CRISPR Gene Editing Tool voor MicroRNA Cluster Network Analyse

Dit protocol maakt gebruik van een crispr-genbewerkingsworkflow met hoge doorvoer om micro-RNA-genen georganiseerd en geclusterd te ontleden. En om te bepalen hoe deze niet-coderende RNA-netwerken de progressieroutes van kanker coördineren. Deze CRISPR-genbewerkingsprocedure stelt de onderzoeker in staat om snel een heel panel van cellijnen te genereren met unieke micro-RNA-clusterdeletiecombinaties, terwijl tijdrovende DNA-vectorsubklonen wordt vermeden.

Deze methode zal een duidelijker inzicht geven in hoe geclusterde micro-RNA's samenwerken om tumorgroei, agressiviteit en medicijnresistentie te reguleren voordat micro-RNA's in de kliniek worden vertaald als therapeutische en diagnostische hulpmiddelen. De procedure wordt gedemonstreerd door Grace Yi, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium. Maak om te beginnen een DNA-bestand met de volledige genomische sequentie van het micro-RNA-clustergebied van belang in ten minste één kilobytes van de omliggende genomische regio's met behulp van een DNA-sequentie-annotatiesoftwareprogramma.

Ontwerp vervolgens vier unieke CRISPR-RNA's voor elke beoogde micro-RNA-locus. Twee ontworpen CRISPR-RNA's om zich onmiddellijk te richten op complementaire DNA-sequenties vijf prime van de micro-RNA-haarspeldcluster en twee ontworpen CRISPR-RNA's om complementaire DNA-sequenties onmiddellijk drie prime van de micro-RNA-haarspeldcluster te targeten. Gebruik een functiebewerkingstool in het gemaakte DNA-bestand om de DNA-doelsequentie te markeren voor elk ontworpen CRISPR-RNA dat moet worden gesynthetiseerd.

Ontworpen en gesynthetiseerde PCR-primers die de beoogde micro-RNA-clustergebieden flankeren voor genotypering van CRISPR-cellijnen. Voer een doxycyclineconcentratiecurve uit op nieuw gegenereerde lenti-induceerbare Cas9-cellijnen om de optimale omstandigheden voor Cas9-eiwitinductie te bepalen. Plaat vijf keer 10 van de vierde cellen per put van elke zes putplaat en groeit bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, in het gewenste medium gedurende 24 uur.

Verdun dox in het gewenste medium met een uiteindelijke doxconcentratiecurve variërend van 0 5100, 150, 250 tot 500 nanogram per milli liter. Label de putten van elke zittende zes putplaat van één tot zes. Verwijder het medium en vervang door de juiste doxconcentraties.

Kweekplaten één tot vier tot 24 uur, 48 uur en 72 uur dox-inductie en 120 uur na dox-terugtrekking. Oogst de putten van de plaat op elk tijdstip. Verwerk de celpellets en ripabuffer voor lysaatisolatie.

Voer western blot-analyse uit met 40 microgram eiwit om Cas9-eiwitinductie te meten en de optimale Cas9-concentratie te bepalen. Breng op papier de vijf priem- en drie prime CRISPR-RNA-paarcombinaties in kaart die in elke put van een 24-putplaat worden getransecteerd die gericht is op het hele micro-RNA-cluster, verschillende geclusterde micro-RNA-gencombinaties en individuele micro-RNA-clusterleden. Plaat de lenti induceerbare gegoten negen cellijn op vijf maal 10 tot de vierde cellen per put van een 24 putplaat in het voorkeursmedium met de geoptimaliseerde doxconcentratie.

Laat de cellen 24 tot 48 uur groeien bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide om Cas9-eiwitexpressie te induceren. Transfecteer de lenti induceerbare Cas9-cellen met een voorbereide vijf priem- en drie priemgeleidings-RNA's. Label vier microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter per beoogde micro-RNA-locus.

Meng in elke buis één op één molaire verhouding van tracer-RNA en unieke CRISPR-RNA's samen om het twee micromolaire gids-RNA-complex te vormen. Voeg 2,5 microliter tracer-RNA, 1,25 microliter van de vijf primair gepositioneerde CRISPR-RNA, 1,25 microliter van de drie prime gepositioneerde CRISPR-RNA en vijf microliter 10 millilar tris hcl pH 7,5 buffer toe aan een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Microcentrifuge gedurende 30 seconden op 16.000 maal G om te mengen.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Aan elke buis bij 40 microliter gereduceerd serummedium tot de 10 microliter gids-RNA-complexreactie. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren.

Meng in een schone centrifugebuis van 1,5 milliliter twee microliter van het transfectieregens en 48 microliter gereduceerd serummedium voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Voeg aan elke buis die de 50 microliter geleidings-RNA-mix bevat, de 50 microliter van het verdunde transfectiereagens toe.

Pipetteer het mengsel langzaam op en neer om te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Voeg 400 microliter antibioticumvrij medium aangevuld met doxycycline toe aan elke buis die de 100 microliter van de gids-RNA-transfectiemix bevat.

Pipetteer voorzichtig om te mengen. Verwijder het medium uit de door doxycycline geïnduceerde lenti induceerbare Cas9-cellen. Voeg 500 microliter media-doxycycline geleidings-RNA-transformatiemix toe op basis van de experimentele kaart met 24 putplaten.

Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Vervang het medium door het vers bereide medium zonder doxycycline. Laat de cellen nog 24 tot 48 uur herstellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Oogst de getransfecteerde cellen en bereid je voor op genotypering en eencellige wanen. Scheid de 150 microliter geresuspendeerde cellen in drie delen. Vries een derde van de getransfecteerde cellen in medium plus 10% DMSO in cryoflacons voor langdurige opslag.

Breng een derde van de getransfecteerde cellen over in een schone PCR-buis van 0,2 milliliter voor genotypering. Bereid het laatste derde deel van de getransfecteerde cellen voor op tellen en verdunning in een plaatformaat van 96 putten om eencellige kolonies te genereren. Gebruik een 12-kanaals multipipeter en een steriel reagensreservoir en voeg voor elke verdunning 100 microliter verdunde cellen per put toe aan twee rijen van de plaat.

Laat de cellen vier tot zes weken groeien tot cofluency voor eencellige kolonie-uitbreiding. Verzamel ongeveer 10 tot 15 eencellige kolonies voor genotypering. Identificeer ten minste drie onafhankelijke knock-out eencellige kolonielijnen voor elke beoogde micro-RNA-locus.

Behoud wildtypelijnen met één cel als besturingselementen. Resuspend was de celpellet in vier microliter van vijf X DNA-polymerasebuffer, één microliter proteïnase K, één microliter RNase A en nucleasevrij water tot een totaal volume van 20 microliter. Luizen de cellen in de thermo cycler bij 56 graden Celsius gedurende 30 minuten en 96 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Bewaar de cellysaten bij min 20 graden Celsius totdat ze klaar zijn voor PCR-genotypering. Voer een PCR-genotyperingsreactie uit met behulp van de ontworpen PCR-primers die de geleide-RNA vijf prime- en drie prime guide-RNA-doellocaties flankeren. Voer de PCR-reactie uit in een thermocycler met behulp van het programma dat in het tekstmanuscript wordt vermeld.

Laad de PCR-producten op een 1% agarose-gel voor elektroforeseanalyse. Extraheer DNA uit de geïsoleerde PCR-fragmenten van de voorspelde moleculaire grootte voor de knock-out genotypen. Bereid de monsters voor op DNA-sequencing.

Valideer dat de CRISPR-reactie succesvol was en voer DNA-sequencing uit van de geïsoleerde PCR-fragmenten om de Cas9-splitsingsplaats te identificeren en de micro-RNA-locusdeletie te bevestigen. Er werden unieke CRISPR RNA's ontworpen die gericht waren op de gehele 35 kilo zware basen miR-888 clusterregio. Kleinere clustercombinaties binnen de miR-743-familie of de miR-891-familie en micro-RNA-deleties.

Gel-elektroforeseanalyse van de PCR-reacties gaf aan dat de voorspelde DNA-fragmentgrootte die het knock-outgenotype vertegenwoordigt, werd versterkt voor elke CRISPR-transfectie. Eencellige kolonies werden gegenotypeerd door PCR in volgorde geverifieerd. DNA-sequencing van deze geïsoleerde knock-out PCR-fragmenten bevestigde dat de getransfecteerde vijf priem- en drie prime guide RNA's Cas9-splitsingsligatie ongeveer drie nucleotide stroomopwaarts van de PAM-sites stuurden en genomisch verlies van de beoogde micro-RNA-locus valideerden.

WST-1 proliferatietests die miR-891a knock-out en wild type cellen vergelijken, bevestigen dat overexpressie van micro-RNA nabootsing lentivirale vector prostaatcelgroei induceert en daarom werd voorspeld dat miR-891 een verlies zou vertonen wederkerige effecten. Naast een zorgvuldig gids-RNA-ontwerp is het belangrijk om snel enkelvoudige celkolonies te genereren via elke micro-RNA knock-outlijn. Het is vooral relevant als de micro-RNA knock-outcellen de groei van de levensvatbaarheid hebben verminderd en gemakkelijk zouden worden weggeconcurreerd in gemengde populaties met wildtype cellen.

Aanvullende methoden zoals kwantitatieve realtime PCR, northern blot en RNA-sequencing moeten worden uitgevoerd om te bevestigen dat de CRISPR knock-out cellijnen geen volwassen micro-RNA tot expressie brengen voor de verwijderde locus.