Methodologie om controlemiddelen en insecticiden te testen tegen de koffiebesboorder Hypothenemus hampei

Deze methode maakt gebruik van groene koffievruchten om de toxiciteit van insecticiden tegen de koffiebessenboorder te testen. De insecticidetoepassing wordt uitgevoerd voor of na de insectenplaag om de insectensterfte en andere effecten te bestuderen. Het gebruik van echte groene koffie met voedingsstoffen die geschikt zijn voor insectengroei is de meest geschikte manier om de toxiciteit van verbindingen voor insecten onder gesimuleerde natuurlijke omstandigheden te evalueren.

Het protocol maakt de evaluatie mogelijk van de toxische effecten van chemische insecticiden en op pathogenen zoals schimmels of afstotende stoffen. Deze infectie van de vruchten en de insecten is de kritieke stap, omdat onjuiste desinfectie insectensterfte als gevolg van besmetting kan veroorzaken. De kwaliteit van insecten is ook belangrijk omdat zwakke insecten de resultaten van een giftig product zullen overschatten.

Visuele demonstratie maakt identificatie mogelijk van het juiste stadium van de vruchten, het insectenplaagproces, het juiste moment om de giftige stof te verspreiden. En de manier om de vruchten te ontleden. De procedure wordt gedemonstreerd door Claudia Martinez, een onderzoeksassistent van het laboratorium.

Om te beginnen, verzamel de groene koffievruchten vroeg in de ochtend met de geschatte ontwikkelingsleeftijd van 120 tot 150 dagen na de bloei van koffieplantages. Selecteer ongeveer 300 uniform grote en gezonde vruchten en trek de steeltjes terug. Dompel de groene koffievruchten in een zeepoplossing van 2% en reinig grondig door ze te wrijven.

Spoel de vruchten vervolgens drie keer af met schoon water. Dompel ze onder in 0,5% natriumhypochlorietoplossing en plaats ze gedurende 10 minuten op de shaker met 110 omwentelingen per minuut. Spoel de vruchten drie keer af met schoon water en droog ze af met steriele papieren handdoekjes.

Bestraal de vruchten door ze gedurende 15 minuten op 55 centimeter van de UV-bron te plaatsen, in een horizontaal laminair stroomstation met UV-functionaliteit. Verplaats de vruchten na elke vijf minuten om de juiste doorstraling van de hele vrucht te garanderen. Om de bioassays op te zetten, dompelt u de koffiebessenboorders die op dezelfde dag tevoorschijn kwamen onder in 0,5% natriumhypochlorietoplossing en roert u ze langzaam met een borstel gedurende 10 minuten.

Filter deze insecten door een mousseline doek en was ze drie keer met steriel gedestilleerd water. Verwijder overtollig water met steriele papieren handdoeken. Bereid een groep van 30 groene koffievruchten per experimentele eenheid en plaats ze in een plastic doos.

Breng verschillende concentraties van een testproduct aan voor evaluatie met behulp van een draagbare spuiteenheid, hier werden 5% en 6% alkaloïde emulsies gebruikt. Besproei als controle een groep groene koffievruchten met water. Gebruik ten minste drie experimentele eenheden per behandeling, spuit de ene na de andere.

Laat in een steriele kap twee koffiebessenboordervolwassenen per groene koffievrucht los en bedek de dozen na 30 minuten. Laat de plastic dozen met de besmette groene koffievruchten in het donker in een kamer of incubator, met gecontroleerde omstandigheden. Tel na 1, 7, 15 en 21 dagen het aantal boorvruchten en levende en dode insecten buiten de vruchten in elke doos.

Ontleed 20 dagen na de besmetting elke groene koffievrucht onder een stereomicroscoop met 10x vergroting en tel het aantal gezonde zaden of zaden beschadigd door de insecten in elke vrucht. Tel de verschillende biologische stadia van koffiebessenboorder. Observeer het aantal dode insecten in elk zaad om de insectensterfte per experimentele eenheid te bepalen.

Laat in een steriele kap koffiebessenboorder volwassenen los aan de eerder gedesinfecteerde groene koffievruchten in een twee-op-één verhouding en laat de besmetting drie uur doorgaan bij 21 graden Celsius. De meeste groene koffievruchten moeten na drie uur worden besmet met de buik van de koffiebessenboorder nog steeds bloot. Selecteer 46 aangetaste vruchten en plaats ze in een 96-well plastic rek, zodat de behandeling direct op de koffiebessenboorder kan worden gespoten die het fruit perforeert.

Spuit drie rekken minstens drie keer voor behandeling, de ene na de andere en bedek de rekken na 30 minuten. Ontleed na 20 dagen de groene koffievruchten onder een stereomicroscoop met 10 x vergroting en tel het aantal gezonde zaden of zaden dat door de insecten in elke vrucht is beschadigd. Tel de verschillende biologische stadia van koffiebessenboorders en het aantal dode insecten in elk zaadje om de insectensterfte per experimentele eenheid te bepalen.

Volg de eerste stappen voor het evalueren van een product met een beschermend effect op de vruchten en laat de groene koffievruchten in de plastic dozen los. Tel vervolgens het aantal koffiebessenboorders dat wegvliegt van de dozen en het aantal dat de groene koffievruchten besmet. Na de incubatie, onder gecontroleerde omstandigheden, gevolgd door dissectie 20 dagen na besmetting en het tellen van de zaden en dode insecten, volgt u de beschreven stappen voor het evalueren van het product, na de plaag van de koffiebessenboorder.

Tel het aantal koffiebesboringen dat uit de groene koffievruchten kwam, of wegvloog van de vruchten. Volg na het spuiten van elke behandeling de stappen van incubatie onder gecontroleerde omstandigheden om de insectensterfte per experimentele eenheid te bepalen. 5% en 6% insecticide toegepast op de koffiebessenboorder, veroorzaakte een hoge insectensterfte op dag 20 en vertoonde significante verschillen in vergelijking met controle.

Er werd gezien dat de toepassing van insecticide twee resulteerde in 94% van gezonde zaden, en insecticide één resulteerde in 89% van gezonde zaden. 37% van de zaden was niet besmet in de controlegroep. In het geval van post-besmetting drongen de producten de insectenschubben binnen en veroorzaakten insectensterfte.

De hoogste sterfte deed zich voor met insecticide twee. De effecten van de insecticiden werden weerspiegeld in het percentage gezonde niet-geïnfecteerde zaden, op dag 20 van de evaluatie. Een verminderde insectenpopulatie werd gevonden in de koffiezaden in vergelijking met de insectenpopulatie in de controlegroep, besproeid met water.

Entomopathogene en afstotende gecombineerde werking resulteerde in minimale zaadschade en maximale insectensterfte. Deze infectie van de vruchten en desinfectie van de insecten zorgen voor het succes van het protocol. Deze methodologie kan ook worden gebruikt voor het evalueren van de tolerantie of weerstand van koffievruchten tegen de koffiebessenboorder.

Een negatief effect kan ook worden waargenomen tegen de insectenpopulatie in het geval van insectenresistente koffiezaden. Deze methodologie kan niet alleen worden gebruikt in de entomologie voor het evalueren van insecticide met verschillende werkingsmechanismen, maar ook in plantenveredeling voor de evaluatie van tolerante variëteiten en plantenpathologie om de interactie tussen fruit en pathogeen te bestuderen.