Name: Het opzetten van menselijke longorganoïden en proximale differentiatie om volwassen luchtwegorganoïden te genereren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer hoe je menselijke longorganoïden opzet uit primair longweefsel en deze differentieert tot volwassen luchtwegorganoïden. Deze methode biedt een waardevol model voor onderzoek naar luchtwegbiologie en ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken het Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, voor hulp bij confocale beeldvorming en flowcytometrie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van het Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) van het Food and Health Bureau; Algemeen Fonds voor Onderzoek (GRF, 17105420) van de Raad voor Onderzoeksbeurzen; en Health@InnoHK, Innovation and Technology Commission, de regering van de speciale administratieve regio Hongkong.

Alle experimenten met menselijke weefsels die hierin worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de University of Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 en UW21-695). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten vóór weefselverzameling.
1. Afleiding van menselijke longorganoïde
<ol><li>Voorbereiding van experimenteel materiaal<ol>
<li>Bereid basaal medium door geavanceerd DMEM / F12-medium aan te vullen met 2 mM glutamine, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine.</li>
		<li>Bereid humaan longorganoïde expansiemedium voor door basaal medium aan te vullen met 10% R-spondin 1 geconditioneerd medium, 10% Noggin geconditioneerd medium, 1x B27 supplement, 1,25 mM N-acetylcysteïne, 10 mM nicotinamide, 5 μM van Y-27632, 500 nM van A-83-01, 1 μM van SB202190, 5 ng / ml fibroblst groeifactor (FGF) -7, 20 ng / ml FGF-10 en 100 μg / ml primocine (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Het R-spondin 1 en Noggin geconditioneerde medium kan worden vervangen door commercieel recombinant R-spondin 1 (500 ng/ml) en Noggin (100 ng/ml).</li>
		<li>Prewarm een 24-well suspensiecultuurplaat in een celkweekincubator. Gebruik een standaard celkweekincubator met 5% CO2 en bevochtigde atmosfeer bij 37 °C. Ontdooi keldermatrix in een koelkast van 4 °C. Houd de keldermatrix en het kweekmedium op ijs tijdens het experimenteren.</li>
	</ol></li>
	<li>Celisolatie uit menselijke longweefsels voor 3D organoïde cultuur<ol>
<li>Koop vers gereseceerde menselijke longweefsels van ongeveer 0,5 cm van patiënten die chirurgische resectie ondergaan als gevolg van verschillende ziekten. Transporteer de longweefsels in 30 ml basaal medium bij kamertemperatuur en verwerk zo snel mogelijk in een bioveiligheidskap.</li>
		<li>Gehakt longweefsels in kleine stukjes (0,5-1 mm) met een steriel scalpel in een celkweekschaal van 10 cm. Was tissuestukken met 10 ml koud basaal medium in een centrifugebuis van 15 ml, gevolgd door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 8 ml basaal medium aangevuld met collagenase in een eindconcentratie van 2 mg / ml. Verwerk de stukjes weefsel door de buis bij 120 rpm gedurende 30-40 min bij 37 °C te schudden.</li>
		<li>Pipetteer op en neer gedurende 20x om de verteerde weefselstukken te scheren met behulp van een serologische pipet van 10 ml. Stapel een zeef van 100 μm op een centrifugebuis van 50 ml en filter de suspensie.</li>
		<li>Herstel weefselstukken op de zeef met het basale medium en breng ze over naar een centrifugebuis van 15 ml, gevolgd door een tweede ronde van scheren en filteren. Extra shearing-filtering kan 1x-2x worden uitgevoerd om meer cellen te isoleren, vooral wanneer een klein stukje weefsel (bijvoorbeeld <0,5 cm) wordt verkregen.</li>
		<li>Voeg FBS toe aan de doorstroom met een eindconcentratie van 2% om de spijsvertering te beëindigen, gevolgd door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Resuspensie van de celpellet in 10 ml basaal medium, gevolgd door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.</li>
		<li>(Optioneel) Als er veel erytrocyten in de pellet worden gezien (geschat door de kleur van de pellet), resuspenseer de celpellet dan in 2 ml rode bloedcellysisbuffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 10 ml basaal medium toe aan de buis, gevolgd door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in koude keldermatrix en houd op ijs. Voeg 80-160 μL keldermatrix toe voor cellen die zijn teruggewonnen uit een longweefsel van ongeveer 0,5 cm; de hoeveelheid is voldoende om 2-4 druppels te zaaien.</li>
		<li>Doseer 40 μL suspensie aan elk putje van een voorverwarmde 24-wells ophangcultuurplaat. Incubeer de kweekplaat bij 37 °C gedurende 10-15 min. Laat de keldermatrix stollen tot een druppel.</li>
		<li>Voeg 500 μL menselijk longorganoïden expansiemedium aangevuld met 5 nM Heregulin beta-1 toe aan elke put en incubeer de plaat in een celkweekincubator.</li>
		<li>Ververs het medium om de 3 dagen. Verwijder het oude medium terwijl u de druppel intact houdt en voeg met voorzichtigheid een vers medium toe. Passeer de organoïden na incubatie gedurende 10-14 dagen. Gebruik Heregulin beta-1 alleen in de begincultuur vóór de eerste passage.</li>
		<li>Observeer de organoïden onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de organoïden niet zijn ingebed met een zeer hoge celdichtheid. Als een druppel desintegreert als gevolg van een te hoge celdichtheid, herstel en herinfundeer de organoïden en cellen met een hoger volume keldermatrix om meer druppels te maken met een lagere en wenselijke celdichtheid.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Uitbreiding van menselijke longorganoïden
<ol><li>Bereid een Pasteur-pipet door de punt van een Pasteur-pipet op een vlam te branden, zoals een Bunsen-brander, om de opening te verkleinen van 1,5 mm tot ongeveer 1,0 mm in diameter. Koel de pipetten af, gevolgd door autoclaveren om te steriliseren. Maak de pipetten nat met het basale medium om celaanhechting en verlies tijdens mechanisch scheren te voorkomen.</li>
	<li>Long organoïden passage met mechanische afschuiving<ol>
<li>Gebruik een tip van 1 ml en pipet op en neer om de druppels die hierboven zijn verkregen te breken. Breng vervolgens de organoïden samen met het medium over naar een centrifugebuis van 15 ml en pas het volume aan op 10 ml met koud basaal medium. Gooi het supernatant weg na centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C</li>
		<li>Was de organoïden nogmaals met 10 ml koud basaal medium. Resuspendeer de organoïden in 2 ml koud basaal medium. Pipetteer op en neer om de organoïden in kleine stukjes te scheren met een Pasteur pipet.</li>
		<li>Vul aan met basaal medium tot een totaal volume van 10 ml, gevolgd door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de organoïde fragmenten met koude keldermatrix voldoende om een 1:3 tot 1:5 expansie mogelijk te maken. Blijf op ijs.</li>
		<li>Plaats 40 μL organoïde suspensie in elk putje van een voorverwarmde 24-wells plaat. Incubeer de kweekplaat bij 37 °C gedurende 10-15 min. Laat de keldermatrix stollen.</li>
		<li>Voeg 500 μL longorganoïde expansiemedium toe aan elke put en incubeer in een celkweekincubator. Ververs het medium om de 3 dagen. Passeer de organoïden elke 2 weken met een verhouding van 1:3 tot 1:5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Long organoïden passage met trypsinisatie OPMERKING: Trypsinisatie heeft de voorkeur wanneer het moeilijk is om de longorganoïde in kleine stukjes te scheren met behulp van een Pasteur-pipet, of de grootte van de organoïden zeer variabel is, of de daaropvolgende experimenten organoïden van meer uniforme grootte vereisen.<ol>
<li>Oogst de longorganoïden zoals aangegeven in stap 2.2.1. Resuspendeer de organoïde in 1 ml dissociatie-enzym en incubeer in een waterbad van 37 °C gedurende 3-5 minuten.</li>
		<li>Voeg 1 ml basaal medium toe aan de buis. Schuif de organoïden mechanisch door de organoïden op en neer te pipetteren in kleine stukjes met behulp van een Pasteur-pipet. Controleer de grootte van organoïde stukken onder een microscoop bij 4x vergroting. Voeg vervolgens 40 μL FBS toe om de spijsvertering te beëindigen. OPMERKING: Bepaal de grootte van organoïde fragmenten onder de microscoop volgens de experimentele opstelling. Als een experiment meer organoïden of organoïden van meer uniforme grootte nodig heeft, schuif dan organoïden in kleinere stukken of zelfs enkele cellen. Daarna duurt het langer, waarschijnlijk 3 weken, voordat de organoïden klaar zijn voor experimenten.</li>
		<li>Vul aan met basaal medium tot een eindvolume van 10 ml, gevolgd door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de organoïde stukken in koude keldermatrix met een volume dat voldoende is om door te gaan met een verhouding van 1:5-1:10. Blijf op ijs.</li>
		<li>Plaats 40 μL organoïde suspensie in elk putje van een voorverwarmde 24-wells plaat. Incubeer de kweekplaat bij 37 °C gedurende 10-15 min. Laat de keldermatrix stollen.</li>
		<li>Vul aan met 500 μL long organoïde expansiemedium per put en incubeer in een celkweekincubator. Ververs het uitbreidingsmedium om de 3 dagen. Passeer de organoïden na 2-3 weken. OPMERKING: Ongeveer 100 organoïden zijn gemonteerd in een druppel van 40 μL van de keldermatrix. De longorganoïden groeien normaal gesproken beter met een relatief hoge celdichtheid. Herinfundeer de organoïden met een lagere celdichtheid als druppels desintegreren of de groeiende organoïden zich aan elkaar hechten vanwege de te hoge celdichtheid.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Proximale differentiatie om volwassen luchtwegorganoïden te genereren
<ol><li>Bereid proximaal differentiatiemedium (PD-medium) voor door het basale medium luchtvloeistofinterface aan te vullen met 1x luchtvloeistofinterfacesupplement, 1x luchtvloeistofinterfaceonderhoudssupplement, 4 μg/ml heparine, 1 μM hydrocortison, 10 μM Y-27632 en 10 μM DAPT (zie materiaaltabel).</li>
	<li>3D luchtweg organoïden<ol>
<li>Incubeer longorganoïden in het expansiemedium gedurende 7-10 dagen na het passeren via mechanisch scheren. Vervang het expansiemedium door het PD-medium. Incubeer de organoïden in het PD-medium gedurende 14 dagen in een celkweekincubator.</li>
		<li>Gooi het PD-medium in elk putje weg. Voeg cellysaatbuffer toe om de gedifferentieerde luchtwegorganoïde te oogsten voor RNA-extractie en detectie van cellulaire genexpressie door RT-qPCR-assay.</li>
		<li>U kunt de organoïden ook incuberen bij 37 °C gedurende 60 minuten na toevoeging van 10 mM EDTA om de organoïden in afzonderlijke cellen te disassociateren, gevolgd door flowcytometrieanalyse om celpopulaties te onderzoeken. De organoïden zijn klaar voor verschillende experimentele manipulaties.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2D luchtweg organoïde<ol>
<li>Bereid voldoende 3D-longorganoïden voor 2D-differentiatiecultuur voor. Een totaal van 1,3 x 105 en 4,5 x 105 cellen zijn vereist voor respectievelijk een 24-well permeable support insert en een 12-well permeable support insert.</li>
		<li>Nadat 3D-longorganoïden gedurende 2 weken in het expansiemedium zijn gegroeid, verteren de organoïden in enkele cellen en zaad in de 24-well en 12-well inserts om 2D-luchtwegorganoïden te genereren.</li>
		<li>Incubeer de inserts 's nachts met het basale medium in een celkweekincubator. Voeg respectievelijk 250 μL en 500 μL basaal medium toe in de bovenste en onderste kamer van een 24-well plaat. Voeg voor een 12-wellsplaat respectievelijk 500 μL en 1.000 μL basaal medium toe in de bovenste en onderste kamer.</li>
		<li>Oogst 3D-longorganoïden zoals beschreven in stap 2.2.1. Resuspendeer de organoïden met 1 ml dissociatie-enzym en incubeer gedurende 3-5 minuten in een waterbad van 37 °C.</li>
		<li>Voeg 1 ml basaal medium toe aan de buis. Pipetteer op en neer om de organoïden in enkele cellen te scheren met een Pasteur-pipet en controleer de cellen onder een microscoop. Voeg vervolgens 40 μL FBS toe om de spijsvertering te beëindigen.</li>
		<li>Filter de cellen door een zeef van 40 μm in een centrifugebuis van 50 ml. Breng de gefilterde celsuspensie over in een buis van 15 ml. Vul aan met basaal medium tot een totaal volume van 10 ml, gevolgd door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet, verzameld uit 24 druppels (40 μL), in 1-2,5 ml longorganoïde expansiemedium, afhankelijk van de celdichtheid in de druppels. Tel het aantal cellen met een celteller onder een microscoop. Stel de celconcentratie in op 1,3 x 106/ml (voor inzetstukken met 24 putten) of 9 x 105/ml (voor inzetstukken met 12 putten).</li>
		<li>Verwijder het basale medium uit de bovenste en onderste kamers. Voeg 500 μL en 1.000 μL expansiemedium toe in de onderste kamer van respectievelijk de insert met 24 putten en de insert met 12 putten. Zaad 100 μL en 500 μL celsuspensie bereid in stap 3.3.7 op de apicale kamer van respectievelijk de 24-well insert en 12-well insert.</li>
		<li>Incubeer gedurende 2 dagen in een celkweekincubator. Vervang het expansiemedium door het PD-medium in zowel de apicale als de onderste kamer van de platen. Incubeer de organoïden in celkweek incubator gedurende 14 dagen en ververs het PD-medium elke 3 dagen. OPMERKING: Mobiele trilharen zijn waarneembaar in de 3D- en 2D-organoïden onder een microscoop vanaf dag 7 na incubatie in het PD-medium. Na 14 dagen differentiatiecultuur in het PD-medium zijn de luchtwegorganoïden rijp voor verschillende experimentele manipulaties.</li>
		<li>Meet om de dag de transepitheel elektrische weerstand (TEER) met behulp van een meetsysteem voor elektrische weerstand volgens een standaardprotocol zoals beschreven in17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modelling+in+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li>
<li>Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</a> (2021).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098(2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt%2Fbeta-catenin+and+Wnt%2FPCP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li>
<li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li>
<li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li>
<li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li>
<li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+immunological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li>
<li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508(2021).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li>
<li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li>
</ol>

J. Z., C.L. en M.C.C. staan vermeld als uitvinders op het patent van luchtwegorganoïden (publicatienummer: US-2021-0207081-A1). De andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

De menselijke luchtwegen zijn bekleed met het luchtwegepitheel, ook bekend als het pseudostratified ciliated epithelium. De belangrijkste celtypen van het bovenste luchtwegepitheel zijn trilhaarcellen die de gecoördineerde beweging van hun apicale trilharen mogelijk maken om slijm en ingeademde deeltjes uit de luchtwegen te verdrijven, bokaalcellen die slijm produceren en afscheiden, en basale cellen die het keldermembraan bekleden en betrokken zijn bij regeneratie. In de kleine luchtweg zoals bronchiolen bevat het kubus...

Organoïden zijn een robuust en universeel hulpmiddel geworden voor in vitro modellering van orgaanontwikkeling en het bestuderen van biologie en ziekte. Wanneer gekweekt in een groeifactor-gedefinieerd kweekmedium, kunnen volwassen stamcellen (ASC) uit een verscheidenheid aan organen worden uitgebreid in 3-dimensie (3D) en zelf worden geassembleerd tot orgaanachtige cellulaire clusters die zijn samengesteld uit meerdere celtypen, organoïden genoemd. Het laboratorium van Clevers rapporteerde de afleiding van de eerste asc-afgeleide organoïde, human intestinal organoid, in 2009 1,2. Daarna zijn asc-afgeleide organoïden vastgesteld voor een verscheidenheid aan menselijke organen en weefsels, waaronder prostaat 3,4, lever 5,6, maag 7,8,9, pancreas10, borstklier11 en long 12,13 . Deze van ASC afgeleide organoïden behielden de kritische cellulaire, structurele en functionele eigenschappen van het inheemse orgaan en behielden genetische en fenotypische stabiliteit in de expansiecultuur op lange termijn14,15.
Organoïden kunnen ook worden afgeleid van pluripotente stamcellen (PSC), waaronder embryonale stamcellen (ES) en geïnduceerde pluripotente stam (iPS) cel16. Terwijl PSC-afgeleide organoïden de mechanismen van orgaanontwikkeling voor hun oprichting exploiteren, kunnen ASC's worden gedwongen om organoïden te vormen door omstandigheden te herbouwen die de stamcelniche nabootsen tijdens fysiologische weefselzelfvernieuwing of weefselherstel. PSC-afgeleide organoïden zijn gunstige modellen om ontwikkeling en organogenese te onderzoeken, hoewel ze niet in staat zijn om het vergelijkbare rijpingsniveau van ASC-afgeleide organoïden te bereiken. De foetale rijpingsstatus van PSC-afgeleide organoïden en de complexiteit voor het vaststellen van deze organoïden verhinderen aanzienlijk hun brede toepassingen voor het bestuderen van biologie en pathologie in volwassen weefsels.
De menselijke luchtwegen, van neus tot terminale bronchiole, zijn bekleed met het luchtwegepitheel, ook wel het pseudostratified trilhaarepitheel genoemd, dat bestaat uit vier belangrijke celtypen, d.w.z. trilhaarcel, bokaalcel, basale cel en clubcel. We hebben de ASC-afgeleide menselijke longorganoïde uit menselijke longweefsels vastgesteld in samenwerking met Clevers ' lab12,13. Deze longorganoïden worden gedurende meer dan een jaar achtereenvolgens in het expansiemedium geëxpandeerd; de precieze duur varieert tussen de verschillende organoïde lijnen die van verschillende donoren zijn verkregen. In vergelijking met het inheemse luchtwegepitheel zijn deze langdurig uitbreidbare longorganoïden echter niet volwassen genoeg omdat trilhaarcellen, de belangrijkste celpopulatie in de menselijke luchtwegen, ondervertegenwoordigd zijn in deze longorganoïden. Zo ontwikkelden we een proximaal differentiatieprotocol en genereerden we 3D- en 2D-luchtwegorganoïden die morfologisch en functioneel fenoscopie van het luchtwegepitheel tot een bijna-fysiologisch niveau.
Hier bieden we een videoprotocol om menselijke longorganoïden af te leiden uit de primaire longweefsels, de longorganoïden uit te breiden en proximale differentiatie te induceren om 3D- en 2D-luchtwegorganoïden te genereren.

<table><tbody><tr><td>Reagents voor long organoïd cultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>-</td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500nM</td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td><td>Trevigen</td><td>3533-010-0</td><td>70-80%</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamine)</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Heregulin &beta;-1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>N-Acetylcysteïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin (conditioneel medium)</td><td>zelfgemaakt</td><td>-</td><td>10x</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>1x</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rspondin1 (conditioneel medium)</td><td>zelfgemaakt</td><td>-</td><td>10x</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>1 &micro;M</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &micro;M</td></tr><tr><td>Proximaal differentiatiemedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris</td><td>2634</td><td>10 &micro;M</td></tr><tr><td>Heparine oplossing</td><td>StemCell Technology</td><td>7980</td><td>4 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Hydrocortison stockoplossing</td><td>StemCell Technology</td><td>7925</td><td>1 &micro;M</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 10X supplement</td><td></td><td></td><td>air liquid interface supplement</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI basaal medium</td><td>StemCell Technology</td><td>05001</td><td>air liquid interface basaal medium</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI onderhoudssupplement</td><td></td><td></td><td>air liquid interface onderhoudssupplement</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>10 &micro;M</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskast</td><td>Baker</td><td>1-800-992-2537</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss LSM 780 of 800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>confocale microscoop</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>42093483</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-microscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31SF</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5418BG040397</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetteerder</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN black of ZEN blue software</td><td>Zeiss</td><td></td><td>analysesoftware</td></tr><tr><td>Verbruiksartikelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12mm Trans-well</td><td>StemCell Technology</td><td>#38023</td><td></td></tr><tr><td>12-well celkweekplaat</td><td>Cellstar</td><td>665970</td><td></td></tr><tr><td>15- en 50 ml kegelbuisjes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L6BF5Z8118</td><td></td></tr><tr><td>24-well celkweekplaat</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6.5mm Trans-well</td><td>StemCell Technology</td><td>#38024</td><td></td></tr><tr><td>Medische spuitfiltereenheid, 0,22 &micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Microfugebuisjes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetpunten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TFLR140-200-Q21190531</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipet glas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-378893</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten(5ml, 10ml, 25ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BA08003, 08004, 08005</td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Cytokeratin 5</td><td>Abcam</td><td>ab128190</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-FOX J1</td><td>Invitrogen</td><td>14-9965-82</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Mucin 5AC</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-&beta;-tubulin 4</td><td>Sigma</td><td>T7941</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-p63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-Uteroglobin/CC-10</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB4218-SP</td><td></td></tr><tr><td>Andere reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217701</td><td>dissociatie-enzym</td></tr></tbody></table>

het opzetten van menselijke longorganoïden en proximale differentiatie om volwassen luchtwegorganoïden te genereren

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

Het ontbreken van een robuust in vitro model van het menselijke respiratoire epitheel belemmert het begrip van de biologie en pathologie van het ademhalingssysteem. We beschrijven een gedefinieerd protocol om menselijke longorganoïden af te leiden van volwassen stamcellen in het longweefsel en proximale differentiatie te induceren om volwassen luchtwegorganoïden te genereren. De longorganoïden worden vervolgens achtereenvolgens gedurende meer dan 1 jaar met hoge stabiliteit uitgebreid, terwijl de gedifferentieerde luchtwegorganoïden worden gebruikt om morfologisch en functioneel menselijk luchtwegepitheel te simuleren tot een bijna fysiologisch niveau. Zo stellen we een robuust organoïde model van het menselijke luchtwegepitheel vast. De langdurige expansie van longorganoïden en gedifferentieerde luchtwegorganoïden genereert een stabiele en hernieuwbare bron, waardoor wetenschappers de menselijke luchtwegepitheelcellen in kweekschotels kunnen reconstrueren en uitbreiden. Het menselijke longorganoïde systeem biedt een uniek en fysiologisch actief in vitro model voor verschillende toepassingen, waaronder het bestuderen van virus-gastheer interactie, medicijntesten en ziektemodellering.

Dit protocol maakt de afleiding van menselijke longorganoïden met een hoog slagingspercentage mogelijk. Vers menselijk longweefsel wordt in kleine stukjes gehakt en vervolgens afgebroken met collagenase. De resulterende enkele cellen zijn ingebed in de keldermatrix en geïncubeerd in het longorganoïde expansiemedium aangevuld met een cocktail van nichefactoren voor de uitgroei van epitheelstamcellen (stap 1.1.2). Figuur 1 toont de microfoto van vers geïsoleerde longcellen ingebed in gereducee...

Het protocol presenteert een methode om menselijke longorganoïden af te leiden uit primaire longweefsels, de longorganoïden uit te breiden en proximale differentiatie te induceren om 3D- en 2D-luchtwegorganoïden te genereren die het menselijke luchtwegepitheel getrouw fenokopie.

Het opzetten van menselijke longorganoïden en proximale differentiatie om volwassen luchtwegorganoïden te genereren

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

We introduceren een methode om de organoïde cultuur van menselijk luchtwegepitheel in kweekplaten vast te stellen. We leiden menselijke longorganoïde rechtstreeks af uit primaire longweefsels met een hoge efficiëntie. De afgeleide menselijke longorganoïde zijn stabiel uitgebreid gedurende meer dan een jaar, en een proximaal differentiatieprotocol maakt het mogelijk om volwassen luchtwegorganoïden te genereren die het menselijke luchtwegepitheel getrouw kunnen simuleren tot een bijna fysiologisch niveau.Daarom stelt het kweeksysteem wetenschappers in staat om het menselijke luchtwegepitheel in cultuurplaten te reconstrueren en uit te breiden. Man Chun Chiu en Yifei Yu, promovendi in ons lab Om de celisolatie van menselijke longweefsels voor 3D organoïde cultuur te beginnen, gehakt de longweefsels in stukjes van één millimeter met een steriel scalpel en was de weefselstukken met 10 milliliter koud basaal medium. Centrifugeer de weefsels op 400 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg voordat de pellet wordt geresuspendeerd in acht milliliter basaal medium aangevuld met collagenase in een uiteindelijke concentratie van twee milligram per milliliter.Verwerk vervolgens de stukjes weefsel door de buis gedurende 30 tot 40 minuten op 37 graden Celsius op 120 RPM te schudden. Pipet na de spijsvertering 20 keer op en neer met een serologische pipet van 10 milliliter om de verteerde weefselstukken te scheren. Filter vervolgens de suspensie met een zeef van 100 micron in een buis van 50 milliliter.Herstel en breng de weefselstukken van de zeef over naar een centrifugebuis van 15 milliliter met het basale medium. Om de spijsvertering te beëindigen, voegt u foetaal runderserum toe aan de doorstroom tot een eindconcentratie van 2%Vervolgens centrifugeert u de buis en resuspendeert u de celpellet in 10 milliliter van het basale medium zoals eerder beschreven. Resuspensie na centrifugeren van de pellet in 80 tot 160 microliter koud keldermatrixmedium en plaats de buizen op ijs.Doseer vervolgens 40 microliter van de suspensie op elke put van een voorverwarmde 24-wells ophangcultuurplaat. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Laat de keldermatrix stollen en een druppel vormen.Voeg na incubatie 500 microliter menselijk longorganoïden expansiemedium aangevuld met vijf nanomolair heregulin-beta 1 toe aan elke put en incubeer de plaat in een celkweekincubator. Verwijder na drie dagen het oude medium terwijl u de druppel intact houdt en voeg voorzichtig vers medium toe. Na 10 tot 14 dagen passaging, observeer de organoïden onder een microscoop en zorg ervoor dat de organoïden niet zijn ingebed met een zeer hoge celdichtheid.Om de longorganoïden met afschuiving te passeren, breekt u de druppels door op en neer te pipetteren met een punt van één milliliter. Breng vervolgens de organoïden samen met het medium over naar een centrifugebuis van 15 milliliter en pas het volume aan op 10 milliliter met een koud basaal medium. Centrifugeer de buis op 300 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, gooi het supernatant weg en was de organoïden met 10 milliliter koud basaal medium.Resuspendeer vervolgens de organoïden in twee milliliter koud basaal medium en scheer in kleine stukjes met een Pasteur-pipet. Voeg vervolgens basaal medium toe aan een totaal volume van 10 milliliter en centrifugeer voordat de organoïde fragmenten worden geresuspendeerd met een koude keldermatrix die voldoende is om een expansie van 1: 3 tot 1: 5 mogelijk te maken en de buizen op ijs te plaatsen. Doseer 40 microliter organoïde suspensie in elke put van een voorverwarmde 24-well plaat om te incuberen bij 37 graden Celsius om de keldermatrix gedurende 10 tot 15 minuten te laten stollen.Voeg later 500 microliter longorganoïde expansiemedium toe aan elke put en incubeer in een celkweekincubator. Ververs het medium om de drie dagen en passeer de organoïden om de twee weken. Om longorganoïden met trypsinisatie te passeren, resuspendeerde geoogste longorganoïden in één milliliter dissociatie-enzym.Incubeer de organoïde in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten. Voeg vervolgens een milliliter basaal medium toe aan de buis en schuif de organoïden mechanisch door op en neer te pipetteren. Controleer de grootte van organoïde stukjes onder een microscoop bij 100X vergroting voordat u de spijsvertering beëindigt met 40 microliter foetaal runderserum.Vul het volume aan tot 10 milliliter met basaal medium en centrifugeer voordat u de organoïde stukken resuspendeert in een koude keldermatrix met een volume dat voldoende is om door te gaan met een verhouding van 1:5 tot 1:10. Geef later 40 microliter organoïde suspensie in elke put van een 24-well plaat en kweek de plaat zoals eerder gedemonstreerd. Om 3D-luchtwegorganoïden te genereren, incubeer de longorganoïden in het expansiemedium gedurende zeven tot 10 dagen na het passeren via mechanisch scheren.Vervang vervolgens het expansiemedium door proximaal differentiatiemedium en incubeer de organoïden in een celkweekincubator. Gooi na 14 dagen het medium in elke put weg en voeg cellysaatbuffer toe om de gedifferentieerde luchtwegorganoïde te oogsten voor RNA-extractie en detectie van cellulaire genexpressie door RT-qPCR-assay. Incubeer de inserts in de celkweekincubator met respectievelijk 250 en 500 microliter van het basale medium in de bovenste en onderste kamer van een 24-well plaat.Voeg vervolgens een milliliter basaal medium toe aan de buis en pipet op en neer om de organoïden in enkele cellen te scheren. Observeer de cellen onder een microscoop voordat u de spijsvertering beëindigt met 40 microliter foetaal runderserum. Filter de cellen door een zeef van 40 micron in een buis van 50 milliliter en breng de gefilterde celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter.Vul de suspensie aan met basaal medium tot een totaal volume van 10 milliliter. Na centrifugatie resuspender de pellet verzameld uit 24 druppels in 1 tot 2,5 milliliter long organoïde expansiemedium, afhankelijk van de celdichtheid. Tel het aantal cellen met de celteller onder een microscoop en pas vervolgens de celconcentratie aan op 1,3 keer 10 tot de zes per milliliter voor 24-well inserts.Verwijder het basale medium uit de bovenste en onderste kamers voordat u 500 microliter expansiemedium in de onderste kamer toevoegt. Zaad 100 microliter celsuspensie eerder bereid op de apicale kamer van de 24-well insert en incubeer. Vervang na twee dagen het expansiemedium door proximaal differentiatiemedium in zowel de apicale als de onderste kamer van de plaat.Incubeer de organoïden gedurende 14 dagen en ververs het medium om de drie dagen. Meet elke dag de transepitheel elektrische weerstand met behulp van een elektrisch weerstandsmeetsysteem. In de representatieve microfoto zijn de vers geïsoleerde longcellen te zien ingebed in de keldermembraanmatrix type twee met verminderde groeifactor.De cystische organoïden werden in de loop van de tijd verschenen en gekweekt. De longorganoïden na de vierde passage worden hier gedemonstreerd. Binnen twee uur na mechanisch scheren vormden de organoïde fragmenten ingebed in het keldermembraanextract de cystische domeinen.De microfoto van hetzelfde veld op dag vijf bevestigde de organoïde groei in de loop van de tijd. De uitdijende organoïden herbergden alle vier de belangrijkste luchtwegepitheelceltypen, waaronder ACCTUB-positieve of FOXJ1-positieve trilhaarcel, P63-positieve basale cel, CC10-positieve clubcel en MUC5AC-positieve bokaalcel in een premature toestand. De organoïden geïncubeerd in het expansie- en proximale differentiatiemedium ontwikkelden in de loop van de tijd een duidelijke morfologie.Na twee weken differentiatie in het proximale differentiatiemedium waren beweeglijke trilharen waarneembaar in elke organoïde. Er werd waargenomen dat de synchroon kloppende celia het celpuin in het organoïde lumen dreef en ze unidirectioneel wervelde om de ingeademde deeltjes te verwijderen. Verder toonde de flowcytometrie-analyse aan dat de gedifferentieerde organoïden plaats boden aan vier luchtwegepitheelceltypen in proximale differentiatie- en expansiemedium.Na twee weken differentiatie ontwikkelden 2D-luchtwegorganoïden een intacte epitheliale barrière. Een dextran-blokkadetest werd uitgevoerd om de integriteit van de epitheliale barrière gevormd in 2D-luchtwegorganoïden te beoordelen. De 2D-organoïden bevatten overvloedige trilhaarcellen.De langdurig uitbreidbare longorganoïde en de gedifferentieerde luchtwegorganoïde bieden een fysiologisch actief en universeel modelsysteem voor het bestuderen van respiratoire biologie en pathologie, inclusief COVID-19.

establishing-human-lung-organoids-proximal-differentiation-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol richt efficiënt muis embryonale stamcellen afgeleide definitieve endoderm aan de luchtwegen rijpen epitheelcellen. Deze differentiatie techniek maakt gebruik van 3-dimensionale cellen ontdane long scaffolds rechtstreekse long lijn specificatie, in een gedefinieerd serumvrij cultuurmedium setting.

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor weefseldissociatie en cellulaire fractioneringsbenaderingen die verrijking van levensvatbare epitheelcellen uit proximale en distale gebieden van de menselijke long mogelijk maken. Hierin worden deze benaderingen toegepast voor de functionele analyse van longepitheelvoorlopercellen door het gebruik van 3D organoïdencultuurmodellen.

Isolatie en verrijking van menselijke longepitheelvoorlopercellen voor organoïde cultuur

We beschrijven een eenvoudig protocol voor de ontwikkeling van mucociliarie epitheelorganoïden uit diepe ectoderm cellen geïsoleerd van Xenopus laevis embryo's. De multipotige voorlopers regenereren epitheel bekercelprecursoren en laten live tracking van de initiatie en progressie van de celovergangen op het oppervlak van organoïden toe.

Mucociliary Epithelial Organoids van Xenopus Embryonal Cells: Generatie, Cultuur en High-Resolution Live Imaging

Het artikel beschrijft stapsgewijze gerichte differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar driedimensionale hele longorganoïden die zowel proximale als distale epitheellongcellen bevatten, samen met mesenchym.

Generatie van 3D-organoïden voor de hele long uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het modelleren van longontwikkelingsbiologie en -ziekte

Het protocol beschrijft een beeldvormingsgerichte bioreactor die de selectieve verwijdering van het endogene epitheel uit de rattenluchtpijp en homogene verdeling van exogene cellen op het lumenoppervlak mogelijk maakt, gevolgd door langdurige in vitro kweek van het celweefselconstruct.

Imaging-guided bioreactor voor het genereren van bio-technisch luchtwegweefsel

Recente ontwikkelingen in door de mens geïnduceerde pluripotente stamceldifferentiatieprotocollen maken de stapsgewijze afleiding van orgaanspecifieke celtypen mogelijk. Hier geven we gedetailleerde stappen voor het onderhoud en de uitbreiding van iPSC-afgeleide luchtwegbasale cellen en hun differentiatie in een mucociliair epitheel in lucht-vloeistof interfaceculturen.

Generatie van luchtwegepitheelcel lucht-vloeistof interfaceculturen uit menselijke pluripotente stamcellen

Dit artikel beschrijft de generatie van een complex, meercellig luchtwegbarrièremodel dat bestaat uit geïnduceerd pluripotent stamcel (iPSC)-afgeleid longepitheel, mesenchym, endotheelcellen en macrofagen in een lucht-vloeistofinterfacecultuur.

iPSC-afgeleide cocultuur van epitheel, mesenchymale, endotheelcellen en immuuncellen om de integriteit van de luchtwegbarrière bij longgezondheid en ziekte te modelleren

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Membraan volwassen adipocyte aggregaat cultuur (MAAC) is een nieuwe methode om de cultuur volwassen menselijke adipocyten. Hier beschrijven we hoe adipocyten te isoleren van menselijke veten en hoe maac op te zetten.

Isolatie en cultuur van menselijke volwassen adipocyten met behulp van membraan volwassen adipocyte aggregaat culturen (MAAC)

De gehele 3D-structuur en cellulaire inhoud van organoïden, evenals hun fenotypische gelijkenis met het oorspronkelijke weefsel kan worden vastgelegd met behulp van de single-cell resolutie 3D imaging protocol hier beschreven. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organoïden variërend in oorsprong, grootte en vorm.

Single-Cell Resolutie driedimensionale beeldvorming van intacte organoïden

Leer hoe je menselijke longorganoïden opzet uit primair longweefsel en deze differentieert tot volwassen luchtwegorganoïden. Deze methode biedt een waardevol model voor onderzoek naar luchtwegbiologie en ziekten.

Het opzetten van menselijke longorganoïden en proximale differentiatie om volwassen luchtwegorganoïden te genereren

Meer video's verkennen