor celresolutiebeeldvorming en helpt onderzoekers ruimtelijke relaties tussen cellen te bestuderen.

Onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen

Meer video's verkennen