Onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen

De helderheidstechniek die voor het eerst werd beschreven in 2013 is een weefselverwijderingstechniek die de bemonstering van grotere hoeveelheden cellen, bloedvaten, dus zelfs eiwitten zoals een enkele celresolutie in dikke hersenplakken mogelijk maakt. Deze techniek maakt de studie van intacte microscopische structuren mogelijk door het hele brein transparant te maken. Dit protocol is een eenvoudige chip en een eenvoudige pijplijn voor het wissen van weefsel.

Deze techniek kan worden gebruikt voor het opruimen van weefsels in andere systemen naast hersenweefsels. Om te beginnen sluit u de buis en dop af met parafilm en prikt u twee gaten in de dop. Breng vervolgens stikstofgas uit de tank over met behulp van een flexibele buis met een inwendige diameter van vijf millimeter en een naald van 19 gauge die aan het uiteinde is aangesloten.

Begin met ontgassen door de buis aan de buis te bevestigen en gasuitwisseling gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur toe te staan. Maak de pijp los en sluit de gaten onmiddellijk af met modelleerklei. Breng vervolgens de ontgassingsgedichte buizen gedurende 3 1/2 uur over in een bad van 37 graden Celsius om de hydrogeloplossing te polymeriseren.

Haal de hersenen uit de buis. Verwijder met behulp van laboratoriumdoekjes de gepolymeriseerde hydrogel rond de hersenen en zorg ervoor dat er geen resterende gel aan het oppervlak van de hersenen blijft vastzitten. Verdeel de hersenen in dikke plakken die alle interessegebieden bevatten.

Doe de plakjes in de eerste opruimoplossing en incubeer bij 37 graden Celsius met rotatie bij 70 RPM gedurende 24 uur. Bereid ondertussen een geperforeerde buis voor om de hersenen te plaatsen. Doe de geperforeerde buis in een bekerglas gevuld met tweede reinigingsoplossing op een roerinrichting.

Plaats vervolgens de hersenen in het bekerglas en sluit het af met aluminiumfolie om bleken te voorkomen. Nadat het weefsel transparant is geworden, brengen de hersenen over in PBST in incubaat bij 37 graden Celsius met rotatie bij 70 RPM gedurende 24 uur. Vervang de oplossing door verse PBST en zet de incubatie nog 24 uur voort.

Breng vervolgens de hersenen over naar PBS bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Verwijder na 24 uur de hersenen van PBS en breng deze over naar een refractieve index matching oplossing. Incubeer de hersenen 's nachts bij 37 graden Celsius.

Plaats het monster eerst in het midden van de dia. Maak met behulp van hete lijm muren aan de randen van de dia, bijna net zo hoog als het weefsel. Zorg ervoor dat je een kleine opening laat op een van de hoeken.

Naarmate de hete lijmlaag de hoogte van de hersenschijf nadert, brengt u één tot twee druppels van de brekingsindex-overeenkomende oplossing op het monster aan om het bovenoppervlak te bevochtigen en bubbelvorming te voorkomen. Terwijl de hete lijm nog vloeibaar is, sluit u de bovenkant af met een afdekslip, plaatst u deze zo gelijkmatig mogelijk en vult u de kamer met de oplossing voor brekingsindex. Sluit de opening met hete lijm.

Als de hete lijmwanden verder reiken dan de randen van de dia, snijdt u de uitschuivende randen. Als een olie-onderdompelingsobjectief wordt gebruikt voor beeldvorming, voegt u nog eens twee tot drie millimeter lijm toe aan de wanden boven de afdekslip om de dompeloplossing te behouden. Na dit protocol wordt het hersenweefsel opgeruimd.

Duidelijke hersenplakken werden bereid met behulp van dit protocol om populaties van astrocyten en neuronen in het CA1-gebied van de hippocampus van muizen te visualiseren. Alle astrocyten drukten tdTomato uit en exciterende neuronen drukten H2B-GFP uit in hun kernen. De kamer die was voorbereid voor het geklaarde weefsel was optimaal voor beeldvorming onder een twee foton of confocale microscoop.

Met behulp van een microscoop van twee fotonen werden meer dan 300 astrocyten waargenomen in een vrijgemaakt gedeelte van het CA1-gebied van de hippocampus van de muis. De hippocampale astrocyten in rode en piramidale cellen, somata in groen waren zichtbaar en dik, transparant weefsel dat de ruimtelijke nabijheid tussen deze twee celtypen vertegenwoordigde. Met behulp van een scanning laser confocale microscoop werden axonale bundels van exciterende neuronen over een hele hemisfeer getraceerd.

Groene bundels werden getraceerd van de dorsale hippocampus naar de super mamillaire lichamen. De rode bundels werden getraceerd van de mamillaire lichamen naar hun oorsprong bij de vent hippocampus. Factoren, zoals temperatuur, concentraties en incubatietijd beïnvloedden de uitkomst van de duidelijkheidsprocedure.

Daarom is nauwkeurigheid in elke stap van het protocol van vitaal belang voor het succes van het bereiken van helder weefsel. Met behulp van deze techniek meten we de afstanden tussen neuronen en astrocyten in verschillende hersenstructuren. Dit protocol maakte analyse van twee tot drie ordes van grootte meer cellen mogelijk dan in eerdere studies.