Karakterisering van Salmonella Typhimurium-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen

Sepsis is een ontregelde immuunrespons van de gastheer op microbiële invasie of weefselbeschadiging, wat leidt tot orgaanbeschadiging op een plaats die ver verwijderd is van die van infectie of schade. Het grote publiek is zich meer bewust geworden van deze aandoening, tijdens de COVID-19-pandemie. In 2017 waren er 48,9 miljoen sepsis-incidenten en 11 miljoen sterfgevallen wereldwijd, goed voor bijna 20% van alle wereldwijde sterfgevallen.

Zoals te verwachten is, zijn de meeste gevallen in ziekenhuizen. In feite bleek uit een studie dat bijna 62% van de positieve isolaten van patiënten op IC's met sepsis gramnegatieve organismen waren. Er zijn verschillende modellen, en enkele van de meest gebruikte muizenmodellen van sepsis omvatten LPS-geïnduceerde endotoxemie, het cecale ligatie- en punctiemodel en de monobacteriële infectiemodelsystemen.

In ons laboratorium hebben we een muismodelsysteem gestandaardiseerd om peritoneale sepsis te induceren met behulp van Salmonella Typhimurium. Dit model is voordelig ten opzichte van andere, omdat Salmonella Typhimurium een intracellulair pathogeen is dat de klinisch relevante toestand van gramnegatieve sepsis nabootst. De uitkomst van peritonitis sepsis in dit model, is systemisch met 100% mortaliteit, binnen 96 uur na infectie.

Daarom is dit model instrumenteel bij het bestuderen van de inflammatoire gastheerreacties. In dit model wordt sepsis geïnduceerd door intraperitoneaal injecteren van 0,5 miljoen CFU van Salmonella Typhimurium, in een 8-10 weken oude C57BL / 6 muis. Systemische infectie kan worden bevestigd, door het beoordelen van orgaan bacteriële belasting, ongeveer 16 uur na infectie.

De experimenten met Salmonella Typhimurium vereisen BSL-2-faciliteit en naleving van BSL-2-richtlijnen. Er moet voor worden gezorgd dat de juiste PBM's worden gebruikt en dat de veiligheid wordt gewaarborgd en dat de standaard BSL-2 biohazard-verwijderingsmethoden worden gevolgd. Alle experimenten zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierethiek.

Kweekvoorbereiding van Salmonella Typhimurium. Voeg honderd microliter Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glycerolbouillon toe aan 3 ml LB-bouillon. Incubeer de cultuur met 160 omwentelingen per minuut, bij 37 graden 's nachts.

Streep 50 microliter van de 's nachts gekweekte cultuur in LB-bouillon op een Salmonella Shigella-agarplaat en incubeer gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Kies een enkele kolonie uit de gestreepte SS-agarplaat met behulp van een microtip. Werp de microtip uit in 3 ml LB-bouillon en kweek 's nachts bij 160 RPM bij 37 graden Celsius.

Voeg 0,1 ml van de bacteriecultuur toe aan 50 ml LB-bouillon en incubeer bij 37 graden Celsius, in een schudderincubator met 160 RPM, gedurende drie tot vier uur, om de logaritmische groeifase te bereiken. Verdun de cultuur met een factor twee met behulp van LB-bouillon. Meet de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nanometer golflengte van licht in een spectrofotometer.

Zodra de OD er één bereikt, maak je twee aliquots van 1 ml cultuur, in 1,5 ml microfugebuizen. Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten op 7.750 G. Gooi dit supernatant weg en was de pellet tweemaal met 1 ml 1XPBS.

Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten op 7.750 G. Resuspend de pellet in 0,5 ml 1XPBS, in twee verschillende 1,5 ml microfugebuizen. Combineer de suspensies van beide buizen tot één buis van 1,5 ml, die nu ongeveer twee vermenigvuldigd met 10 bevat, verhoogd tot het vermogen van acht kolonievormende eenheden per ml.

Bereid een bacteriële celsuspensie van 10 vermogen zes kve / ml, door de stamoplossing te verdunnen. Belangrijke opmerking, optimaliseer de CFU die overeenkomt met OD in uw laboratorium, om de CFU voor OD één te bepalen, voordat u de experimenten start. Muizen en infecties.

Houd op de dag van infectie de muis met één hand vast, veeg de buikhuid af met 70% ethanol en spreid de achterpoten voor een betere toegankelijkheid van de buikwand. Injecteer 0,5 ml van 10 verhoogd tot het vermogen zes CFU / ml bacteriële suspensie intraperitoneaal, met behulp van een spuit van 1 ml. Na infectie, plaat de cultuur om de werkelijke geïnjecteerde CFU te controleren, die kan variëren van 0,2 tot 0,8 miljoen CFU per 0,5 ml.

CFU-beoordeling van organen. De muis werd opgeofferd met behulp van kooldioxide verstikking. Na het offeren van de geïnfecteerde muis, veeg de buik af met een stuk katoen, gedoopt in 70% ethanol.

Snijd de buikhuid open. Raadpleeg het artikel van Ray en Dittle, voor een videoprotocol, over het verzamelen van peritoneale lavagevloeistof. Snijd de peritoneale holte open en verzamel het interessante orgaan.

In deze video demonstreren we de opsomming van orgaan-kve uit de lever. De lever ondergaat uitgebreide histopathologische schade, in dit model van sepsis. Snijd een klein stukje lever en plaats het in een microfuge buisje.

Dit kan twee tot drie uur in ijs worden bewaard, voordat u doorgaat naar de volgende stap. Weeg het stuk en breng het over in een microfugebuis. Snijd bij voorkeur de stukken met een gewicht van ongeveer 10 tot 15 mg, voor een goede homogenisatie.

Voeg 0,5 ml 1XPBS toe in de buis en homogeniseer de organen met behulp van een handhomogenisator. Zorg ervoor dat de organen volledig gehomogeniseerd zijn. Maak het volume aan tot 1 ml door 0,5 ml 1XPBS toe te voegen.

Centrifugeer de buisjes gedurende vijf minuten bij 200 G, bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant in verse microfugebuizen. Bereid verdunningen van 10 tot de macht minus één en 10 tot de macht minus twee, in een 96 putplaat.

Verdeel 50 microliter van het verdunningsmiddel op verse RVS-agarplaten en incubeer de platen gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Tel het aantal kolonies dat in elke toestand verschijnt en normaliseer de gegevens met het orgaangewicht met behulp van de volgende formule. Kve/mg is gelijk aan het aantal kolonies, vermenigvuldigd met 20, vermenigvuldigd met de verdunningsfactor, het geheel gedeeld door orgaangewicht in mg.

Let op, het getal 20 wordt gebruikt in de formule, om de kolonies per plaat om te zetten in CFU / ml. Dit getal wordt bereikt door 1 ml te delen van de hoeveelheid van een bepaald volume cultuur. In dit geval 50 microliter.

Als u bijvoorbeeld honderd kolonies in een SS-agarplaat vindt, waar 50 microliter van 10 vermogen minus één verdunning van gehomogeniseerd orgaan, met een gewicht van 10 mg wordt verspreid, dan is CFU / mg gelijk aan 100 vermenigvuldigd met 20, vermenigvuldigd met 10, het geheel gedeeld door 10, wat gelijk is aan 2000 CFU / mg. Flowcytometrische analyse van verschillende immuuncelpopulaties in peritoneaal exsudaat. Verzamel de peritoneale cellen zoals eerder beschreven, door Ray en Dittle.

Resuspend de celkorrel uit peritoneale lavagevloeistof, in 1 ml RPMI aangevuld met 10% FBS. Som de totale celaantallen in de peritoneale lavage op met behulp van een hemocytometer. Pas het celgetal zo aan, dat elke buis twee tot vijf vermenigvuldigd met 10 krijgt, verhoogd tot de kracht van vijf cellen.

Draai de cellen gedurende 10 minuten bij 200 G bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg. Was de cellen eenmaal met 1XPBS.

Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 200 G. Blokkeer de Fc-receptoren met behulp van FcR-blokker. Een daarvan is tot 400 verdunning, bereid in blokkerende buffer, bestaande uit 5% FBS en 0,02% natriumazide in PBS.

Incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 200 G. Gooi het supernatant weg.

Verdun de fluorochroom geconjugeerde antilichamen die van belang zijn voor het blokkeren van de buffer. Hier gebruiken we een is tot 500 verdunning van anti-muis Ly6G, om neutrofielen te kleuren. Let op, andere immuuncelpopulaties kunnen ook worden getoond, met behulp van anti-muis B220 voor B-cellen, anti-muis CD3 voor T-cellen, anti-muis F4/80 voor macrofagen, enzovoort.

Incubateer ongeveer 0,2 miljoen cellen in 200 microliter verdunde oplossingen van antilichamen, in afzonderlijke buizen. Zet als negatieve controle één buis opzij in elk fluorochroom type, voor niet-gekleurde controle. In deze buis incubeer je de cellen met 200 microliter blokkerende buffer zonder antilichaam.

Incubeer de monsters gedurende 45 minuten op ijs, met intermitterend tikken om de 15 minuten. Centrifugeer de cellen bij 200 G gedurende 10 minuten, bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg.

Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, indien nodig om meerdere dagen te bewaren. Resuspend de cellen in 200 microliter FACS-kleurbuffer, 2% FBS in PBS. Verkrijg de gegevens in de flowcytometer.

De afbeeldingen van SS-agarplaten die hier worden getoond, geven de orgaan-CFU-belasting in lever en milt van septische muizen aan. Het gehomogeniseerde orgaan Lys6 werd verspreid bij verdunning van 10 tot het vermogen minus één, en geïncubeerd bij 37 graden celsius. De zwart gepigmenteerde S.Typhimurium kolonies verschenen na ongeveer 12 uur na de incubatie.

Een deel van de plaat wordt hier weergegeven als ingezoomde inzet om de kolonies te markeren. Deze resultaten suggereren dat de ziekteverwekker met succes systemisch verspreidde en de interne organen koloniseerde. Deze figuur toont de sera geïsoleerd uit gezonde en septische muizen.

Het volume van verzamelbaar bloed van septische muizen is minder dan gezonde controles, dus het verkregen serum is minder. Dit gebeurt vanwege verhoogde coagulatie bij sepsis. Ook de sera van septische muizen vertonen een duidelijke rode kleuring, wat wijst op het optreden van uitgebreide hemolyse.

De figuur toont cytometrische plots van peritoneale cellen van gezonde en septische muizen, gekleurd met anti-Ly6G-antilichaam. Deze beelden zijn representatief voor één gezonde en twee geïnfecteerde muizen. Septische muizen zagen een verhoogde infiltratie van neutrofielen in de peritoneale holte.

In deze video hebben we een methode getoond voor het induceren van bacteriële sepsis bij muizen, door intraperitoneale injectie van Salmonella Typhimurium. Dit is een nuttig model om de effecten van therapeutische interventies bij het verzachten van sepsis te bestuderen. In dit modelsysteem verandert de cellulaire samenstelling van de peritoneale holte dramatisch om de ziekteverwekker te bestrijden.

Daarom is het een nuttig model bij het bestuderen van de kinetische veranderingen in immuuncelsamenstellingen en -functies tijdens sepsis. Het model is ook nuttig bij het begrijpen van de toename van intercellulaire reactieve zuurstofsoorten, pro-inflammatoire cytokineniveaus, hemolyse en bloedstolling, die allemaal plaatsvinden tijdens sepsis.